CC BY
33
УДК 616-022.71
И.А. Шурыгина, Л.В. Воропаев
ВЛИЯНИЕ ШТАММОВ Y. PSEUDOTUBERCULOSIS, ЛПС И СУПЕРАНТИГЕНА YPMA Y. PSEUDOTUBERCULOSIS НА ПРОДУКЦИЮ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ИММУНОЦИТОКИНОВ КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ДОНОРОВ *
Институт эпидемиологии и микробиологии ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск)
В работе изучено влияние штаммов Y. pseudotuberculosis с различным плазмидным спектром, а также липополисахарида и суперантигена Y. pseudotuberculosis на продукцию провоспалительных им-муноцитокинов. Доказано, что максимальным, стимулирующим, эффектом, из исследуемых субстанций обладает, суперантиген Y. pseudotuberculosis, вторым, по активности, является, липополисаха-рид. Штамм Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) обладает, наименьшим, стимулирующим, эффектом.. Ключевые слова: псевдотуберкулез, суперантиген, плазмида, цитокин
INFLUENCE OF Y. PSEUDOTUBERCULOSIS, LPS AND SUPER-ANTIGEN YPMA OF Y. PSEUDOTUBERCULOSIS ON PRODUCTION OF PROINFLAMMATORY IMMUNOCYTOKINES BY BLOOD CELLS CULTURE OF DONORS
I.A. Shurygina, A.V. Voropayev
Institute of Epidemiology and Microbiology SC ME ESSC SB RAMS, Irkutsk
We investigated, the influence of Y. pseudotuberculosis, LPS and superantigen YPMa of Y. pseudotuberculosis on production proinflammatory immunocytokines by blood, cells culture of donors. The maximum, effects has super-antigen YPMa, in second place — LPS of Y. pseudotuberculosis. Stain Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) has minimum, stimulatory effects.
Key words: pseudotuberculosis, super-antigen, plasmid, cytokine
Течение инфекционного процесса, степень тяжести и многообразие клинической симптоматики в значительной мере обусловлены иммуногеннос-тью возбудителя. Клиническая картина и особенности течения инфекционных заболеваний напрямую зависят от уровней продукции про- и противовоспалительных цитокинов и их влияния на иммуноре-гуляторные и эффекторные иммунные механизмы. В настоящее время доказана ведущая роль провоспалительных цитокинов и баланса их с антагонистами в выраженности и направленности системной воспалительной реакции [1, 2]. В то же время в литературе имеется мало информации о динамике цито-кинопродукции при псевдотуберкулезе.
ЦЕЛЬ
Исследовать влияние штаммов Y. pseudotuberculosis и различных факторов патогенности возбудителя на синтез иммуноцитокинов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использованы следующие штаммы:
• штамм Y. pseudotuberculosis № 890, содержащий плазмиду pYV 47 MDa;
• штамм Y. pseudotuberculosis № 8, содержащий плазмиды 82:47 MDa;
• штамм Y. pseudotuberculosis № 890-Д, не содержащий плазмид;
• штамм Y. enterocolitica № 15, содержащий плазмиду pYV 47 MDa.
Для оценки влияния различных факторов патогенности Y. pseudotuberculosis на продукцию им-муноцитокинов мы исследовали уровни IL-1, IL-6, TNF-a и IFN-a в культуре клеток цельной крови доноров (контроль) и под действием ЛПС Y. pseudotuberculosis, супернатанта, содержащего суперантиген YPMa Y. pseudotuberculosis, живых штаммов иерсиний: Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), Y. pseudotuberculosis (47 MDa), бесплазмид-ного штамма Y. pseudotuberculosis (pYV-) и Y. enterocolitica (47 MDa). Уровень выработки исследуемых цитокинов определяли методом ИФА в супернатанте культуры клеток цельной крови доноров после суточной инкубации совместно с исследуемыми субстанциями.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В первой серии опытов мы подобрали концентрацию суперантигена YPMa, которая вызывала бы наибольшую выработку IFN-a (табл. 1).
Поскольку только концентрация, эквивалентная дозе Y. pseudotuberculosis 106 м.к./мл, вызывала достоверное изменение продукции IFN-a культурой клеток цельной крови доноров по сравнению с контролем, в дальнейшем мы использовали именно эту концентрацию суперантигена YPMa.
* Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МД-1359.2006.7.
Во второй серии опытов мы определили концентрацию Y. pseudo-tuberculosis (82:47 MDa), которая вызывала бы максимальное изменение уровней продукции IL-1, IL-6 и TNF-a (табл. 2).
Как видно из таблицы 2, Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) в концентрации 106 м.к./мл достоверно больше стимулирует выработку исследуемых цито-кинов по сравнению с контролем. В то время как под влиянием Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) в дозе 103 м.к./мл уровень продукции цитокинов достоверно не менялся. В дальнейшем мы использовали для всех штаммов дозу возбудителя, равную 106 м.к./мл.
Таким образом, подобранные для эксперимента дозы суперантигена YPMa и Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) оказались идентичными.
В предварительных исследованиях мы показали, что ЛПС в концентрации 5—10 мкг/мл значимо влияет на активность фагоцитоза культуры моно-нуклеарных фагоцитов селезенки крыс, тогда как при дозе ЛПС 2.5 мкг/мл достоверных отличий по сравнению с контролем не зарегистрировано. В дозе 20 — 30 мкг/мл ЛПС угнетает фагоцитоз (поглощение и респираторный взрыв) мононуклеарных фагоцитов. Поскольку при получении ЛПС по методу Вестфаля в модификацией В.А. Кульшина с
соавт. [3], выход ЛПС составляет 5 %, концентрация 5 мкг/мл получается из 107 убитых микробных клеток, поэтому доза ЛПС 5 мкг/мл эквивалентна количеству ЛПС, поступившем в кровь при гибели в крови 107 м.к./мл возбудителя. Именно эта доза и была использована в дальнейших экспериментах.
Нами выявлено, что продукция иммуноцитоки-нов под влиянием одноплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis (47 MDa) характеризовалась несинхронной стимуляцией с преобладанием про-воспалительных иммуноцитокинов (рис. 1). Влияние бесплазмидного деривата Y. pseudotuberculosis (pYV—) и Y. enterocolitica (47 MDa) не отличалось от воздействия Y. pseudotuberculosis (47 MDa).
Продукция IL-1 под влиянием двухплазмидно-го штамма Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) (рис. 2) была достоверно снижена по сравнению с Y. pseudotuberculosis (47 MDa) и Y. pseudotuberculosis (pYV —), такая же тенденция отмечалась в отношении IL-6 и TNF-a. Уровень IFN-a при воздействии Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) не отличался от контроля.
Выраженным стимулирующим эффектом на продукцию иммуноцитокинов обладал ЛПС Y. pseudotuberculosis (рис. 3). Однако максимальной
Таблица 1
Зависимость уровня продукции IFN-a культурой клеток цельной крови доноров от концентрации
суперантигена YPMа
Концентрация суперантигена YPMa (в эквивалентной дозе Y. pseudotuberculosis в 1 мл крови) Концентрация IFN-a, пкг/мл
Контроль 14,2 ± 1,4
103 18,7 ± 1,9
106 39,3 ± 4,0*
Примечание: * - достоверность различий, по сравнению с контролем (р < 0,002)
Таблица 2
Продукция IL-1, IL-6 и TNF-a в культуре клеток цельной крови доноров в зависимости от концентрации
Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa)
Группа Концентрация, пкг/мл
IL-1 IL-6 TNF-a
Контроль 42,3 ± 4,7 55,9 ± 6,2 41,8 ± 4,2
Y. pseudotuberculosis 103 м.к./мл 45,2 ± 4,9 54,3 ± 6,0 40,2 ± 4,2
Y. pseudotuberculosis 106 м.к./мл 81,7 ± 9,4* 214,3 ± 22,7* 79,2 ± 8,1*
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем при уровне значимости р < 0,05.
400 350 300 250 200 150 100 50 0
IFN
TNF
IL-1 IL-6
В Контроль ■ Y. pseudotuberculosis (47 MDa)
Рис. 1. Продукция иммуноцитокинов под влиянием Y. pseudotuberculosis (47 MDa) по сравнению с контролем.
продукция иммуноцитокинов была под воздействием суперантигена Y. pseudotuberculosis (рис. 4).
