Влияние салициловой кислоты и этилена на устойчивость растений пшеницы к Septoria nodorum Berk Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 581.2

ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ И ЭТИЛЕНА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К SEPTORIA NODORUM BERK

© Т. В. Нужная*, С. В. Веселова, И. В. Максимов

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября 71.

*Email: [email protected]

Изучено влияние салициловой кислоты (СК) и этилена на развитие защитных реакций в растениях пшеницы контрастных по устойчивости к септориозу сортов. Повышение устойчивости растений пшеницы под влиянием СК и 1-метилциклопропена (1-МЦП) коррелировало с высокой генерацией Н2О2 и увеличением активности пероксидазы, что приводило к увеличению отложения лигнина в клеточных стенках инфицированных листьев. В то время как, обработка растений пшеницы этефоном отрицательно влияла на развитие защитных реакций в растениях пшеницы через ингибирование генерации Н2О2 и активности пероксидазы, что приводило к уменьшению лигнификации клеточных стенок у обоих сортов.

Ключевые слова: Triticum aestivum L., Septoria nodorum Berk., салициловая кислота, эте-фон, 1-метилциклопропен, пероксид водорода, пероксидаза.

Введение

Салициловая кислота (СК) и этилен являются одними из основных растительных гормонов, индуцирующих защитные реакции растений против патогенов. Салицилат- и этилен-зависимые защитные ответы растений при патогенезе — два сигнальных пути, проявляющих антагонизм [1]. Из исследований на арабидопсисе известно, что СК-зависимый путь регуляции защитного ответа эффективен против биотрофных патогенов, а этилен-зависимый — против некротрофов [1]. Влияние этилена на СК неоднозначно и может быть как положительным [2], так и отрицательным [3]. Под строгим контролем гормонов, в том числе СК и этилена, находиться про-/антиоксидантный статус растений [1, 4, 5]. В литературе много противоречивых данных о механизмах регуляции этилен-зависимых защитных ответов растений при патогенезе [1, 3, 6]. Однако, мало известно об участии этого гормона в регуляции про-/антиоксидантного статуса у однодольных растений при гемибиотрофной инфекции.

Целью нашей работы было изучить состояние компонентов про-/антиоксидантной системы под воздействием СК, этефона (ЭТ) (химического предшественника этилена) и ингибитора рецепции этилена (1-МЦП) при формировании устойчивости растений пшеницы к грибу Septoria nodorum Berk.

Материалы и методы

Объектом исследований служили 7-суточные проростки мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) двух контрастных по устойчивости сортов Казахстанская 10 (Каз10) (восприимчивый) и Омская 35 (Ом35) (устойчивый), выращенных в лабораторных условиях на водной культуре и подвергнутых предпосевной обработке СК в концентрации 50 мкМ. Часть срезанных первых листьев проростков, помещенных в чашки Петри, обрабатывали раствором 1-МЦП ("AgroFresh Inc, Spring House PA", США) в концентрации 2 мМ, часть — раствором эте-

фона ("Sigma", Германия) в концентрации 1.5 мМ, немедленно закрывали и помещали в темноту [4]. Через 24 ч листья инфицировали суспензией пикно-спор агрессивного штамма гриба S. nodorum (105 спор/мл) из коллекции лаборатории.

Растительный материал (1:5 вес/об.) гомогенизировали в 0.05 М Na-фосфатном буфере (ФБ), рН 6.2, и инкубировали при 4 °С в течение 30 мин. Су-пернатант отделяли центрифугированием при 15000 g (5415К "Eppendorf", США). Концентрацию пероксида водорода определяли по методу [5], используя ксиленол оранжевый в присутствии Fe2+. Затем смесь центрифугировали 10 мин при 8000 g. Оптическую плотность комплекса измеряли при 560 нм на спектрофотометре BioSpec-Mini ("Shi-madzu", Япония). Активность ПО определяли микрометодом по окислению (о-) фенилендиамина (ОФД) в присутствии Н2О2 [6] при 490 нм на спектрофотометре Benchmark Microplate Reader ("BioRad", США). Активность фермента выражали в оптических ед./мг белка. Содержание белка определяли по методу Бредфорд.

