CC BY
7
DOI: 10.37489/0235-2990-2022-67-3-4-16-22 Оригинальная статья/Original Article
Влияние рифампицина на индукцию активности MDR1/P-gp в провоспалительных макрофагах человека
Е. Н. ПАВЛОВА1, *М. В. ЕРОХИНА12, Е. Ю. РЫБАЛКИНА23,
Д. М. ПОТАШНИКОВА1, А. Г. МАСЮТИН12, Л. Н. ЛЕПЕХА2, А. Э. ЭРГЕШОВ2
1 ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова», Москва, Российская Федерация
2 ФГБНУ «Центральный НИИ туберкулёза», Москва, Российская Федерация
3 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина Минздрава России», Москва, Российская Федерация
The Effect of Rifampicin on the Induction of MDR1/P-gp Activity in Proinflammatory Human Macrophages
EKATERINA N. PAVLOVA1, *MARIA V. EROKHINA12, EKATERINA YU. RYBALKINA23, DARIA M. POTASHNIKOVA1, ALEXANDER G. MASYUTIN12, LARISA N. LEPEKHA2, ATADZHAN E. ERGESHOV2
1 Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation
2 Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russian Federation
3 National Medical Research Center of Oncology named after N.N. Blokhin of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russian Federation
Резюме
Актуальность. Влияние на активность белка множественной лекарственной устойчивости P-гликопротеина (P-gp, ген MDR1) в провоспалительных (М1) макрофагах человека рассматривается в качестве одной из перспективных стратегий повышения эффективности лечения больных туберкулёзом лёгких: активность P-gp является фактором, который может снижать внутриклеточное накопление рифампицина (RIF) — субстрата для P-gp.
Цель работы: выявить влияние терапевтической концентрации RIF на активность P-gp в М1 макрофагах человека. Поставлены задачи: определить уровни экспрессии гена MDR1, белка P-gp и его функциональной активности на разных сроках дифференцировки клеток и при действии RIF.
Материал и методы. В работе использованы следующие клеточные линии: суспензионные клетки промоно-цитарной лейкемии ТНР-1 и индуцированные по провоспалительному фенотипу форболовым эфиром макрофаги ТНР-1. Суспензионные клетки миелобластной лейкемии К562/И-9 с трансфицированным геном MDR1 использовались в качестве группы сравнения. Важным фактором является выбор экспериментальной концентрации RIF: у больных туберкулёзом лёгких средняя концентрация препарата составляет 10 мкг/мл. В работе использованы методы ОТ-ПЦР, иммуноцитохимии, проточной цитометрии.
Результаты и обсуждение. Выявлена индукция экспрессии гена MDR1 в М1-макрофагах при краткосрочном воздействии «терапевтической» концентрации RIF. Этот эффект характерен только для макрофагов ТНР-1, в которых регистрируется значительная функциональная активность P-gp. В клетках, в которых активность P-gp не выявляется (суспензионные клетки ТНР-1), такая индукция не происходит. Это свидетельствует о наличие разных механизмов влияния RIF на MDR1, что может быть использовано для разработки стратегии ингибирования P-gp в макрофагах воспаления.
Заключение. Учитывая ключевую роль макрофагов при туберкулёзе, необходима дальнейшая оценка MDR1/P-gp в операционном материале больных туберкулёзом лёгких, что позволит сделать вывод о необходимости разработки и применения лекарственных стратегий, направленный на блокировку функциональной активности P-gp и выборе более эффективных схем противотуберкулёзной терапии.
Ключевые слова: рифампицин; провоспалительныемакрофаги; MDR1; P-гликопротеин;P-gp
Для цитирования: Павлова Е. Н, Ерохина М. В., Рыбалкина Е. Ю, Поташникова Д. М, Масютин А. Г, Лепеха Л. Н, Эргешов А. Э. Влияние рифампицина на индукцию активности MDR1/P-gp в провоспалительных макрофагах человека. Антибиотики и химиотер. 2022; 67: 3-4: 16-22. doi: 10.37489/0235-2990-2022-67-3-4-16-22.
Abstract
Background. The effect on the activity of the multidrug resistance protein P-glycoprotein (P-gp, MDR1 gene) in pro-inflammatory (M1) human macrophages is considered one of the promising strategies for increasing the effectiveness of the treatment in patients with pulmonary tuberculosis: P-gp activity is considered a factor that reduces intracellular accumulation of rifampicin (RIF), a substrate for P-gp.
© Коллектив авторов, 2022 © Team of Authors, 2022
"Адрес для корреспонденции: Каширское шоссе, 24, "Correspondence to: 24 Kashirskoe highway, Moscow, Rus-НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина, г. Москва, Российская sian Federation. E-mail: [email protected] Федерация, 115522. E-mail: [email protected]
The aim of this work was to reveal the effect of the therapeutic concentration of RIF on the activity of P-gp in Ml human macrophages. The objectives were as follows: to determine the expression levels of the MDR1 gene, P-gp protein, as well as its functional activity at different periods of cell differentiation and under the influence of RIF.