В ходе исследования нами оценена роль суперантигена YPMa Y. pseudotuberculosis в патогенезе псевдотуберкулеза. YPMa значительно увеличивал продукцию IL-1, IL-6, TNF-a, IFN-a культурой клеток цельной крови, что соответствует свойствам суперантигенов [10], причем эффект был дозозависимым — суперантиген в дозе, эквивалентной 103 м.к./мл не вызывал значимых изменений в уровне продукции IFN-a по сравнению с контролем, а в дозе, эквивалентной 106 м.к./мл, достоверно увеличивал выра-
ботку иммуноцитокина. То есть необходим минимальный уровень бактериемии для представления моноцитам периферической крови достаточного количества суперантигена Y. pseudotuberculosis, вследствие чего иммунокомпетентными клетками продуцируются провоспалительные цитокины.
Суперантиген обладает большим потенциалом на продукцию иммуноцитокинов, чем живая культура Y. pseudotuberculosis в эквивалентных количествах.
По сравнению с ЛПС (в дозе, эквивалентной 107 м.к./мл возбудителя), стимулирующий эффект
350 300 250 200 150 100 50 0
IFN
IL-1 IL-6
I Контроль ■ Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa)
TNF
Рис. 2. Продукция иммуноцитокинов под влиянием Y. pseudotuberculosis (82 : 47 MDa) по сравнению с контролем.
450 400 350 300 250 200 150 100
50 0
IFN
IL-1
IL-6
В Контроль ■ ЛПС (5мкг /мл)
Рис. 3. Продукция иммуноцитокинов под влиянием ЛПС по сравнению с контролем.
600 500 400 300 200 100 0
г-Ш
TNF
¿1
IFN
IL-1
IL-6
TNF
□ Контроль ■Суперантиген YPMa
Рис. 4. Продукция иммуноцитокинов под влиянием суперантигена по сравнению с контролем.
Примечание: а - достоверность различий по сравнению с контролем при уровне значимости р < 0,05; b - достоверность различий в уровне стимуляции иммуноцитокинов ЛПС по сравнению со стимуляцией суперантигеном YPMa Y. pseudotuberculosis при уровне значимости р <0,05, с - достоверность различий относительно уровня, индуцированного Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) при уровне значимости р < 0,05.
Таблица 3
Сравнительная характеристика продукции провоспалительных иммуноцитокинов культурой клеток цельной крови доноров под влиянием штаммов иерсиний, суперантигена YPMa и ЛПС
Y. pseudotuberculosis
Группа Концентрация, пкг/мл
IL-1 IL-6 TNF-a
Контроль, M ± m 48,3 ± 4,0 52,7 ± 28,1 38,3 ± 5,7
Y, pseudotuberculosis (47 MDa), M ± m 120,7 ± 3,1ac 363,6 ± 5,9a 96,8 ± 8,6a
Y, pseudotuberculosis (82:47 MDa), M ± m 91,6 ± 10,1a 326,7 ± 39,3a 88,4 ± 10,6a
Y, pseudotuberculosis (pYV-), M ± m 114,2 ± 2,3ac 358,3 ± 3,2a 95,6 ± 0,7a
Y, enterocolitica (47 MDa), M ± m 103,9 ± 1,2a 353,9 ± 2,9a 97,4 ± 1,1a
ЛПС (5 мкг/мл), M ± m 161,3 ± 7,2abc 405,4 ± 9,4abc 135,3 ± 5,2ac
Суперантиген YPMa, M ± m 210,8 ± 12,1ac 533,8 ± 21,2ac 125,8 ± 4,0ac
YPMa (в дозе, эквивалентной дозе 106 м.к./мл) на продукцию IL-1, IL-6, IFN-a, был достоверно выше, что указывает на патогенетическую роль суперантигена при немассивной бактериемии. При массивной бактериемии, сопровождающейся гибелью микроорганизмов и высвобождением большого количества эндотоксина (ЛПС), пусковым механизмом гиперпродукции IL-1, IL-6, TNF-a является ЛПС [4, 5, 8]. Это указывает на разницу в патогенетических процессах под действием эндотоксина (интоксикация) и суперантигена (иммунопатологические осложнения и генерализация заболевания) и на более позднюю активацию лимфоцитов, чем макрофагов суперантигенами, что согласуется с данными H. Muller-Alouf et al. [7] для суперантигена Streptococcus pyogenes.
