CC BY
76
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И ИХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ В ХОДЕ МОРФОГЕНЕЗА У ПЛОСКИХ ЧЕРВЕЙ
Крещенко Н.Д.
Учреждение Российской Академии Наук Институт биофизики клетки
Введение. Пролиферативная активность стволовых клеток является важным показателем морфогенетических процессов, происходящих в ходе бесполого размножения, регенерации, эмбрионального развития. Планарии обладающие высокой регенерационной способностью, широко используются в качестве модельного объекта для изучения морфогенеза, слабых физических и химических воздействий, в нейробиологических и токсикологических исследованиях, при изучении эволюционных аспектов централизации нервной системы, механизмов мышечного сокращения, при разработке новых антипаразитарных препаратов (5,7). Тотипотентные стволовые клетки планарий, необласты, число которых, по данным разных авторов, составляет от 10 до 20% клеток тела (6,8), обеспечивают регенерационные возможности организма и дают начало всем типам клеток в ходе ежедневного клеточного самообновления, а также после повреждения или экспериментальной ампутации (4). У размножающихся бесполым путем планарий, линия стволовых клеток способна дифференцироваться и в половые и в соматические клетки, и поддерживается в течение всей жизни организма (1). В настоящей работе пролиферативную активность стволовых клеток изучали в процессе регенерации глотки, удаленной из тела планарий Girardia tigrina (Turbellaria, Platyhelminthes), а также после воздействия нейропептидом HHA (head hydra activator, (9)).
Материалы и методы. Планарий содержали в аквариумах с водопроводной и дистиллированной водой (2:1) водой при 20С° и кормили мотылем один-два раза в неделю. Перед опытом животных держали голодными в течение недели. Особям длиной 9-10 мм под бинокулярным микроскопом удаляли глотку тонким глазным скальпелем и помещали группами в стаканы с водой или раствором пептида HHA,
(pEPPGGSKVILFамид, 0,1 мкМ). Определяли митотический индекс (МИ) в окологлоточной (ОГ) и предглоточной (ПГ) областях тела в суспензии клеток, приготовленных из десяти регенерирующих особей. Фрагменты ткани размером 1,5 мм обрабатывали 30-40 минут смесью содержащей метанол, уксусную кислоту, глицерин и фосфатный буфер в соотношении (2:1:1:12), полученную суспензию клеток окрашивали с помощью Hoechst 33342 и фиксировали формалином в конечной концентрации 4 %. Под
флуоресцентным микроскопом подсчитывали число митозов на четырех препаратах, приготовленных из одной пробы, просматривая не менее 4000 клеток на одну временную точку. Регенерирующих глотку животных (для каждой временной точки) перед приготовлением суспензии клеток помещали еще на 2 часа в 0.02 % раствор колхицина для накопления митозов.
255
Результаты и обсуждение. У интактных планарий, которых не помещали в колхицин, митотический индекс в ПГ (0.20±0.08) и ОГ (0.25±0.08) областях тела был примерно одинаковым. У планарий, которых помещали в колхицин на 2 ч, значение МИ увеличивалось до 0.75±0.01 в ОГ области и 0.40±0.16 в ПГ области тела.
Таблица
Значение МИ в окологлоточной и предглоточной областях
регенерирующих планарий (M + m, %)
Время ОГ ОГ ПГ ПГ
регенерации,часы контроль HHA контроль HHA
2 0.60+0.08 1.05+0.21 0.10+0.08 0.25+0.04
4 0.50+0.01 0.60+0.16 0.30+0.16 0.45+0.16
8 0.35+0.08 0.45+0.08 0.40+0.08 0.30+0.08
12 0.50+0.16 0.35+0.01 0.50+0.08 0.40+0.08
24 0.70+0.16 0.40+0.16 0.25+0.08 0.85+0.04
48 0.20+0.16 0.20+0.01 0.25+0.08 0.35+0.16
72 0.40+0.16 0.35+0.04 0.60+0.16 0.15+0.08
96 0.35+0.16 0.25+0.16 0.60+0.16 0.30+0.16
В контрольной группе животных число митозов в ОГ зоне тела составило 0.6 через 2 ч регенерации (табл.), к 8 ч регенерации МИ уменьшался, после чего наблюдали подъем числа митозов к 24 ч регенерации. Небольшое увеличение МИ наблюдали В ОГ через 72 ч. В ПГ области планарий МИ увеличивался постепенно к 12 ч после ампутации. Второй подъем наблюдали через 72 и 96 ч регенерации. При помещении регенерирующих животных в раствор нейропептида HHA (0,1 мкМ, подопытная группа) через 2 ч регенерации значение МИ в ОГ области тела существенно опережало аналогичный показатель в контрольной группе особей (табл.). Это опережение наблюдали вплоть до 12 ч, после чего МИ уменьшался, достигая минимума к 48 ч регенерации. В ПГ области подопытных животных увеличение МИ происходило спустя 24 ч регенерации, после чего МИ также уменьшался к 48 ч после удаления глотки.