Material and methods. The following cell lines were used in the work: suspension cells of promonocytic leukemia THP-1 and THP-1 macrophages induced by phorbol ether according to the pro-inflammatory phenotype. Suspension cells of myeloid leukemia K562/IS-9 transfected with the MDR1 gene were used as a comparison group. An important factor is the choice of the experimental concentration of RIF: the average concentration of the drug in patients with pulmonary tuberculosis was 10 ^g/ml. The methods of RT-PCR, immunocytochemistry, and flow cytometry were used in the work.
Results and discussion. The induction of MDR1 gene expression in Ml macrophages under short-term exposure to a therapeutic concentration of RIF was revealed. This effect is typical only for THP-1 macrophages, in which a significant functional activity of P-gp is registered. This induction does not occur in the cells with no detectable P-gp activity (THP-1 suspension cells). This indicates the presence of different mechanisms of RIF influence on MDR1, which can be used to develop a strategy for P-gp inhibition in inflammatory macrophages.
Conclusion. Given the key role of macrophages in tuberculosis, further evaluation of MDR1/P-gp in the surgical material of patients with pulmonary tuberculosis is necessary, which makes it possible to draw a conclusion that it is necessary to develop and apply drug strategies aimed at blocking the functional activity of P-gp and choosing more effective antituberculosis therapy regimens.
Keywords: proinflammatory macrophages; MDR1; P-glycoprotein; P-gp
For citation: Pavlova E. N., Erokhina M.V., Rybalkina E. Yu., Potashnikova D. M, Masyutin A. G., Lepekha L. N, Ergeshov A. E. The effect of rifampicin on the induction of MDRl/P-gp activity in proinflammatory human macrophages. Antibiotiki i Khi-mioter = Antibiotics and Chemotherapy. 2022; 67: 3-4: 16-22. doi: 10.37489/0235-2990-2022-67-3-4-16-22.
Введение
Туберкулёз лёгких входит в десятку ведущих причин смертности в мире: несмотря на успехи антибактериальной терапии, наблюдается увеличение доли его лекарственно-устойчивых форм [1]. Развитие данной тенденции ставит вопрос не только об изучении механизмов резистентности возбудителя туберкулёза и путях её преодоления, но и о повышении эффективности лечения в результате разработки новых, научно-обоснованных стратегий, направленных на организм самого больного [2]. Следует отметить, что до сих пор недостаточно изучены и учитываются в клинической практике механизмы, снижающие накопление противотуберкулёзных препаратов в области туберкулёзного воспаления за счёт активности специальных белков-экспортёров клеток организма человека. Особую роль среди таких белков-экспортёров играют «белки множественной лекарственной устойчивости» и их наиболее яркий представитель — P-гликопротеин (P-gp, кодируется геном MDR1). Изучение влияния P-gp на эффективность противотуберкулёзных препаратов рассматривается в качестве одной из перспективных организм-ориентированных стратегий, направленных на повышение эффективности лечения больных туберкулёзом [3].
В настоящее время известно не менее 300 субстратов P-gp, к которым относятся лекарственные препараты различного спектра действия, в том числе и один из основных противотуберкулёзных препаратов рифампицин (RIF) [4]. Одно из преимуществ RIF является его эффективность против внутриклеточных форм Mycobacterium tuberculosis (МБТ): его внутриклеточная концентрация может превышать внеклеточную в 4-5 раз [5].
Это является особенно актуальным при его действии на инфицированные макрофаги.
При туберкулёзе лёгких макрофаги воспаления выполняют ключевые функции, как клетки, формирующие защитную гранулёматозную реакцию, регулирующие характер воспалительного процесса и осуществляющие фагоцитоз M.tuber-culosis [6]. От их функциональной активности зависит успешность элиминации внутриклеточных форм МБТ. Изучение молекулярных и клеточных механизмов, через которые возможно терапевтически «улучшить» или изменить потенции макрофагов, в настоящее время рассматривается в качестве одной из перспективных стратегий повышения эффективности лечения больных туберкулёзом лёгких [7]. В этой связи актуальным является вопрос о влиянии RIF на экспрессию гена MDR1 и его белка P-gp в модели макрофагов человека, характеризующихся провоспалитель-ным фенотипом. При этом важным является выбор экспериментальной концентрации препарата, которая соответствует терапевтической: показано, что средняя концентрация RIF в крови и в области гранулём у больных туберкулёзом лёгких составляет 10 мкг/мл [8, 9]. Таким образом, цель данного исследования — выявить влияние терапевтической концентрации RIF на активность P-gp в провоспалительных макрофагах человека. Для реализации цели исследования поставлены задачи охарактеризовать изменение экспрессии гена MDR1, уровня P-gp на плазматической мембране клеток и его функциональной активности при разных функциональных состояниях макрофагов — в процессе их дифференцировки и при действии RIF в терапевтической концентрации. В условиях in vitro классическим индуктором макрофагальной дифференцировки яв-
ляется форболовый эфир (РМА). Ранее нами была отработана и охарактеризована модель индукции в клетках ТНР-1 активации/дифференцировки по провоспалительному типу М1 макрофагов [10]. Для изучения фенотипа макрофагов моноцитар-ные клетки человека линии ТНР-1 представляют собой удобную и широко используемую модельную систему.
