CC BY
32
Висновки
Результати даних дослщжень можна використовувати для побудови тест-системи in vitro для первинного скриншгу iзолятiв грибiв роду Alternaría на токсигеншсть та добору толерантних до альтернарюзу форм озимо! м'яко'1 пшенищ. Було розроблено умови проведения роботи in vitro та ввдбрано для подальших дослiджень найбiльш токсигенш iзоляти.
Список л1тератури
1. Бабаянц О.В. Видовой состав и вредоносность микробиоты колосьев озимой пшеницы южной степи Украины // Актуальные проблемы иммунитета и защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей: Тез. докл. Междунар. научно-практической конференции СГ1-НЦНС, 11-14 вересня 2007 р. - Одеса: КП ОМД, 2007 р.
- С. 42.
2. Ганнибал Ф.Б., Левитин М.М. Видовое и внутривидовое разнообразие токсигенных грибов рода Alternaria // Успехи медицинской микологии: Материалы IV Всероссийского конгресса по медицинской микологии. - М.: Национальная академия микологии, 2006. - Т. VII. - С. 7-8.
3. Ганнибал Ф.Б. Токсигенность и патогенность грибов рода Alternaria для злаков // Лаборатория микологии и фитопатологии им. А.А. Ячевского ВИЗР. История и современность / Под ред. А.П. Дмитриева. - СПб: ВИЗР, 2007. - С. 82-93.
4. Ганнибал Ф.Б. Виды рода Alternaria в семенах зерновых культур в России // Микология и фитопатология. - 2008. - Т. 42, Вып. 4. - С. 359-368.
5. Никифорова Е.А. Фитопатологическое состояние семян озимой мягкой пшеницы в зоне южной степи Украины // Актуальные проблемы иммунитета и защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей: Тез. докл. Междунар. научно-практической конференции СГ1-НЦНС, 11-14 вересня 2007 р. - Одеса: КП ОМД, 2007 р.
- С. 17.
6. Ткачёва А.А., Поляков А.В., Бирюкова Н.К. Усовершенствованный метод оценки селекционного материала огурца на устойчивость к фузариозному увяданию // Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России: Матер. Междунар. научно-практической конференции КНИИОКХ РАСХН, 4-7 сентября 2004 г. - Краснодар, 2004 г. - С. 70-75.
7. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и её регуляция. - Уфа: Гилем, 2001. - 160 с.
ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К ФИТОПАТОГЕНАМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОВМЕСТНЫХ КУЛЬТУР
И.В. МАКСИМОВ, доктор биологических наук;
О.Б. СУРИНА, кандидат биологических наук;
Н.Б. ТРОШИНА, доктор биологических наук Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского
научного центра РАН, Уфа, Россия
Введение
Сложность оценки устойчивости растений к патогенам в полевых условиях связана с их многообразием. В связи с этим в исследованиях фитоиммунологов используются способы культивирования конкретных патогенов на растениях, поражаемых органах и каллусной культуре. Причем сроки оценки устойчивости растений с начала опыта могут занимать длительный период, связанный как с онтогенезом растений, так и с периодом вегетации. Например, возбудители твердой и пыльной головни пшеницы развиваются в растениях бессимптомно вплоть до формирования у них генеративных органов, что
приводит к полному уничтожению потенциального урожая с инфицированных участков. Отсутствие симптомов болезней на растениях вызывает трудности не только в изучении физиологии взаимодействия растений с этими патогенами, но и в поиске новых средств защиты против них. Кроме возбудителей головни проблемными патогенами в современном растениеводстве на пшенице являются различные возбудители болезней, проявляющиеся в период вегетации растений. До сих пор наиболее эффективным, но, в то же время, экологически небезопасным методом защиты от патогенов, является обработка семян различными протравителями, а посевов - фунгицидами.
Для решения проблем селекции зерновых культур на устойчивость к патогенам уже давно используются каллусные культуры, растущие на фоне культурального фильтрата грибов [2, 7, 15]. Сведений о результатах совместного культивировании каллусов злаковых с грибными фитопатогенами в литературе очень мало. Одна из известных нам работ - исследование Kaur с соавторами [11], получившими совместную культуру каллуса пшеницы с возбудителем карнальской (индийской) головни.
Салициловая кислота (СК) и препараты хитоолигосахариды (ХОС) являются признанными индукторами устойчивости растений [4, 6, 12, 13, 17], с чем, в частности, связывают реализацию индуцированной системной приобретенной устойчивости [14, 16]. Можно полагать, что повышение устойчивости растений, предобработанных СК и ХОС, связано с индукцией в них накопления Н2О2 [3, 8]. Воздействие этих соединений на устойчивость растений и каллусов пшеницы к ряду патогенов почти не исследовано.