С учетом данных о наличии анти-YPM IgG антител к YPMa при псевдотуберкулезе у больных в острый период заболевания, а также связь уровней анти-YPM IgG с системными проявлениями инфекции [6, 9], можно сделать вывод, что суперантиген YPMa является ведущим фактором в патогенезе иммунопатологических осложнений при псевдотуберкулезе, а способность к генерализации псевдотуберкулеза связана с продукцией YPMa.
Сравнительная характеристика влияния живых штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica (в количестве, равном 106 м.к./мл), ЛПС Y. pseudotuberculosis (в концентрации 5 мкг/мл) и суперантигена YPMa (в дозе, эквивалентной 106 м.к./мл) на продукцию провоспалительных имму-ноцитокинов культурой клеток цельной крови доноров отражена в таблице 3.
Таким образом, все исследуемые субстанции вызывали значимое повышение концентрации про-воспалительных иммуноцитокинов по сравнению с контролем. Наибольший стимулирующий эффект отмечался в отношении IL-6. Максимальный стимулирующий эффект наблюдался под влиянием суперантигена YPMa (превышение уровня IL-1 в 4,36 раза по отношению к контролю, IL-6 — в 10,13 раза, TNF-
a — в 3,28 раза). На втором месте по силе стимулирующего воздействия стоял ЛПС (превышение уровня IL-1 в 3,34 раза по отношению к контролю, IL-6 — в 7,69 раза, TNF-a — в 3,53 раза). Наименьшим стимулирующим эффектом среди исследуемых образцов обладал Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) (превышение уровня IL-1 в 1,90 раза по отношению к контролю, IL-6 — в 6,20 раза, TNF-a — в 2,31 раза).
ЛИТЕРАТУРА
1. Кетлинский С .А. Цитокины и их антагонисты: теория и практика / С.А. Кетлинский,
A.M. Ищенко // Медицинская иммунология. — 1999. - Т. 1, № 3-4. - С. 16.
2. Ковальчук Л.В. Новые возможности лечения цитокинами: иммуноцитокины в локальной иммунокоррекции / Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганков-ская // Intern. J. Immunorehabilitation. — 1997. — № 6. - С. 57-60.
3. Улучшенный метод выделения липополиса-харидов из грамотрицательных бактерий /
B.А. Кульшин, А.П. Яковлев, С.Н. Аваева и др. // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. - 1987. - № 5. - С. 44-46.
4. Casey L. Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome / L. Casey, R. Balk, R. Bone // Ann. Intern. Med. - 1993. - Vol. 119. - P. 771-778.
5. Circulating inflammatory mediators in patients with fever: predicting bloodstream infection / B. Groeneveld, A. Bossink, G. Mierlo et al. // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. - 2001. -Vol. 8, N 6. - P. 1189- 1195.
6. Clinical role for a superantigen in Yersinia pseudotuberculosis infection / J. Abe, M. Onimaru, S. Matsumoto et al. // J. Clin. Invest. - 1997. -Vol. 99, N 8. - P. 1823- 1830.
7. Comparative study of cytokine release by human peripheral blood mononuclear cells stimulated with Streptococcus pyogenes superantigenic erythrogenic toxins, heat-killed streptococci, and
lipopolysaccharide / H. Muller-Alouf, J. Alouf, D. Gerlach et al. // Infect. Immun. - 1994. - Vol. 62, N11. - P. 4915-4921.
8. Plasma levels of cytokines in primary septic shock in humans: correlation with disease severity / B. Gardlund, J. Sjolin, A. Nilsson et al. // J. Infect. Dis. - 1995. - Vol. 172. - P. 296-301.
9. Ueshiba H. Analysis of the superantigen-producing ability of Yersinia pseudotuberculosis
strains of various serotypes isolated from patients with systemic or gastroenteric infections, wildlife animals and natural environments / H. Ueshiba, H. Kato, T. Miyoshi-Akiyama // Zentralbl. Bakteriol. — 1998. - Vol. 288, N 2. - P. 277-291.
10. Vb-specific stimulation of human T cells by staphylococcal toxins / J. Kappler, B. Kotzin, L. Herron et al. // Science. - 1989. - Vol. 244. -P. 811-813.