Материал и методы
Клеточные линии. В работе были использованы следующие клеточные линии: 1) суспензионные клетки промо-ноцитарной лейкемии ТНР-1 (Российская коллекция клеточных культур, Санкт-Петербург) и индуцированные по провоспалительному фенотипу форболовым эфиром (PMA, 12-O-tetradecanoyl-13-phorbol myristate, Sigma, США) макрофаги ТНР-1; 2) суспензионные клетки миелобластной лейкемии K562/IS-9 с трансфицированным геном MDR1 [11] (ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России). Культивирование проводилось в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Южная Америка), 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия) при 37°С и 5% СО2. Для индукции провоспалительной макрофагальной дифференцировки клеток THP-1 использовали 100 нМ PMA, согласно методике Курыниной А. В. [10].
Схема эксперимента. Стоковая концентрация RIF (Sigma-Aldrich, США) составляла 50 мг/мл в ДМСО. Исходные клетки THP-1 культивировали с 10 мкг/мл RIF в течение 28 дней. К дифференцированным в макрофагальном направлении THP-1, добавляли 10 мкг/мл RIF через 72 ч дифференцировки и культивировали в течение 96 ч (в связи с ограниченными сроками их жизнеспособности после индукции дифференцировки). Согласно нашим ранее полученным данным, 10 мкг/мл RIF является субтоксической концентрацией для суспензионных клеток ТНР-1 и не оказывает влияние на жизнеспособность макрофагов ТНР-1 [12, 13].
ОТ-ПЦР в реальном времени. Тотальную РНК выделяли с помощью Trizol-Reagent (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoVue Plus (GE Healthcare, США). Для синтеза кДНК использовали 500 нг тотальной РНК. Обратную транскрипцию и ПЦР в реальном времени с интеркали-рующим красителем EvaGreen проводили в соответствии с протоколом производителя (все наборы реагентов Синтол, Россия). Использовали следующие последовательности праймеров (Ев-роген, Россия): MDR1: прямой — GGGATGGTCAGTGTTGATGGA, обратный — GCTATCGTGGTGGCAAACAATA, длина 110 п.н.; RPL27: прямой — ACCGCTACCCCCGCAAAGTG, обратный — CCCGTCGGGCCTTGCGTTTA, длина 198 п.н. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 Touch. Продукты ПЦР проверяли на специфичность методом кривой плавления в программном обеспечении Bio-Rad CFX Manager. Нормализацию результатов проводили по экспрессии гена RPL27. Уровень экспрессии генов оценивали по значению R = 2ла. Для каждого образца было выполнено три технических повтора.
Проточная цитометрия. Иммуноцитохимическое выявление P-gp. Использовали моноклональные мышиные антитела, конъюгированные с изотиоцианатом флуоресцина (FITC), клон 17F9 (BD Biosciences, кат. номер 557002, США), согласно протоколу производителя. Интенсивность флуоресценции представлена в виде отношения медианы интенсивности флуоресценции меченых антителами клеток к медиане интенсивности аутофлуоресценции немеченых клеток.
Оценка функциональной активности P-gp. Клетки инкубировали в течение 30 мин в RPMI-1640 без сыворотки с 5 рМ Родамим 123 (Sigma Aldrich, США) при температуре 4°C (на льду) в темноте, затем дважды отмывали в фосфатно-со-
левом буфере при температуре 4°C. Далее клетки инкубировали в среде без сыворотки 30 мин при 37°C в СО2 инкубаторе в отсутствии или присутствии 22 рМ ингибитора P-gp винбла-стина. Для оценки функциональной активности P-gp определяли фактор активности P-gp:
ФАр.8р=((МИФ1-МИФ2)/МИФ1)Х100 (%);
где: МИФ — медиана интенсивности флуоресценции клеток; МИФ1 — выброс родамина 123 в присутствии ингибитора; МИФ2 — выброс родамина 123 в культуральной среде. Интенсивность флуоресценции родамина 123 регистрировали в канале FITC.
Программное обеспечение. Интенсивность флуоресценции регистрировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) с использованием программы Cell Quest или FACSAria SORP с помощью программного обеспечения FACSDiva Software: для антител, конъюги-рованных с FITC и Родамина 123 использовали синий возбуждающий лазер (488 нм, 60 мВт) и фильтры обнаружения 530/30 нм. Записывали 30 000 событий. Каждый эксперимент был проведён в трёх независимых повторах. Для дальнейшего анализа и визуализации полученных на FACSAria SORP данных использовалось программное обеспечение Flowing Software 2.5.1.