Цель этой работы - анализ полученных нами в лаборатории данных по формированию совместных культур клеток и тканей пшеницы с наиболее вредоносными болезнями.
Объекты и методы исследования
В качестве эксплантов для получения каллусов использовали незрелые зародыши пшеницы Triticum aestivum L. сорта Жница и пшеницы T. timopheevii Zhuk. (образец К-58666 из коллекции Всесоюзного НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, С-Петербург). Зародыши пшеницы изолировали через 12-15 сут после начала цветения растений из сформировавшихся зерновок. Изолированные зародыши высаживали на среду Мурасиге и Скуга (МС) и культивировали при 26°С в темноте. Через 30 сут образовавшиеся каллусы весом 200±10 мг пересаживали на свежую питательную среду MC без фитогормонов.
Для получения совместной культуры каллусов пшеницы и возбудителей головневых грибов каллусы спустя 3 сут после 2-го пассажа инфицировали телиоспорами грибов T. caries Tul. или U. tritici Jens. Инфекционная нагрузка на каждый из исследуемых каллусов составила по 80-100 телиоспор грибов. В случае T. caries для инициации прорастания спор, инфицированные каллусы культивировали при температуре 10-12°С в течение 3 сут, после чего каллусы культивировали при комнатной температуре. В случае U. tritici это не требовалось. Морфологическую оценку совместных культур каллусов с грибами проводили в течение 60 суток. Интенсивность развития гриба в каллусах оценивали по площади поверхности каллусов, покрытой мицелием гриба, по глубине проникновения гриба в каллус (% от диаметра каллуса) и по количеству образуемых спор.
Оценку развития септориоза проводили на отрезках листьев 7-суточных проростков мягкой пшеницы сорта Жница после инокуляции суспензией пикноспор S. nodorum (106 спор/мл)
С целью повышения устойчивости растений и каллусов пшеницы к возбудителям грибных болезней использовали препарат 0,1 мг/л ХОС (М.м. 7,5 кД, степень ацетилирования 65 %), 0,05 мМ СК.
Генерацию Н2О2 в растениях и каллусах пшеницы оценивали по количеству клеток,
окрашенных 3,3-диаминобензидином (ДАБ). Для этого растительный материал переносили в раствор ДАБ (1,5 мг/мл) с добавлением 2,5 мМ щавелевой кислоты по методикам, приведенным в работах [9, 10, 18].
Результаты и обсуждение
Споры T. caries и U. tritici прорастали исключительно на участках рыхлого каллуса (рис. 1 а, г). Мицелий грибов рос не только по поверхности каллусов, но и в межклеточных пространствах рыхло расположенных паренхимоподобных клеток (рис. 1 б, д), однако плотные участки каллусов и ризоиды патогенами не инфицировались. Развитие грибов на участках рыхлого каллуса с большими межклетниками и предопределило, вероятно, успех в создании совместных культур каллуса пшеницы с возбудителями головневых. Через 60 сут после инокуляции в каллусах образовывались споры грибов (рис. 1 в, е). Таким образом, в созданной нами совместной культуре каллуса пшеницы с возбудителями твердой и пыльной головни прослежен полный цикл развития грибов от прорастания спор до образования новых спор.
Нами была оценена устойчивость каллусов образца T. timopheevii, иммунного к возбудителю твердой головни, и каллусов мягкой восприимчивой пшеницы сорта Жница к грибу T. caries. Обнаружено различие в скорости роста гриба в каллусах этих образцов пшеницы. Так, в каллусах восприимчивого образца споры начинали прорастать через 5 сут после инокуляции, а в каллусах иммунного образца - через 12 суток. Более того, глубина проникновения гриба в каллусы иммунного образца в ходе инфицирования была заметно меньшей, чем в каллусы восприимчивого сорта (табл.).
Аналогичные результаты были получены и при анализе развития на каллусах воздушного мицелия T. caries (см. табл.). Медленное развитие гриба T. caries в каллусах T. timopheevii завершалось образованием небольшого количества спор в отличие от восприимчивого образца (рис. 2).
