Иммуномодулирующая активность антимикробных пептидов индолицидина и его структурных аналогов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская Иммунология 2009, Т. 11, № 1, стр. 101-104 © 2009, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИНДОЛИЦИДИНА И ЕГО СТРУКТУРНЫХ АНАЛОГОВ

Артамонов А.Ю., Шанин С.Н., Орлов Д.С.,

Шамова О.В., Колодкин Н.И.1, Рыбакина Е.Г.

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург

Резюме. Проведено исследование иммуномодулирующей активности нативного антимикробного пептида индолицидина и его синтетических структурных аналогов (индолицидинв1 7, 8, 20, 21, 22) с пространственнвш разобщением гидрофобных и гидрофильных участков молекул и различнвш зарядом. Установлено, что индолицидинв1 7 и 22 в концентрациях соответственно 0,6 мкМ и 5 мкМ подавляют цитотоксическую активноств натуральных киллерных клеток селезенки в отношении опухолевых клеток К-562, а индолицидины 8, 20 и 21 в концентрациях 1,3 мкМ, 2,5 мкМ и 1,3 мкМ, соответственно не изменяют ее. Впервые показано, что нативный индолицидин и его структурные аналоги индолицидины 8 и 20 не вызывают усиления пролиферативной активности спленоцитов, в то время как индолицидины 7 и 22 оказывают прямое митогенное действие на клетки. В работе продемонстрировано ингибирующее действие всех исследованных пептидов на реакцию бласттрансфор-мации спленоцитов при их стимуляции конканавалином А. Индолицидин и его структурные аналоги также подавлют комитогенное действие цитокина интерлейкина-1 на пролиферацию спленоцитов. Полученные результаты позволяют заключить, что модификация структуры природного индолицидина приводит к появлению новой иммуномодулирующей активности пептидов, а способы модификации указывают на возможные пути направленного изменения их биологических свойств.

Ключевые слова: антимикробные пептиды, индолицидин, структурные аналоги, иммуномодулирующая активность.

Artamonov A. Yu., Shanin S.N., Orlov D.S., Shamova O.V., Kolodkin N.I., Rybakina E.G. IMMUNOMODULATORY ACTIVITY OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE INDOLICIDIN AND ITS STRUCTURAL ANALOGUES

Abstract. Immunomodulatory activity of a native antimicrobial peptide indolicidin and its synthetic structural analogues (indolicidin 7, 8,20,21,22), with spatial uncoupling of hydrophobic and hydrophilic parts of the molecule and different net charges was under investigation. It was revealed that indolicidin 7 and 22 at concentrations of, respectively, 0.6 uM and 5 uM suppressed cytotoxic activity of natural killer spleen cells against tumor cells (K-562 line), while indolicidins 8,20 and 21 at the concentrations of 1.3 uM, 2.5 uM and 5 uM respectively, did not influence it. It was shown for the first time, that native indolicidin and its structural analogues indolicidin 8 and 20 did not increase activity of cell division, whereas indolicidin 7 and 22 had a direct mitogenic activity on spleen cells. The investigated peptides showed inhibitory effect upon mitogenic transformation of splenocytes induced by Con A. In addition, indolicidin and its structural analogues suppressed co-mitogenic activity of Interleikin-1 towards

splenocytes. The results obtained allow of a conclusion that the structural changes of indolicidin molecule lead to emergence of novel immunomodulatory activities of the peptides, whereas the methods of structural modifications demonstrate potential approaches to directed design of molecules with optimal biological properties. (Med. Immunol., vol. 11, N l,pp 101-104)

Адрес для переписки:

Артамонов Александр Юрьевич,

ГУНИИЭМ РАМН

197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12. Тел.: (812) 313-02-03, 234-15-83.

Факс: (812) 313-02-03, 234-94-93.

E-mail: auartamonov@bk.ru

101

Артамонов А.Ю., Шанин С.Н., Орлов Д.С. и др.

Медицинская Иммунология

Антимикробные катионные пептиды из ней-трофильных гранулоцитов, в том числе индоли-цидин (Ind), играют ключевую ролв в механизмах врожденного иммунитета [1, 4, 6]. Индолицидин токсичен для эритроцитов [2] и лимфоцитов [7]. При синтезе и изучении свойств структурнвк аналогов Ind [3] основное внимание уделяется снижению его токсического действия на клетки живого организма, а также усилению анти-микробнв1х, противогрибковвк и противовирус-hbix свойств и увеличению устойчивости молекул пептидов к действию протеаз. Иммуномодулирующие свойства нативного индолицидина и его структурнвк аналогов до настоящего времени остаются малоизученнвши.