Статистическая обработка данных. Статистический анализ полученных результатов проводился при помощи MS Excel v.16.37 или в программном пакете GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, США). Соответствие данных нормальному распределению проверяли критерием Шапиро-Уилка, для проверки равенства дисперсий — критерий Фишера. Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M±SEM). Для сравнения результатов, соответствующих нормальному распределению и с равными дисперсиями, использовали f-критерии Стьюдента или One-Way ANOVA с последующим тестом Тьюки-Крамера.
Результаты исследования
Анализ индукции экспрессии гена MDR1
Результаты ОТ-ПЦР экспериментов суммированы на рис. 1. В исходных клетках ТНР-1 уровень экспрессии гена MDR1 определяется на уровне 0,071±0,038 у. е., который является достаточно низким, по сравнению с K562/IS-9 с трансфицированным геном MDR1. Для этих клеток относительный уровень экспрессии равен 38,0±0,009 у. е.
После длительного культивирования в присутствии RIF уровень экспрессии гена MDR1 в суспензионных клетках ТНР-1 составил 0,008±0,006 у. е. Таким образом, субтоксическая концентрация RIF не только не индуцировала экспрессию гена MDR1 в суспензионных клетках ТНР-1, но и статистически значимо снижала её.
В экспериментальной модели макрофагов ТНР-1 уровень экспрессии гена MDR1 составляет 0,28±0,09 у. е. на 3-и сутки (THP1+PMA_3c) и 0,30±0,07 у. е. — на 7-е сутки (THP1+PMA_7c) дифференцировки: по сравнению с исходной суспензионной клеточной линией THP-1 уровень экспрессии гена возрастает в 4 раза (см. рис. 1).
Для того чтобы оценить влияние RIF на экспрессию гена MDR1 препарат был добавлен в среду культивирования на 3-и сутки дифференцировки: к этому сроку формируются макрофаги ТНР-1 с провоспалительными фенотипом [10].
Уровень экспрессии гена ЫВЯ1 после культивирования с ЯШ составляет 0,50±0,057 у. е. против 0,30±0,07 у. е. в контрольных клетках, и представленные различия являются статистически значимыми (р=0,02). Таким образом, инкубация макро-фагальных клеток в присутствии 10 мкг/мл ЯШ увеличивает уровень экспрессии гена ЫВЯ1 в 1,7 раза.
Иммуноцитохимическое въявление P-gp
Иммуноцитохимическое мечение антителами не выявило присутствие Р^р на плазматической мембране суспензионных клеток ТНР-1: интенсивность флуоресценции меченых антителами клеток не отличалась от немеченых. После их длительного культивирования в присутствии ЯШ уровень интенсивности флуоресценции остался на том же уровне и составил 1,3±0,05 для клеток ТНР-1 (рис. 2).
Для клеток ТНР-1 на 3-и сутки дифференци-ровки (ТНР1+РМА_3с) это соотношение составляет уже 2,235±0,265 и 2,035±0,205 — на 7-е сутки (ТНР1+РМА_7с) дифференцировки, то есть между 3- и 7-ми сутками макрофагальной дифферен-цировки не обнаруживается статистически значимых различий. Но в сравнении с исходными суспензионными клетками ТНР-1 интенсивность флуоресценции статистически значимо возрастает в 1,8-1,9 раза (р=0,049). После воздействия ЯШ (ТНР1+РМА_Риф_4с) уровень интенсивности флуоресценции составляет 2,38±0,12 (см. рис. 2). По сравнению с макрофагами на 7-й день диф-ференцировки (ТНР-1+РМА_7с) данные статистически значимо не различаются. Таким образом, увеличение экспрессии гена ЫВЯ1 в процессе дифференцировки приводит к выявлению Р^р на плазматической мембране макрофагальных клеток, но культивирование макрофагов с терапевтической концентрацией ЯШ в течение 4 сут не приводит к увеличению уровня Р^р на плазматической мембране.
Определение фактора активности Р^р
Анализ накопления родамина 123, его выброса и ингибирования винбластином показал, что после инкубации с ЯШ в течение 4 суток средние значения ФАР^р для макрофагов ТНР-1 составляют 65,5±10,24 и статистически значимо не отличаются от средних значений ФАР^р для контрольных макрофагов ТНР-1 (рис. 3, а). В присутствии 22 мкМ винбластина выброс родамина 123 полностью ингибируется, и кривые интенсивности флуоресценции выброса родамина 123 совпадают с кривыми его накопления на всех сроках дифференцировки (рис. 3, Ь). Несмотря на сравнительно невысокие уровни иммуноцито-химического выявления Р^р на плазматической мембране клеток, данный показатель свидетельствует о высокой функциональной активности Р^р в клетках ТНР-1 при их дифференцировке.
Рис. 1. Гистограмма изменения экспрессии гена MDR1 при действии RIF в суспензионных клетках и провос-палительных макрофагах THP-1. Примечание. На графике представлены средние значения относительного уровня экспрессии гена в условных единицах (у. е.) по результатам 3 экспериментов. Метод ОТ-ПЦР в реальном времени. * — статистически значимые различия при p<0,05.