Нами установлено, что в каллусах не только восприимчивого, но и иммунного образцов пшеницы возбудитель твердой головни проходит полный цикл развития вплоть до образования спор. Это говорит об организменном уровне организации защиты растений пшеницы от головневых. Однако, в связи с тем, что скорость роста гриба T. caries в каллусах восприимчивой пшеницы в ходе совместного культивирования значительно превышала таковую в каллусах иммунной, данная модель может быть использована для сравнительной оценки устойчивости образцов этой культуры к головневым.
Важно подчеркнуть, что по количеству паренхимоподобных клеток, генерирующих Н2О2, инфицированные каллусы восприимчивого и иммунного образцов пшеницы различались. Так, если каллусы восприимчивого образца T. aestivum сорта Жница характеризовались относительно низким значением этого показателя (26% клеток), то у каллусов иммунного образца пшеницы T. timopheevii К-58666 он составил 38% клеток. Следовательно, полученные результаты обнаруживают некую аналогию в развитии ответных реакций у клеток паренхимы нативных растений и подобных им клеток каллусов пшеницы.
' ?- тч
/ГЙЦ —Л '* д J
I к .
цт \
Cj- •
е
Рис. 1. Рост и развитие U. tritici (a-в) и T. caries (г-е) на каллусах T. aestivum сорта Жница: а, г - прорастание спор, 10 сут после инокуляции; б, д -распространение грибов по межклетникам паренхимоподобных клеток, 30 сут после инокуляции; в, е - образование новых спор грибов, 60 сут после инокуляции. Окрашивание метиленовым синим. Увеличение а - х 200; б-е - х 400
Таблица
Параметры роста и развития T. caries в каллусах пшеницы в разные сроки после
инокуляции
г
б
в
Параметр роста гриба Время после инокуляции, сут Каллус T. aestivum сорт Жница Каллус T. timopheevii к-58666
Размер инфицированных зон, % к диаметру каллуса 20 14.5±1.2 11.0±0.9
40 29.3±2.0 18.4±1.2
60 51.1±3.7 22.6±1.8
Толщина воздушного мицелия, % к диаметру каллуса 20 6.6±0.6 3.8±0.7
40 10.2±1.0 8.7±0.5
60 15.7±1.3 10.2±0.8
Рис. 2. Образование спор T. caries в каллусах T. aestivum сорта Жница (а) и образца T. timopheevii К-58666 (б). 60 суток опыта, увеличение х 400
Была проведена оценка влияния СК и ХОС на устойчивость каллусов и листьев пшеницы сорта Жница, инфицированных возбудителями головни и септориоза в связи с продукцией в них Н2О2.
Введение в среду для культивирования ХОС индуцировало в каллусах ризогенез (рис. 3 I-б), что подтверждает их способность усиливать корнеобразование [5]. Культивирование каллусов на среде, содержащей СК, приводило к уменьшению их диаметра за счет увеличения числа плотных участков (рис. 3 I-в, I-д) и уменьшения рыхлых (рис. 3 I-в, I-д). Инфицирование каллусов также инициировало ризогенез. Это может быть обусловлено выявленной ранее нами способностью головневых грибов к продукции ИУК-подобных соединений [2]. Мицелий грибов рос на каллусах довольно быстро, при этом введение в среду для культивирования каллусов каждого из изучаемых нами индукторов устойчивости приводило к замедлению роста мицелия в каллусах (рис. 3, II-б, II-в, II-д).
а б в г д
Рис. 3. Влияние хитоолигосахаридов и салициловой кислоты на устойчивость каллусов T. aestivum сорта Жница, инфицированных возбудителем твердой головни T. caries (а-в) и возбудителем пыльной головни U. tritici (г, д): I - контроль, II -инфицирование; а, г - среда МС, б - МС+ХОС; в, д - МС+СК (20 сут после
инокуляции, М - мицелий грибов) В инфицированных грибом T. caries паренхимоподобных клетках каллусов, расположенных рыхло, в отличие от таковых в контроле, регистрировали генерацию Н2О2 (30% клеток). При инкубировании каллусов на среде МС в присутствии СК и ХОС и последующем инфицировании патогеном количество клеток, генерирующих Н2О2, увеличилось до 50%. Это коррелировало с подавлением роста мицелия гриба на каллусах. Таким образом, культивирование каллусов пшеницы в присутствии
индукторов устойчивости и последующее их инфицирование способствовало усилению генерации Н2О2 в паренхимоподобных клетках, подавлению роста мицелия головневых и инициированию появления не поражаемых патогенами плотных участков и ризоидов.