Ранее при ампутации головного конца тела у планарий Dugesia mediterranea было выявлено увеличение числа митозов через 4-12 ч регенерации, а также на 2-4 сут (3). Динамика пролиферативной активности стволовых клеток в ходе регенерации глотки изучалась впервые. Обнаружено, что она носила волнообразный характер. Число митозов возрастало как в области регенерации глотки, так и в области, удаленной от места регенерации. Результаты показали, что в зоне регенерации глотки (ОГ) изменение пролиферативной активности происходило уже в первые часы после ампутации. Максимального значения МИ достигал через 24 ч регенерации. Уменьшение митотического индекса через 8 ч регенерации, вероятно, отражает тот факт, что находящиеся в стадии G2-фазы необласты к этому времени поделились. При этом имеющийся пролиферативный потенциал
256
расходуется, а следующее существенное увеличение числа делящихся клеток происходит через 24 ч, когда к делению приступают клетки прошедшие S-стадию клеточного цикла. Изменение динамики пролиферативной активности в ПГ области тела животных показало увеличение числа митозов в более поздние сроки после ампутации (3-4 сут), что указывает на использование организмом резервных стволовых клеток из удаленной от места регенерации области. Эти необласты, вероятно, используются на пополнение запаса клеток, израсходованных в зоне регенерации в первые часы регенерационного процесса.
Известно, что нейропептид HHA стимулировал клеточную пролиферацию у гидроидных полипов и млекопитающих (10). Он также ускорял рост головной регенерационной бластемы и рост глотки у планарий (2).Однако механизм действия нейропептида остается не раскрытым. В наших опытах, нейропептид HHA оказывал митогенное действие в ходе регенерации глотки у планарий, при этом наблюдали как изменение динамики пролиферативной активности, так и увеличение общего числа митозов. Данные могут указывать на ускорение прохождения клеточного цикла необластами под действием нейропептида. (Работа поддержана грантом РФФИ 09-04-243а.)
Литература: 1. Исаева В.В. и др.// Онтогенез.- 2009. - Т. 40. - №2. - С. 83-96. 2. Крещенко Н.Д., Шейман И.М..// Онтогенез.- 1994. Т. 25. - № 6. - С. 350-356. 3. Baguna J.// J. Exp. Zool. - 1976. - V. 195. - P. 53-64. 4. Baguna J.// Nature. -1981. - 290. - P.14-15. 5. Moneypenny C.G. et al.// Parasitology. - 2001.
- V. 122. - P. 447-455. 6. Orii H. et al.// Dev. Genes Evol. - 2005. - V. 215. - № 3.
- P. 143-57. 7. Reuter M., Kreshchenko N.// Canadian Journal of Zoology. - 2001. -V. 82. - P. 334-356. 8. Salo E, Baguna J.// J. Exp. Zool. - 2002. - V 292. - № 6. -P. 528-39. 9. Schaller H. C.// Cell Differ. - 1976. - V. 5. - P. 1-11. 10. Schaller H.C. et al.// Development. - 1989. - V. 107. - P. 99-107.
The stem cells system and its functioning during morphogenetic process in flatworms. Kreshchenko N.D. Institute of Cell biophysics.
Summary.Freshwater turbellarian, planarians, possesses an unique regenerative capacity based on existence of totipotent stem cells called neoblasts. Neoblasts give rise to all types of cells in organisms during cell turnover, morphogenesis, asexual reproduction and regeneration. The dynamics of stem cell proliferation has been followed during pharyngeal regeneration in Girardia tigrina. The increase of the mitotic index values has been observed during regeneration in peripharyngeal and prepharyngeal body areas. It has been found that dynamics of proliferation has a wave shape. Incubation with HHA has changed the dynamics of cell proliferation and increased the number of mitotic figures in regeneration of worms.
257