Fig. 1. Histogram of changes in MDR1 gene expression under the influence of RIF in suspension cells and pro-inflammatory macrophages THP-1.
Note. The graph shows the average values of the relative level of gene expression in conventional units (c.u.) based on the results of 3 experiments. Real-time RT-PCR method. * — statistically significant differences at P<0.05.
Рис. 2. Гистограмма иммуноцитохимического выявления P-gp под действие RIF в суспензионных клетках и в провоспалительных макрофагах THP1. Примечание. На графиках представлены средние значения отношения медиан интенсивности флуоресценции окрашенных антителами клеток к медиане интенсивности неокрашенных клеток ± стандартная ошибка среднего по результатам трёх экспериментов. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Fig. 2. Histogram of immunocytochemical detection of Pgp under the influence of RIF in suspension cells and in pro-inflammatory THP1 macrophages. Note. The graphs show the mean values of the ratio of the median fluorescence intensity of antibody-stained cells to the median intensity of unstained cells ± standard error of the mean for the results of three experiments. The differences were considered statistically significant at P<0.05.
Рис. 3. Изменения функциональной активности P-gp в процессе макрофагальной дифференцировки и под воздействием RIF в клетках ТНР-1. a — гистограмма анализа OAP-gp; b — графики интенсивности накопления и выброса родамина 123. Примечание. a—на графике представлены средние значения трёх независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего. * — статистически значимые различия при p<0,05. b — cерая гистограмма — накопление и выброс родамина 123 в присутствии ингибитора P-gp винбластина 22 ^М (гистограммы совпадают на всех рисунках). Черная кривая, обозначенная стрелкой — выброс Родамина 123. По горизонтальной оси — относительная флуоресценция в канале FITC (о. е.), которая соответствует флуоресцентной эмиссии родамина 123. По вертикальной оси — число событий.
Fig. 3. Changes in the functional activity of P-gp during macrophage differentiation and under the influence of RIF in THP-1 cells. A. Histogram of FAP-gp analysis. Б. Graphs of the intensity of accumulation and release of rhodamine 123. Note. a — the graph shows the means of three independent experiments ± standard error of the mean values. * — statistically significant differences at P<0.05. b — Gray histogram — accumulation and release of rhodamine 123 in the presence of the P-gp inhibitor vinblastine 22 ^M (the histograms are the same in all figures). The black curve marked with an arrow — the release of Rhodamine 123. Horizontal axis — the relative fluorescence in the FITC channel (p.u.), which corresponds to the fluorescent emission of Rhodamine 123. Vertical axis — the number of events.
ноцитах периферической крови человека экспрессия гена MDR1 также регистрируется на очень низком уровне, но при их адгезии к субстрату и диф-ференцировке в макрофаги экспрессия гена увеличивается и на мембране клеток детектируется P-gp [14].
Как нами ранее было показано, в используемой модели макрофаги ТНР-1 характеризуются высокой экспрессией провоспали-тельных цитокинов (Il-1b, Il-6, Il-8, MCP-1) и выраженной способностью к фагоцитозу через Fc-ре-цепторы на протяжении всего срока эксперимента (до 7 сут), что является характерным для М1-макро-фагов [10]. Стабилизация функциональной активности P-gp регистрируется к 3-м сут эксперимента и совпадает с ранее полученными данными о формировании к этому сроку функционально-зрелого фенотипа макрофагов ТНР-1 и активации P-gp [10, 15]. Данный срок эксперимента был выбран для добавления RIF. Таким образом, нами выявлена индукция гена MDR1 в про-воспалительных макрофагах, уже характеризующихся высокими значениями фактора активности P-gp. Важно, что этот результат
При этом в выбранном нами дизайне эксперимента нам не удалось обнаружить повышение функциональной активности P-gp в макрофагах при действии ШЕ
Обсуждение исследования
Мы продемонстрировали индукцию экспрессии гена МОЯ1 при краткосрочном воздействии терапевтической концентрации ШЕ в макрофагах ТНР-1. Этот эффект характерен для клеток, которые уже находятся в процессе макрофагальной дифференцировки по М1-фенотипу и в них выявляется функционально-активный P-gp. В мо-
получен при действии терапевтической концентрации ШЕ которая выявляется в плазме крови и в туберкуломах лёгких [8, 9].
В тоже время мы не наблюдали аналогичного индуцирующего эффекта в исходных моноцитар-ных клетках ТНР-1, хотя известно, что в этих клетках ген МБШ характеризуется индуцибельностью при фармакологическом воздействии [16-18]. В экспериментах на мононуклеарах, выделенных из крови, и клетках лимфобластной лимфомы ССШЕ-СЕМ также было показано, что Ш1Е (25 мкМ, ~20 мкг/мл) не индуцирует экспрессию гена МОЯ1 [19]. Эти факты указывают на имеющиеся принципиальные различия в действии Ш1Е на ген МБЯ1 в миелоидных клетках и на наличие
разных молекулярных механизмов такой индукции, что может быть использовано для разработки молекулярных и клеточных стратегий воздействия на макрофаги воспаления.