Автофлуоресценцию лигнина наблюдали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (ЛСКМ) LSM-510 на базе инвертированного микроскопа Axiovert 200M ("Carl Zeiss", Германия) в отрезках листьев, фиксированных в 96% этаноле. Для возбуждения автофлуоресценции использовали аргоновый лазер 30 мВт с длиной волны 488 нм, дихроичным зеркалом 490 нм и пропускающем светофильтром 505 нм [7]. Накопление Н2О2 в инфицированных тканях листьев определяли через 24 ч после инокуляции путем витального окрашивания 3.3-диаминобензидином (ДАБ) [8]. Для регистрации накопления Н2О2 использовали цифровой микроскоп BZ8100E ("Keyence", Япония).

Площадь зоны поражения измеряли с помощью компьютерной программы ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/download.html). Все опыты проводили в 3 биологических и 3 аналитических по-вторностях. При обработке результатов использо-

вали компьютерные программы Statistica 6.0 ("StatSoft", Россия). В таблицах и на рисунке приведены средние значения биологических повторов и их стандартные ошибки.

Результаты и обсуждение

Анализ развития септориоза на листьях пшеницы показал, что обработанные этефоном растения двух контрастных сортов Каз10 и Ом35, становились более чувствительны к грибу S. nodorum, так как на листьях развивались пикниды гриба, окруженные большими зонами хлорозов, занимающих до 50 и 40% площади листа, соответственно, у восприимчивого и устойчивого сорта (табл. 1). Предпосевная обработка семян СК и обработка листьев ингибитором рецепции этилена 1-МЦП приводила к многократному торможению развития болезни, зоны поражения с некрозами, но без хлорозов и пикнид занимали от 2 до 10% площади листа у обоих сортов (табл. 1).

Полученные нами результаты говорят о положительном влиянии СК и отрицательном влиянии этилена на защитный ответ растений пшеницы при гемибиотрофной инфекции, что согласуется с данными литературы [1, 3]. Известно, что у нечувствительных к этилену растений снижены симптомы развития различных болезней [3].

В растительных тканях в ответ на внедрение патогена выявляется целый ряд сигнальных соединений, запускающих каскад ответных биохимических реакций [9]. Такую роль может выполнять пероксид водорода (Н2О2), вызывающий окислительный взрыв. Инфицирование индуцировало небольшое и транзиторное накопление Н2О2 в листьях восприимчивого сорта Каз10 через 24 ч после инфицирования, тогда как в листьях устойчивого сор-

та Ом35 генерация Н2О2 была не только выше, но и поддерживалась на протяжении всего эксперимента на высоком уровне (табл. 2), как это было показано для устойчивых линий ячменя, пораженных мучнистой росой [10]. Гистохимический анализ накопления Н2О2 в листьях пшеницы показал, что значительная его генерация наблюдалась в зоне проникновения мицелия патогена у устойчивого, но не восприимчивого сорта (рис. 1а, д).

Рис. 1. Влияние СК и этилена на локальную генерацию Н2О2 в листьях пшеницы сортов Казахстанская 10 (а, б, в, г) и Омская 35 (д, е, ж, з) через 24 ч после инфицирования грибом nodorum. Инфицирование - а, д; СК+инф -б, е; этефон+инф - в, ж; 1-МЦП+инф - г, з.

В обработанных этефоном инфицированных листьях генерация Н2О2 подавлялась на протяжении всего эксперимента, но с большей интенсивностью у восприимчивого сорта Каз10 (табл. 2), что также подтвердил гистохимический анализ накопления Н2О2 в зоне поражения (рис. 1в, ж).

Обработка семян СК и обработка листьев пшеницы 1-МЦП приводила к интенсификации накопления Н2О2 в листьях обоих сортов через 24 и 48 ч после инфицирования, причем более резко и продолжительно у восприимчивого сорта (табл. 2), такие же результаты были получены с помощью

Таблица 1

Влияние салициловой кислоты и этилена на развитие септориоза в листьях контрастных по устойчивости сортов расте-_ний пшеницы через 9 сут после инфицирования_

Площадь поражения, мм2

Контроль

СК

ЭТ

1-МЦП

Казахстанская 10 82.6±6.0 15.1±3.5

Омская 35 16.7±2.5 6.8±1.9

СК - салициловая кислота, ЭТ - этефон, 1 -МЦП - 1-метилциклопропен.