Анализ интенсивности генерации АФК клетками листьев пшеницы, инфицированными грибом & поёогит, показал, что в контроле генерацию ^02 обнаруживали только в зоне сосудистых пучков, а при инфицировании регистрировали и в зоне нанесения пикноспор гриба £ поёогит (рис. 4 А).
А
4 6 8 10 12 Время после заражения, сут
Б
Рис. 4. Влияние салициловой кислоты и хитоолигосахаридов на интенсивность генерации Н2О2 в листьях пшеницы T. aestivum сорта Жница, инфицированных S. nodorum: (А) 1 - контроль; 2 - S. nodorum; 3 - СК; 4 - СК+S. nodorum; 5 - ХОС; 6 -ХОС+S. nodorum. Окраска 3,3 - диаминобензидином DAB) и развитие симптомов септориоза (Б) 1 - S. nodorum, 2 - СК+S. nodorum, 3 - ХОС+S. nodorum
Предобработка индукторами устойчивости приводила к возрастанию количества клеток мезофилла, продуцирующих Н2О2. Это коррелировало с эффектом снижения в листьях степени развития симптомов септориоза (рис. 4 Б). Таким образом, продукция Н2О2 в клетках растений пшеницы, обнаруживаемая в зоне роста возбудителей грибных болезней, является одним из факторов, защищающих растения от патогенов.
Выводы
Нами разработаны и усовершенствованы методы культивирования патогенных грибов, вызывающих септориоз и головню злаковых на каллусных культурах и отрезках листьев. Показана возможность длительного совместного культивирования каллусов пшеницы с возбудителями твердой (T. caries) и пыльной головни (U. tritici). Прослежен полный цикл развития грибов от прорастания спор до формирования новых как на листьях, так и на каллусах пшеницы. Обнаружено подавление под влиянием индукторов устойчивости гипертрофированного роста каллусов, вызванного биотрофами, а также получены данные об индукции активности генерации Н2О2 в тканях растений и каллусах. Таким образом, совместные культуры клеток и тканей растений пшеницы с возбудителями грибных болезней следует рассматривать как удобную модель для скрининга защитных препаратов.
Список литературы
1. Карабаев М.К., Джардемалиев Ж.К. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы. Морфогенез и толерантность // Физиология растений. - 1994. - Т. 41, № 6. - С. 807-814.
2. Влияние твердой головни на рост проростков и каллусов пшеницы / Максимов И.В., Трошина Н.Б., Хайруллин Р.М., Сурина О.Б., Ганиев Р.М. // Физиология растений. - 2002. - Т. 49, № 5. - С. 767-772.
3. Влияние салициловой кислоты на активность пероксидазы в совместных культурах каллусов пшеницы с возбудителем твердой головни Tilletia caries (DC.) Tul. / Максимов И.В., Черепанова Е.А., Сурина О.Б., Сахабутдинова А.Р. // Физиология растений. - 2004. - Т. 51, № 4. - С. 534-540.
4. Озерецковская О.Л., Роменская И.Г. Олигосахарины как регуляторные молекулы растений // Физиология растений. - 1996. - Т. 43, № 5. - С. 843-852.
5. Поликарпова Ф.Я., Паворва А.Ю., Борисова А.А. Влияние лактата хитозана на индукцию ризогенеза в стеблевых черенках садовых культур // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. - М.: ВНИРО, 2003. - С. 108-111.
6. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. - Уфа: Гилем, 2001. - 160 с.
7. Шаяхметов И.Ф., Асфандиярова Р.Р. Влияние фитотоксичных метаболитов Bipolaris sorokiniana (Sacc.) SH. на рост каллусной ткани и регенерацию растений пшеницы // Физиология растений. - 1991. - Т. 38, № 2. - С. 399-405.
8. Alvarez M.E. Salicylic acid in the machinery of hypersensitive cell death and disease resistance // Plant Mol. Biol. - 2000. - V. 44. - P. 429-442.
9. Caliskan M., Cuming A.C. Spatial specificity of Н2О2 -generating oxalateoxidase gene expression during wheat embryo germination // Plant J. - 1998. - V. 15. - P. 165-171.
10. Ganesan V., Thomas G. Salicylic acid response in rice: influence of salicylic acid on H2O2 accumulation and oxidative stress // Plant Sci. - 2001. - V. 160. - P. 1095-1106.
11. Coculture of wheat callus and cell suspension with Neovossia indica / Kaur S., Malhotra A., Aujla S.S., Gill K.S. // Ind. J. Exp. Biol. - 1990. - V. 28. - P. 193-194.