Целвю работв1 явилосв исследование иммуномодулирующей активности Ind и его структурнвк аналогов, а именно влияния этих пептидов на цитотоксическую и пролиферативную актив-ноств спленоцитов.

Спленоцитв1 ввщеляли из селезенок крвю Wistar массой 200-220 г. В качестве мишеней для натуралвнвк киллернвк клеток (NK-клеток) селезенки исполвзовали клетки эритромиелейкоза человека К-562 (ГУ «Институт цитологии РАН», Россия). В работе исполвзованв1 пептидв1 индолицидин (Ind; ILPWKWPWWPWRR) и его структурнвю аналоги: Ind 7 (ILPWKKPWKP-WRR), Ind 8 (IKPWKWPWKPWRR), Ind 20 (IKPWKWPWKPWAR), Ind 21 (KKPWKWPKKP-WRR), Ind 22 (IKKWKKPWKKWRR), получен-HBie методом твердофазного синтеза. Пептидв1 вносили в инкубационную среду в конечной концентрации, равной удвоенной минималвной

ингибирующей концентрации (МИК) в отношении Е. coli, штамм ML-35p. Цитотоксическое действие пептидов непосредственно на клетки К-562 изучали с помощвю метода МТТ [8].

Для оценки цитотоксической активности NK-клеток, суспензии клеток-эффекторов (2,5 х 106кл/мл)иклеток-мишеней (1,0х 105кл/мл), мечешлх ЗН-уридином (В/О «Изотоп», Россия), инкубировали с пептидами в течение 20 ч при 37 °С, 5% С02 и 100% влажности. Цитотоксическую активноств клеток рассчитвшали по формуле: цитотоксичноств (%) = (1 — с.р.м. в тестячейке / с.р.м. в контроле) х 100 %.

В реакции бласттрансформации спленоцитов (РБТС) суспензию клеток (5 х 106 кл/мл) инкубировали с 0,75 мкг/мл конканавалина A (Con А, Sigma) и/или с рекомбинантнвш интерлейкином-ip (IL-ip, Sigma) со специфической активноствю 1,0 х 107 ед./мг белка в дозе 250 нг/мл и с пептидами в течение 72 ч при 37 °С, 5% С02 и 100% влажности. Интенсивноств РБТС оценивали по уровню ЗН-тимидина (РНЦ «Прикладная химия», Россия), включенного в ДНК делящихся клеток.

Статистическая обработка резулвтатов проведена по t-критерию Ствюдента в программном пакете Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США).

Изученнвю пептидв1 не оказвшали непосредственного цитотоксического действия на опу-холеввю клетки К-562 (IC50 составляла более 100 мкМ), кроме Ind, для которого IC50 не пре-ввппала 40 мкМ.

В исследовании влияния пептидов на цитотоксическую активноств спленоцитов оптималвное соотношение эффектор:мишенв составляло 25:1.

70

Без Ind 7 Ind 8 Ind 20 Ind 21 Ind 22

пептида (0,6 мкМ) (1,3 мкМ) (2,5 мкМ) (1,3 мкМ) (5,0 мкМ)

102

2009, Т. 11, № 1

Иммунная система, индолицидин

60

50

Ь 40 7<

Ё

о.

о 30 20 10 0

Без Ind

пептида (0,6 мкМ)

□ Без стимуляции

Ind 7 Ind 8

(0,6 мкМ) (1,3 мкМ)

□ После стимуляции Con А

Ind 20 Ind 21 Ind 22

(2,5 мкМ) (1,3 мкМ) (5,0 мкМ)

■ После стимуляции Con A и IL-1P

Пептиды Ind 7 (МИК =0,3 мкМ) в концентрации 0,6 мкМ и Ind 22 (МИК = 2,5 мкМ) в концентрации 5 мкМ подавляли специфическую активноств спленоцитов в отношении опухолевых клеток К-562, a Ind 8 (МИК = 0,6 мкМ), Ind 20 (МИК = 1,3 мкМ) и Ind 21 (МИК = 0,6 мкМ) в концентрациях 1,3 мкМ, 2,5 мкМ и 1,3 мкМ, соответственно, не изменяли ее (рис. 1).