111.8±3.0 95.2±7.6

2.6±0.6 2.9±0.9

Таблица 2

Влияние салициловой кислоты и этилена на генерацию Н2О2 в листьях контрастных по устойчивости сортов пшеницы _при инфицировании грибом nodorum_

Время после инфицирования, ч Вариант Время после инфицирования, ч

24 | 48 | 72 24 | 48 | 72

Казахстанская 10, Н2О2, мкМ / г сырой массы Омская 35, Н2О2, мкМ / г сырой массы

15.9±0.9 14.4±2.3 17.2±1.7 Контроль 15.7±0.8 23.1±0.5 23.1±0.6

24.2±2.8 21.7±2.9 10.9±1.3 Инфицирование 38.1±0.3 43.7±0.8 31.7±0.8

33.1 ±4. 6 54.1±6.0 32.3±2.9 СК 28.3±0.1 26.0±1.7 25.9±2.0

38.1 ±4. 3 44.4±4.6 26.8±2.9 СК+Инф 42.8±0.6 45.1±1.6 28.3±2.9

12.9±1.0 23.2±1.5 14.7±1.6 ЭТ 12.3±0.5 7.9±1.1 9.2±1.4

7.4±1.6 11.5±1.9 9.0±1.1 ЭТ+Инф 21.6±0.1 13. 8±0. 8 13.7±1.7

20.0±2.0 36.4±4.6 25.3±3.2 1-МЦП 33.9±0.6 26.3±1.5 20.8±1.2

32.5±2.8 39.4±5.8 21.3±2.5 1-МЦП+Инф 39.02±0.5 36.6±0.7 29.4±1.1

гистохимического анализа накопления Н2О2 в листьях пшеницы (рис. 1).

Известно, что СК, ингибируя каталазу, способствует накоплению Н2О2 [11]. Однако, до сих пор остается не выясненным индуцирует ли этилен синтез Н2О2, хотя иногда инфицирование сопровождается параллельным накоплением этилена и Н2О2 [12]. Так было показано, что этилен принимал участие в механизмах формирования патоген-индуцированных некрозов в растительных тканях, способствующих последующей колонизации растений [3, 12]. Обнаруженное в данной работе значительное транзитное накопление Н2О2 у обработанных 1-МЦП и ингибирование накопления Н2О2 у обработанных этефоном инфицированных растений подтверждает данные, полученные на трансгенных растениях с нарушенным синтезом и рецепцией этилена [12].

Образование и утилизация АФК находится под контролем про-/антиоксидантных ферментов, одним из таких ферментов является пероксидаза [13]. Наши данные показали, что инфицирование приводило к постепенному повышению активности фермента в листьях обоих сортов в течение всего эксперимента, но с различной интенсивностью (рис. 2). Обработка СК, также как и 1-МЦП стимулировала активацию ПО в инфицированных листьях, а этефон ингибировал активность фермента на протяжении всего эксперимента у обоих сортов (рис. 2). О возможности СК непосредственно влиять на активность ПО ранее сообщалось и другими исследователями [11, 14]. Однако, влияние этилена на активность пероксидаз в процессах инфицирования растений не изучалось.

Формирование лигнина, катализируемое растительными ПО, с одной стороны — наиболее

надежный способ утилизации фитотоксичных концентраций АФК и фенольных соединений, а с другой — способствует образованию механического барьера для патогена, не разрушаемого его гидролазами [13].

В наших экспериментах через 3 сут после заражения в клеточных стенках тканей листа восприимчивого сорта Каз10 автофлуоресценция лигнина была выражена значительно слабее, чем у устойчивого сорта Ом35 (рис. 3). Обработка растений пшеницы СК и 1-МЦП приводила к увеличению отложения лигнина в клеточных стенках инфицированных листьев обоих сортов (рис. 3), что совпадало с интенсивной генерацией Н2О2 (рис. 1) и высокой активностью ПО (рис. 2) в этих вариантах. Так на растениях картофеля, инфицированных фитофторой, с помощью гистохимических методов была выявлена связь между накоплением фенольных соединений и активностью пероксидазы в зоне заражения, что коррелировало в повышением устойчивости таких растений [14]. Обработка этефоном уменьшала степень лигнификации клеточных стенок у обоих сортов (рис. 3), что совпадало с инги-бированием как генерации Н2О2 (рис. 1), так и активности ПО (рис. 2).

Таким образом, увеличение устойчивости под влиянием обработок СК и 1-МЦП коррелировало с высокой генерацией Н2О2 и увеличением активности ПО, что приводило к более интенсивному отложению лигнина. При обработке этефоном наблюдались противоположные реакции. Данные результаты говорят о положительном влиянии СК и отрицательном влиянии этилена на защитный ответ растений пшеницы при гемибиотрофной инфекции, проявляющийся в регуляции активности компонентов про-/антиоксидантной системы.