12. Kauss H., Jeblick W. Influence of salicylic acid on the induction of competence for H2O2 elicitation. Comparison of ergosterol with other elicitors // Plant Physiol. - 1996. - V. 111. - P. 755-763.
13. Kawano T. Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction // Plant Cell Rep. - 2003. - V. 21. - P. 829-837.
14. Kawano T., Furuichi T. Salicylic acid as a defense-related plant hormone: Roles of oxidative and calcium signaling paths in salicylic acid biology // Salicylic acid: А plant Hormone / Ed. Hayat S., Ahmad A. - Springer Netherlands, 2007. - P. 277-322.
15. Plazek A., Skrzypek E., Zur I. The change of heat emission and phenolic compound level in Hordeum vulgare L. and Festuca pratensis Huds. calli treated with Bipolaris sorokiniana Sacc. Shoem. ptytotoxins // J. Agronomy and Crop Science. - 2000. - V. 184. - P. 17-21.
16. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G. Systemic acquired resistance // Plant Cell. - 1996. - V. 8. - P. 1809-1819.
17. Shakirova F.M., Sakhabutdinova A.R., Bezrukova M.V. Changes in hormonal status of wheat seedlings induced by salicylic acid and salinity // Plant Sci. - 2003. - V. 164. - P. 317-322.
18. Vierheilig H., Schweiger P., Brundrett M. An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots // Physiol. Plant. - 2005. - V. 125. -P. 393-404.
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭФФЕКТИВНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЯЧМЕНЯ (HORDEUM VULGARE L.) C ПОМОЩЬЮ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
ИВ. ТАНАСИЕНКО; А.И. ЕМЕЦ кандидат биологических наук;
Я.Б. БЛЮМ, доктор биологических наук Иинститут пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев
Введение
К наиболее широко используемым методам генетической трансформации растений относятся методы прямого переноса ДНК и Agrobacterium-опосредованная трансформация, хотя каждый из них имеет как свои недостатки, так и преимущества. Методы прямого переноса ДНК, в частности биолистическая трансформация, не явлются видоспецифичными, в то время как агробактериальная трансформация используется в основном для усовершенствования конкретных генотипов двудольных растений. Однако с момента успешной трансформации риса в 1994 г. [6] метод агробактериальной трансформации начали все шире использовать для трансформации злаковых, которые не являются такими же восприимчивыми к A. tumefaciens, как двудольные [15]. Преимущество агробактериального метода трансформации также состоит в переносе ограниченного количества вставок ДНК в геном реципиента [17] по сравнению с биолистической трансформацией, для которой характерно встраивание большого количества копий гена-«интереса» [10], что может приводить к так называемому «молчанию генов».
После получения в 1997 г. первых трансформированных фертильных растений ячменя (Hordeum vulgare L.) с помощью метода агробактериальной трансформации [15] данный метод стал успешно применяться для улучшения хозяйственных характеристик данной культуры [13]. Однако до сих пор не разработан универсальный протокол генетической трансформации ячменя, который был бы применим не только для трансформациии модельных, но и коммерческих сортов. Одна из причин, усложняющих процесс разработки подобного протокола, состоит, прежде всего, в генотипической зависимости регенерационного потенциала ячменя [9]. В связи с этим для разработки эффективной методики агробактериальной трансформации нами ранее было протестировано восемь элитных сортов ячменя, районированных на территории Украины [2].
Целью данной работы была разработка эффективного протокола агробактериальной трансформации ячменя с дополнительным использованием ультразвука и вакуум-инфильтрации.
Объекты и методы исследования
Растительный материал. В качестве эксплантов использовали зрелые зародыши семян ячменя сорта Гетьман, любезно предоставленного Институтом земледелия УААН Украины. Стерилизацию растительного материала проводили в соответствии с ранее описанной методикой [2]. Изолированные щитки ячменя высаживали на среду для индукции каллусообразования [2]. Экспланты культивировали в условиях рассеянного освещения при температуре 24-26°С и 16-часовом фотопериоде. Экспланты, достигшие размеров 0,5-0,8 см, использовали для дальнейшей трансформации.
Agrobacterium-опосредованная трансформация. Для агробактериальной трансформации использовали супервирулентный штамм A. tumefaciens EHA 105, который содержал плазмиду pBECKS.GUSint, несущую репортерный gus-ген под контролем 35S промотора. Бактерию выращивали в течение двух суток на среде LB [11] с добавлением 50 мг/л рифампицина, 100 мг/л карбенициллина и 100 мг/л