Согласно имеющимся данным, область промотора гена MDRl содержит множественные сайты связывания для различных факторов транскрипции, включая Myc, Sp1, AP-1, NF-кВ и другие [20]. Одна из современных гипотез предполагает взаимодействие PXR (прегнановый Х рецептор) с областью промотора гена MDR1. PXR — ядерный рецептор, основной функцией которого является регуляция экспрессии белков, участвующих в де-токсикации и выведении ксенобиотиков из организма. Для клеток эпителиального происхождения уже продемонстрирована ведущая роль PXR в стимулировании экспрессии гена MDRl при действии RIF [21]. На клеточной линии LS174T (рак толстой кишки человека, характеризуется высокой индукцией MDRl под действием RIF) выявлены возможные варианты такой активации: RIF действует на ка-зеин-киназу 2, которая фосфорилирует белок теплового шока HSP80b. Это вызывает стабилизацию PXR, его перемещение в ядро, связывание с промотором MDR1 и запуск его транскрипции [22]. В то же время в более ранней работе на этой же линии клеток было идентифицировано, что PXR связывается не с промотором, а со сложным регуля-торным кластером примерно из 8 пар нуклеотидов, в котором ключевую роль при действии RIF играет мотив DR4 в области энхансера. Это может означать, что PXR при действии RIF способен регулировать экспрессию генов, но не запускать её [23]. Мы предполагаем, что такой механизм может как раз и объяснить те различия в индукции экспрессии гена MDR1, которые нами были выявлены: PXR индуцирует экспрессию гена MDRl только при её наличии на значимом уровне (об этом свидетельствует присутствие в клетках активного P-gp), который уже и выявляется в макрофагах.
При макрофагальной дифференцировке в клетках ТНР-1 уровень PXR значимо не возрастает, по сравнению с исходной клеточной линией, но увеличивается при действии RIF (показано для высокой концентрации препарата 100 мкг/мл) [24]. В свою очередь, ингибирование кетоконазолом PXR или его нокдаун подавляют RIF-индуцированную экспрессию MDR1 в макрофагах [24, 25]. Эти свидетельствует в пользу ги-
Литература/References
1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2G2G. Geneva: World Health Organization; (2G2G).
2. Hawn T.R., Shah J.A., Kalman D. New tricks for old dogs: countering antibiotic resistance in tuberculosis with host-directed therapeutics. Immunol Rev. 2G15; 264 (1): 344-362. doi: 10.1111/imr.12255.
3. Te Brake L.H.M., de Knegt G.J., de Steenwinkel J.E. et al. The Role of efflux pumps in tuberculosis treatment and their promise as a target in drug development: unraveling the black box. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2G18; 58: 271-291. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010617-052438.
потезы о ключевой роли PXR в индукции экспрессии гена MDR1 под действием RIF в макрофагах.
Так как RIF является субстратом для P-gp, то постоянная индукция экспрессии гена MDR1 и функциональной активности P-gp будет снижать накопление локальных концентраций RIF в макрофагах воспаления, тем самым способствуя выживаемости возбудителя. В настоящее время ряд исследователей предлагает разработать стратегию ингибирования функциональной активности P-gp в инфицированных макрофагах [3, 26]. Предполагается, что такая стратегия должна привести к повышению концентраций RIF в инфицированных M.tuberculosis макрофагах, и тем самым будет способствовать более эффективному внутриклеточному уничтожению патогена.
Заключение
Показано, что терапевтическая концентрация рифампицина индуцирует в провоспалительных макрофагах ТНР-1 экспрессию гена MDR1, и этот эффект связан с дифференцировкой клеток и появлением в них функционально-активного P-gp. Учитывая ключевую роль макрофагов в развитии и заживлении туберкулёзного воспаления, возможности персистирования в них возбудителя, необходима дальнейшая оценка MDR1 /P-gp в макрофагах воспаления, а также в операционном материале больных туберкулёзом лёгких. Эти данные позволят в дальнейшем сделать вывод о необходимости разработки и применения лекарственных стратегий, направленный на блокировку функциональной активности P-gp и выборе более эффективных схем противотуберкулёзной терапии.
Дополнительная информация
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-34-90161 Аспиранты и в рамках темы НИР «Влияние противотуберкулёзных препаратов на белки множественной лекарственной устойчивости клеток человека (МЛУ-СКМ) при туберкулёзе лёгких». Работа по цитометри-ческому анализу клеток поддержана программой развития МГУ (комплекс для клеточной сортировки на базе FACSAria SORP).
4. Kim R.B. Drugs as P-glycoprotein substrates, inhibitors, and inducers. Drug Metab Rev. 2002; 34 (1-2): 47-54. doi: 10.1081/dmr-120001389.
5. Burman W.J. The value of in vitro drug activity and pharmacokinetics in predicting the effectiveness of antimycobacterial therapy: a critical review. Am J Med Sci. 1997; 313 (6): 355-363. doi: 10.1097/00000441199706000-00008.