А

Б

120 | 90 »о | 60 I 30 0 1 г!п 1 2 3 В 120 90 60 1 г1 : 4 1 \л 2 Г 1 .1 3 4

Рис. 2. Влияние СК и этилена на активность пероксидазы в листьях пшеницы сортов Казахстанская 10 (А, Б) и Омская 35 (В, Г) через 24 (А, В) и 72 (Б, Г) часа после инфицирования грибом nodorum: /-контроль, //-инфицирование. 1 - контроль, 2 - СК, 3 - этефон, 4 - 1-МЦП.

Рис. 3. Влияние салициловой кислоты и этилена на отложение лигниноподобных фенольных соединений в клеточных стенках листьев двух контрастных по устойчивости сортов пшеницы Казахстанская 10 (а, б, в, г) и Омская 35 (д, е, ж, з) через 3 сут после инфицирования грибом S. nodorum. Обозначения такие же как на рис. 1.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант №14-04-97079) и ФЦП (Госконтракт № 14.ВВВ.21.0063).

ЛИТЕРАТУРА

1. Ding L., Xu H., Yi H., Yang L., Kong Z., Zhang L., Xue S., Jia H., Ma Z. Resistance to Hemi-Biotrophic F. graminearum Infection Is Associated with Coordinated and Ordered Expression of Diverse Defense Signaling Pathways // PLoS ONE. 2011. Vol. 6. e19008.

2. Leon-Reyes A., Spoel S. H., De Lange E., Abe H., Kobayashi M., Tsuda S., Millenaar F., Welschen R., Ritsema T., Pieterse C. M. Ethylene modulates the role of nonexpressor of pathogene-sis-related genes1 in cross talk between salicylate and jasmonate signaling // Plant Physiol. 2009. Vol. 149(4). P. 1797-809.

3. Chen H., Xue L, Chintamanani S., Germain H., Lin H., Cui H. et al. Ethylene insensitive3 and Ethylene insensitive3-like1 repress saliyilic acid induction deficient2 Expression to Negatively Regulate Plant Innate Immunity in Arabidopsis // The Plant Cell. 2009. Vol. 21. P. 2527-2540.

4. Almagro L., Gomez Ros L. V., Belchi-Navarro S., Bru R., Ros Barcello A., Pedreno M. A. Class III peroxidases in plant defence reactions // J. Exp. Botany. 2009. Vol. 60. P. 377-390.

5. Barna B., Fodor J., Harrach B. D., Pogany M., Kiraly Z. The Janus face of reactive oxygen species in resistance and susceptibility of plants to necrotrophic and biotrophic pathogens// Plant Physiol. Biochem. 2012. Vol. 59. P. 37-43.

6. Wi S. J., Ji N. R., Park K. Y. Synergistic Biosynthesis of Bi-phasic Ethylene and Reactive Oxygen Species in Response to Hemibiotrophic Phytophthora parasitica in Tobacco Plants// Physiol. Plant. 2012. Vol. 159. No. 1. P. 251-265.

7. Vysotskaya L., Wilkinson S., Davies W., Arkhipova T., Kudoyarova G. The effect of competition from neighbours on stomatal conductance in lettuce and tomato plants // Plant Cell Environ. 2011. Vol. 34. No. 5. P. 729-737.

8. Bindschedler L. V., Minibayeva F., Gardner S. L. et al. Early signaling events in the apoplastic oxidative burst in suspension cultured french bean cells involve cAMP and Ca2+ // New Phytologist. 2001. Vol. 151. P. 185-194.

9. Ермаков А. И., Арасимович В. В., Яраш Н. П. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиз-дат. 1987. 430 с.

10. Efetova M., Zeier J., Riederer M., Lee C.-W., Stingl N., Mueller M., Hartung W., Hedrich R., Deeken R. A central role of ABA in drought stress protection of Agrobacterium-induced tumors on Ar-abidopsis.// Plant Physiol. 2007. Vol. 145. No. 3. P. 853-862.

11. Vleesschauver D. D., Yinong Y., Casiana V. C., Monica H. Abscisic acid-induced resistance against the brown spot pathogen Cochliobolus miyabeanus in rice involves MAP kinase-mediated repression of ethylene signaling. // Plant Physiol. 2010. Vol. 152. P. 2036-2052.

12. Тарчевский И. А. Сигнальные системы клеток растений // М.: Наука. 2002. 294 с.

13. Kawano T., Furuichi T. Salicylic acid as a defence-related plant hormone: Roles of oxidative and calcium signaling paths in salicylic acid biology // Salicylic acid: А plant Hormone / Ed. Hayat S., Ahmad A. 2007. Springer. Berlin. Heidelberg. P. 277-322.