При сопоставлении физико-химических характеристик молекул пептидов и их влияния на специфическую активноств спленоцитов установлено, что изменение заряда пептидов Ind 7 (+7), Ind 8 (+6), Ind 20 (+5), Ind 21 (+8), Ind 22 (+9) по сравнению с природнвш Ind (+4) не влияло на цитотоксичноств NK-клеток селезенки.

Нативнвш пептид Ind (МИК = 0,3 мкМ) и его структурнвю аналоги Ind 8, Ind 20 при внесении в инкубационную среду не ввювшали усиления пролиферативной активности спленоцитов (рис. 2), в то время как Ind 7 и Ind 22 оказвшали митогенное действие на клетки. Однако при стимуляции клеток Сои А в субоптималвной дозе все пептидв1 ингибировали РБТС. Индолицидин и его структурнвю аналоги также подавляли ко-митогенное действие цитокина IL-ip на пролиферацию спленоцитов.

Увеличение заряда аналогов Ind по сравнению с зарядом нативного пептида, а также пространственное разобщение гидрофобных и гидрофилв-

hbix участков молекул приводило к усилению их ингибирующего действия на РБТС, стимулированную Сои А, а также Сои А в сочетании с IL-ip.

Таким образом, сравнителвное исследование эффектов действия антимикробного пептида Ind и его синтетических структурных аналогов показало, что эти пептидв1 обладают также и иммуномодулирующей активноствю. В то время, как сам Ind и его структурнвю аналоги подавляют пролиферативную активноств спленоцитов, ввюванную Сои А и IL-ip, Ind 7 и Ind 22 оказвтают прямое митогенное действие на пролиферацию клеток. Возможно, что эффект диссоциации биологических свойств пептидов в резулвтате модификации их структурв1 и появление у них активности, направленной на подавление интенсивности РБТС, индуцированной действием Сои А и IL-ip, в какой-то мере обусловленв1 наиболвшей уяз-вимоствю мембран клеток спленоцитов в период их деления [5]. Необходимо отметитв, что именно Ind 7 и Ind 22, в структуре которвк триптофан в шестом положении заменен на лизин, оказвша-ют подавляющее действие и на цитотоксическую активноств спленоцитов.

Резулвтатв1 исследования позволяют заклю-читв, что модификация структурв1 природного индолицидина приводит к появлению новой иммуномодулирующей активности пептидов, а способв! модификации указвшают на возмож-

103

Артамонов А.Ю., Шанин С.Н., Орлов Д.С. и др.

Медицинская Иммунология

ные пути направленного изменения их биологических свойств.

Работа поддержана грантом РФФИ № 07-0401759.

1. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете. — СПб.: Наука, 2006. — 261 с.

2. Ahmad I., Perkins WR., Lupan D.M., Selsted M.E., Janoff A.S. Liposomal entrapment of the neutrophil-derived peptide indolicidin endows it with in vivo antifungal activity // Biochim. Biophys. Acta. - 1995. -Vol. 1237. - P. 109-114.

3. Carol L. Friedrich, Rozek A., Patrzykat A., Hancock R.E.W Structure and Mechanism of Action of an Indolicidin Peptide Derivative with Improved Activity against Gram-positive Bacteria // J. Biol. Chem., 2001. - Vol. 276, N 26. - P. 24015-24022.

4. Frank R.W., Gennaro R., Schneider K. et al. Amino acid sequences of two praline — rich bactenecins // J. Biol. Chem. — 1990. — ЛЫ. 256, N31.-P. 18871-18874.

5. Friedrich C., Scott M.G., Korunarotne N., Yan H., Hancock R.E. W Salt-Resistant Alpha-Helical Cationic Antimicrobial Peptides // Antimicrobial Agents Chemother. — 1999. — ЛЫ. 43, N 7. - P. 1542-1548.

6. Kokryakov V.N., Harwing S.S., Panyutich E.A. et al. Protegrins: Leukocyte antimicrobial peptides combine features of corticostatic defensins and tachyplesins // FEBS Lett. - 1993. - Vol. 327, N 2. -P 231-236.

7. Schluesner, H. J., Radermacher S., Melms A., Jung S. Leukocytic antimicrobial peptides kill autoimmune T-cells // J. Neuroimmunol. — 1993. — Vol. 47. - P. 199-202.

8. Wan H., Williams R., Doherty P., Williams D.F. A study of the reproducibility of the MTT test // Journal of Materials Science: Materials in Medicine Springer Netherlands. — ЛЫ. 5, N 3. — 1994. — P. 154-159.

поступила в редакцию 06.10.2008 отправлена на доработку 09.11.2008 принята к печати 12.01.2009

104