6. Pahari S., Kaur G., Negi S. et al. Reinforcing the functionality of mononuclear phagocyte system to control tuberculosis. Front Immunol. 2018; 9: 193. Published 2018 Feb 9. doi: 10.3389/fimmu.2018.00193.
7. Khan A., Singh V.K., Hunter R.L., Jagannath C. Macrophage heterogeneity and plasticity in tuberculosis. J Leukoc Biol. 2019: 106 (2): 275-282. doi: 10.1002/JLB.MR0318-095RR.
8. Alsultan A., Peloquin C.A. Therapeutic drug monitoring in the treatment of tuberculosis: an update [published correction appears in Drugs. 2014 Jun; 74 (9): 2061. Dosage error in article text]. Drugs. 2014; 74 (8): 839-854. doi: 10.1007/s40265-014-0222-8.
9. Prideaux B, Via L.E., Zimmerman M.D. et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 2015; 21 (10): 1223-1227. doi: 10.1038/nm.3937.
10. КурынинаАВ., Ерохина М.В., Макаревич OA, Сысоева В.Ю., Лепеха Л.Н, Кузнецов СА, Онищенко ЕЕ. Пластичность фагоцитарной активности клеток человека линии Тнр-1 при макрофагальной дифференцировке. Биохимия. 2018; 83 (3): 309-325. [KuryninaAV, Erokhina M.V., Makarevich OA., SysoevaV.Jyu, Lepekha L.N, KuznetsovSA, Onishchenko G.E. Plastichnost' fagotsitarnoj aktivnosti kletok cheloveka linii Tnr-1 pri makrotagaTnoj differ-entsirovke. Biokhimiya. 2018; 83 (3): 309-325. (in Russian)]
11. Mechetner E.B., Schott B., Morse B.S. et al. P-glycoprotein function involves conformational transitions detectable by differential immunore-activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94 (24): 12908-12913. doi: 10.1073/pnas.94.24.12908.
12. Ерохина М.В., Александрова ЕА, Прокопенко А.В, Лепеха Л.Н. и Онищенко ЕЕ. Особенности влияния рифампицина на механизмы гибели моноцитарных клеток. Туберкулёз и болезни лёгких. 2009; 11: 49-55. [Erokhina M.V, Aleksandrova EA, Prokopenko A.V., Lepekha L.N. i Onishchenko G.E. Osobennosti vliyaniya rfampitsina na mekhanizmy gibeli monot-sitarnykh kletok. Tuberkulez i Bolezni Legkikh. 2009; 11: 49-55. (in Russian)]
13. Erokhina M., Rybalkina E., Barsegyan G., Onishchenko G., Lepekha L. The Toxicity of rifampicin polylactic acid nanoparticles against Mycobacterium Bovis BCG and human macrophage THP-1 Cell Line. In IOP Conference Series: Materials Science and Engineering, 2015.
14. van de Ven R., Oerlemans R., van der Heijden J.W. et al. ABC drug transporters and immunity: novel therapeutic targets in autoimmunity and cancer. J Leukoc Biol. 2009; 86 (5): 1075-1087. doi: 10.1189/jlb.0309147.
15. Mittar D., Paramban R., Mcintyre C. Flow cytometry and high-content imaging to identify markers of monocyte-macrophage differentiation. BD Biosciences. 2011; 20.
16. Yague E., Armesilla AL., Harrison G. et al. P-glycoprotein (MDR1) expression in leukemic cells is regulated at two distinct steps, mRNA sta-
Информация об авторах
Павлова Екатерина Николаевна — аспирант биологического факультета ФГБОУ ВО «МГУ им. М. В. Ломоносова», Москва, Российская Федерация. ORCID: 0000-0001-5662-3715 Ерохина Мария Владиславовна — д. б. н., доцент, заместитель заведующего кафедрой клеточной биологии и гистологии ФГБОУ ВО «МГУ им. М. В. Ломоносова»; заведующий лабораторией клеточной биологии, ФГБНУ «Центральный НИИ туберкулёза», Москва, Российская Федерация. ORCID: 0000-0002-7256-4679 Рыбалкина Екатерина Юрьевна — старший научный сотрудник лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н. Н. Бло-хина» Минздрава России; старший научныйсотрудник лаборатории клеточной биологии отдела патоморфоло-гии, клеточной биологии и биохимии ФГБНУ «Центральный НИИ туберкулёза», Москва, Российская Федерация. ORCID: 0000-0002-3068-0233
Поташникова Дарья Марковна — к. б. н., старший научный сотрудник кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета ФГБОУ ВО «МГУ им. М. В. Ломоносова», Москва, Российская Федерация. ORCID: 0000-0002-0098-827X
Масютин Александр Георгиевич — научный сотрудник кафедры клеточной биологии и гистологии ФГБОУ ВО «МГУ им. М. В. Ломоносова»; научный сотрудник лаборатории клеточной биологии отдела патоморфологии, клеточной биологии и биохимии ФГБНУ «Центральный НИИ туберкулёза», Москва, Российская Федерация. ORCID: 0000-0002-8067-4261
Лепеха Лариса Николаевна — д. б. н., профессор, ФГБНУ «Центральный НИИ туберкулёза», Москва, Российская Федерация
Эргешов Атаджан Эргешович — д. м. н., профессор, директор ФГБНУ «Центральный НИИ туберкулёза», Москва, Российская Федерация. ORCID: 0000-0002-2494-9275
bilization and translational initiation. J Biol Chem. 2003; 278 (12): 10344-10352. doi: 10.1074/jbc.M211093200.