14. Максимов И. В., Черепанова Е. А., Бурханова Г. Ф., Соро-кань А. В., Кузьмина О. И. Структурно-функциональные особенности изопероксидаз растений // Биохимия. 2011. Т. 76. №6. С. 749-763.

Поступила в редакцию 05.12.2014 г.

EFFECTS OF SALICYLIC ACID AND ETHYLENE ON RESISTANCE OF WHEAT PLANT AGAINST FUNGUS SEPTORIA NODORUM BERK

© T. V. Nuzhnaya*, S. V. Veselova, I. V. Maksimov

Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Research Centre, Russian Academy of Science 71 Oktyabrya Ave., 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.

*Email: [email protected]

We studied the effect of salicylic acid (SA) and ethylene on defense response of plants to hemibiotrophic infection. Study of wheat cultivars with contrasting resistance to septoria showed that 1-methylcyclopropene (1-MCP)- as well as SA-treatment increased resistance of susceptible cultivar. In both cases it was detected that increased lignification of plant cell walls correlating with increased PO activity and with generation of hydrogen peroxide at the zone of damage led to decreased damage zones and cessation of pathogen development. On the contrary, treating leaves with ethephon (chemical precursor of ethylene) resulted in a decline in wheat resistance to infection, manifested in vast zones of damage with chlorosis and developing picnidia, which is likely to be due to decreased lignification of plant cell walls correlating with reduced generation of H2O2 and inhibition PO activity. There was revealed the negative role of ethylene and positive role of SA on resistance of wheat plants against fungus Septoria nodorum Berk.

Keywords: Triticum aestivum L., Septoria nodorum Berk., salicylic acid, 1-methylcyclopropene, ethephon, hydrogen peroxide, peroxidase.

Published in Russian. Do not hesitate to contact us at [email protected] if you need translation of the article.

REFERENCES

1. Ding L., Xu H., Yi H., Yang L., Kong Z., Zhang L., Xue S., Jia H., Ma Z. PLoS ONE. 2011. Vol. 6. e19008.

2. Leon-Reyes A., Spoel S. H., De Lange E., Abe H., Kobayashi M., Tsuda S., Millenaar F., Welschen R., Ritsema T., Pieterse C. M. Plant Physiol. 2009. Vol. 149(4). Pp. 1797-809.

3. Chen H. The Plant Cell. 2009. Vol. 21. Pp. 2527-2540.

4. Almagro L., Gomez Ros L. V. J. Exp. Botany. 2009. Vol. 60. Pp. 377-390.

5. Barna B., Fodor J., Harrach B. D., Pogany M., Kiraly Z. Plant Physiol. Biochem. 2012. Vol. 59. Pp. 37-43.

6. Wi S. J., Ji N. R., Park K. Y Physiol. Plant. 2012. Vol. 159. No. 1. Pp. 251-265.

7. Vysotskaya L., Wilkinson S., Davies W., Arkhipova T., Kudoyarova G. Plant Cell Environ. 2011. Vol. 34. No. 5. Pp. 729-737.

8. Bindschedler L. V., Minibayeva F., Gardner S. L. et al. Early signaling events in the apoplastic oxidative burst in suspension cultured french bean cells involve cAMP and Pp. 2+. New Phytologist. 2001. Vol. 151. Pp. 185-194.

9. Ermakov A. I., Arasimovich V V., Yarash N. P. Metody biokhimicheskogo issledovaniya rastenii [Methods of biochemical studies of plants]. Leningrad: Agropromizdat. 1987.

10. Efetova M., Zeier J., Riederer M., Lee C.-W., Stingl N., Mueller M., Hartung W., Hedrich R., Deeken R. Plant Physiol. 2007. Vol. 145. No. 3. Pp. 853-862.

11. Vleesschauver D. D., Yinong Y, Casiana V C., Monica H. Plant Physiol. 2010. Vol. 152. Pp. 2036-2052.

12. Tarchevskii I. A. Signal'nye sistemy kletok rastenii [The signaling systems of plant cells]. Moscow: Nauka. 2002.

13. Kawano T., Furuichi T. Salicylic acid: A plant Hormone. Ed. Hayat S., Ahmad A. 2007. Springer. Berlin. Heidelberg. Pp. 277-322.

14. Maksimov I. V, Cherepanova E. A., Burkhanova G. F., Sorokan' A. V., Kuz'mina O. I. Biokhimiya. 2011. Vol. 76. No. 6. Pp. 749-763.

Received 05.12.2014.