CC BY
29
УДК 576.09, 57.044
ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИИА ИА ДИНАМИКУ МИТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК У ПЛАНАРИЙ
Скавуляк А.Н.* Ермаков A.M. **, Крещенко Н.Д.*
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино (Россия) (nkreshch@rambler.ru) ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Введение. Серотонин - широко распространенная сигнальная молекула в животном царстве. В организме человека и млекопитающих серотонин выполняет функцию нейрогормона и нейромедиатора. Он оказывает влияние на нервную деятельность, вызывает сокращение гладкой мускулатуры кишечника, матки, бронхов, сужение сосудов [1]. У высших животных и человека биологическая роль серотонина заключается в регуляции сна, поддержании психоэмоциональных реакций: страха, тревоги, беспокойства.
Первые экспериментальные данные о механизмах действия серотонина были получены в опытах на печеночных двуустках (Fasciola hepatica), паразитирующих в печени крупного и мелкого рогатого скота [2]. С этого времени изучению серотонина у плоских червей стали уделять особое внимание, поскольку около 17 тысяч представителей Platyhelminthes являются опасными паразитами человека и животных.
Планарии - это свободноживущие плоские черви, являются модельным биологическим объектом при изучении процессов регенерации, морфогенеза, роста и развития. Пролиферативная активность клеток является совокупностью процессов подготовки клеток к митозу, реализации митотического деления и механизмов регуляции. Клеточное размножение - важнейший биологический процесс, обеспечивающий передачу наследственной информации, физиологическую и репаративную регенерацию органов и тканей, сохранение и восстановление тканевого гомеостаза.
В работе изучали динамику пролиферативной активности стволовых клеток, необластов, у планарий Schmidtea mediterranea (Turbellaria, Platyhelminthes), в нормальных условиях содержания животных и находящихся под воздействием серотонина.
Материалы и методы. Животных содержали в затемненных аквариумах со смесью водопроводной и дистиллированной воды (2:1) при комнатной температуре (20±1°С), кормили 2 раза в неделю. За 7 дней до опыта кормление прекращали. Для исследования отбирали особей длиной около 3-4 мм. В опыте, продолжительностью 3 суток, планарий содержали в условиях постоянного затемнения. Животных подопытной группы содержали в 1цМ растворе серотонина. Для выявления митотически активных клеток применяли непрямой иммуногистохимический метод, в котором использовали первичные антитела на фосфорилированный гистон-3 и вторичные иммуноглобулины с флуоресцентным зондом CF488A. Каждые два часа в течение суток фиксировали по 12 животных, препараты окрашивали и определяли число митотических клеток на единицу площади тела в каждой из 12 точек
фиксации. В каждой временной точке находили среднее значение числа митозов по 12-ти образцам. Таким образом, использовали 144 планарии в опыте, столько же животных было в контрольной группе. Опыт повторяли два раза. Окрашенные препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM6000B и конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SP5 (Германия).
Результаты и обсуждение. У животных контрольной группы в течение суток наблюдали ритмические колебания пролиферативной активности клеток с периодом около 4 часов. Распределение пиков митотической активности в течение суток имело многовершинный характер при абсолютном максимуме (151±3.8 п=12), наблюдавшемся в 16 ч дня (Пущино, МО, местное время) и абсолютном минимуме, отмеченном в 2 ч ночи (108±4.5 клеток на мм2, п=12). В два раза ниже абсолютного максимума пик митотической активности отмечен в24ч, ав6чи12ч наблюдались пики в два раза ниже предыдущего. В два раза выше абсолютного минимума пик митотической активности отмечен в 8 ч, а в 14 ч и 20 ч наблюдали пики в два раза выше предыдущего. Установлена полиэкстремальность кривой суточной митотической активности в теле планарий Schmidtea mediterranea.