17. Carrett-Dias M, Almeida L.K., Pereira J.L. et al. Cell differentiation and the multiple drug resistance phenotype in human erythroleukemic cells. Leuk Res. 2016; 42: 13-20. doi: 10.1016/j.leukres.2016.01.008.
18. Williams M.S., AmaralF.M., Simeoni F., Somervaille T.C. A stress-responsive enhancer induces dynamic drug resistance in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 2020; 130 (3): 1217-1232. doi: 10.1172/JCI130809.
19. Manceau S., Giraud C, Decleves X. et al. Lack of P-glycoprotein induction by rifampicin and phenobarbital in human lymphocytes. Int J Pharm. 2010; 395 (1-2): 98-103. doi: 10.1016/j.ijpharm.2010.05.016.
20. LeeW-K., Frank T. Teaching an old dog new tricks: reactivated developmental signaling pathways regulate ABCB1 and chemoresistance in cancer. Cancer Drug Resistance. 2021;4 (2): 424-452. doi: 10.20517/ cdr.2020.114.
21. Magnarin M, Morelli M, Rosati A. et al. Induction of proteins involved in multidrug resistance (P-glycoprotein, MRP1, MRP2, LRP) and of CYP 3A4 by rifampicin in LLC-PK1 cells. Eur J Pharmacol. 2004;483 (1): 19-28. doi: 10.1016/j.ejphar.2003.10.010.
22. Kim S.W., Hasanuzzaman M, Cho M. et al. Casein Kinase 2 (CK2)-medi-ated Phosphorylation of Hsp90p as a Novel Mechanism of Rifampin-in-duced MDR1 Expression. J Biol Chem. 2015; 290 (27): 17029-17040. doi: 10.1074/jbc.M114.624106.
23. Geick A, Eichelbaum M, Burk O. Nuclear receptor response elements mediate induction of intestinal MDR1 by rifampin. J Biol Chem. 2001; 276 (18): 14581-14587. doi: 10.1074/jbc.M010173200.
24. HasanuzzamanM, YiM, ChoM, ParvezM.M., LeeS.J., Shin J.G. Rifampin Induces Expression of P-glycoprotein on the THP1 Cell-Derived Macrophages, Causing Decrease Intramacrophage Concentration of Prothiona-mide. J Pharm Sci. 2019; 108 (9): 3106-3111. doi: 10.1016/j.xphs.2019.04.009.
25. Bhagyaraj E, Tiwari D, Ahuja N. et al. A human xenobiotic nuclear receptor contributes to nonresponsiveness of Mycobacterium tuberculosis to the antituberculosis drug rifampicin. The J Biol Chem. 2018; 293 (10): 3747. doi: 10.1074/jbc.M117.818377.
26. Nasiri M.J., Haeili M., Ghazi M. et al. New insights in to the intrinsic and acquired drug resistance mechanisms in mycobacteria. Front Microbiol. 2017; 8: 681. Published 2017 Apr 25. doi: 10.3389/fmicb.2017.00681.
About the authors
Ekaterina N. Pavlova — post-graduate student of the Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation. ORCID: 0000-0001-5662-3715 Maria V Erokhina — D. Sc. in biology, Associate Professor, Lomonosov Moscow State University, Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russian Federation. ORCID: 00000002-7256-4679
Ekaterina Yu. Rybalkina — Researcher at the Laboratory of Tumor Cell Genetics, Research Institute of Carcinogenesis, National Medical Research Center of Oncology named after N. N. Blokhin of the Ministry of Health of the Russian Federation; Senior Researcher at the Laboratory of Cell Biology, Department of Pathomorphology, Cell Biology and Biochemistry, Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russian Federation. ORCID: 0000-0002-3068-0233 Daria M. Potashnikova — Ph. D. in biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation. ORCID: 0000-0002-0098-827X
Alexander G. Masyutin — Researcher at the Department of Cell Biology and Histology, Lomonosov Moscow State University; Researcher at the Laboratory of Cell Biology, Department of Pathomorphology, Cell Biology and Biochemistry, Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russian Federation. ORCID: 0000-0002-8067-4261
Larisa N. Lepekha — D. Sc. in biology, Professor, Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russian Federation
Atadzhan E. Ergeshov — D. Sc. in medicine, Professor, Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russian Federation. ORCID: 0000-0002-2494-9275