Однократное добавление серотонина (10-6М) за 3 суток до подсчета митотических клеток в теле планариии изменяло динамику суточной пролиферативной активности, сглаживая ритмические колебания, наблюдаемые у животных контрольной группы. У подопытных животных в темную половину суток (в 22, 0, 2, 4, 6, 8 часов) общая пролиферативная активность понижалась по сравнению с контролем и составляла 82-98 клеток на мм2. В светлое время суток - с 10 до 20 ч пролиферативная активность клеток повышалась и варьировала от 112 до 145 клеток на мм2. При этом один ярко выраженный пик наблюдали в районе 12 часов (145±5.6) и «плато» - с 14-до 20 ч, когда число пролиферирующих клеток практически не колебалось. Только в 12 ч дня митотическая активность необластов достигала контрольного уровня, в остальное время - была ниже контроля. Таким образом: 1) Серотонин изменял суточный ритм динамики пролиферации. 2) Серотонин опосредовал «ощущение» светового и темнового периодов природного фона организмом планарий - так как, несмотря на то, что животные находились все время в темноте, они как-то определяли (с точки зрения регуляции пролиферации) «темновую» и «световую» фазы фотопериода. 3) При суммировании числа пролиферирующих клеток за сутки, оказалось, что серотонин снижал уровень пролиферации в теле планарий, при этом, общее число митотических клеток составило 76% от его уровня у контрольных животных.
Исследования, проведенные с помощью иммуноцитохимических, радиоиммунологических, и ультраструктурных методов показали наличие в нервной системе планарий серотониергических нервных элементов [3]. О функциональной роли серотонина в организме планарий известно немного. Существуют отрывочные сведения о влиянии серотонина на регенерацию у планарий [4]. Показано участие серотонина в регуляции движения ресничек на поверхности тела, способствующих передвижению животного в воде [5]. Серотонин стимулировал аденилатциклазную активность и у паразитических трематод F. hepatica и Schistosoma mansoni и планарий Polycelis tenuis, Dugesia gonicephala и Dugesia lugubris. Эти результаты
позволили авторам предположить, что цАМФ является посредником в осуществлении серотонином физиологического действия [4].
В отечественной и зарубежной литературе нам не удалось обнаружить сведений о взаимодействии серотонина с аппаратом клеточного деления. Однако известно, что у высших организмов серотонин принимает участие в регуляции циркадных ритмов, гормональной секреции, пищевого поведения, иммунного ответа и других важных функций организма [6].
Можно предположить, что формирование биоритмов - процесс эволюционно древний, существующий на ранних этапах эволюционного развития организмов, даже у таких примитивно устроенных животных, как плоские черви, планарии. Обнаруженное в настоящем исследовании влияние серотонина на ритмические колебания суточной пролиферативной активности стволовых клеток планарий свидетельствует о возможном участии серотонина в формировании циркадианных ритмов у этих простых организмов. Эти биоритмы синхронизированы с продолжительностью фотопериодов и обусловливают адаптацию организма к 24-часовому циклу смены дня и ночи. (Работа частично поддержана грантом РФФИ 15-04-05948а).
Литература: 1. Page I.H. II Perspect. Biol. Med. -1976,- V. 20,- №1,- P.l-8. 2. Mansour Т.Е., Mansour J.M. II Biochem. Pharmacol. - 1979,- V.28.- №12. - P.1943-1946. 3. Крещенко Н.Д. II Биологические мембраны. -2016,- Т.ЗЗ,- № 5. -С.353-362. 4. Franquinet R., Martelly I.//Cell. Differ. -1981. -V.10. -P.201-209. 5. Sakharov D.A., et al./Лп: Neurobiology of invertebrates: transmitters, modulators and receptors. Eds Salanki J., Rózsa K.S. Budapest, Akadémiai Kiadó, - 1988,- p. 479-491. 6. Сухов И.Б., и др.//Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2015. Т.101,- №3. - С.279-290.
Effects of serotonin on the dynamics of mitotic activity of planarian stem cells.
Skavulyak A.N., Ermakov A.M., Kreshchenko N.D. Institute of Cell Biophysics, Pushchino; Institute ofTheoretical and Experimental Biophysics, Pushchino.
Summary. One represents data on the serotonin solution effects on dynamics of stem cell proliferation in planarian Schmidtea mediterránea. Results indicate inhibiting effects of serotonin on mitotic cell activity. The possible modulatory role of the exogenous serotonin in regulation of rhythmic proliferative activity of planarian stem cells is suggested.
