CC BY
50
Шдицтасм иммунология ОпЫгЫНаЛЬНЫв СШОШЬи
2013, Т. 15, № 2, стр. 131-140 *
© 2013, СПб РО РААКИ
Medical Immunology 2013, Vol. 15, No 2, pp. 131-140 © 2013, SPb RAACI
влияние секреторных продуктов ткани плаценты на фенотип и активность трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток линии THP-1
Степанова О.И., Козонов Г.Р., Цицкарава Д.З., Кузьминых Т.У., Кореньков Д.А., Сельков С.А., Соколов Д.И.
ФГБУ«Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта»
СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. Пополнение пула макрофагов децидуальной ткани матки и ткани плаценты происходит в результате их трансэндотелиальной миграции из периферической крови. Тканевые макрофаги контролируют развитие плаценты, формирование иммунологической толерантности в системе мать-плод. Гестоз сопровождается повышенной миграцией мононуклеаров в децидуальную ткань и локальным воспалением. Механизмы регуляции привлечения моноцитов в децидуальную ткань и ткань плаценты недостаточно изучены. Целью исследования явилось изучение влияния факторов, секре-тируемых тканью плаценты при физиологической беременности и при беременности, осложненной гестозом, на фенотип и активность трансэндотелиальной миграции моноцитоподоБных клеток линии THP-1. При физиологической беременности интенсивность трансмиграции в присутствии секреторных продуктов плацент первого триместра была выше, чем в присутствии секреторных продуктов плацент третьего триместра и сопровождалась сниженной экспрессией CDlla клетками линии THP-1. Интенсивность трансмиграции клеток линии THP-1 была выше в присутствии секреторных продуктов плацент женщин с беременностью, осложненной гестозом, по сравнению с таковой в присутствии секреторных продуктов плацент женщин с физиологической беременностью, и сопровождалась повышенной экспрессией CDllb клетками линии THP-1. Работа выполнена при поддержке ГК № 02.740.11.0711, грантов Президента РФ № НШ-3594.2010.7 и МД-150.2011.7, Правительства Санкт-Петербурга (34/05-07/12-МУ).
Ключевые слова: плацента, гестоз, трансэндотелиальная миграция, моноцитоподобные клетки линии ТНР-1
Адрес для переписки:
Соколов Дмитрий Игоревич
д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории
иммунологии с группой по диагностике СПИД
ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии»
им. Д.О. Отта
199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3.
Тел./факс: 8(812) 328-98-50, 323-75-45.
E-mail: [email protected]
Поступила 09.10.2012 Отправлена на доработку 29.10.2012 Принята к печати 15.11.2012
Авторы:
Степанова О.И. — научный сотрудник лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД ФГБУ «НИИ акушерства и генеалогии» им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург Козонов Г.Р. — ординатор лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД ФГБУ «НИИ акушерства и гинекoлогии» им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург
Цицкарава Д.З. — ординатор лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД ФГБУ «НИИ акушерства и гинекoлогии» им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург Кузьминых Т.У. — д.м.н., заведующая родильным отделением ФГБУ «НИИ акушерства и гинекoлогии» им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург
Кореньков Д.А. — к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД ФГБУ «НИИ акушерства и гинекoлогии» им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург
Сельков С.А. — д.м.н., профессор, заведующий лабораторией иммунологии с группой по диагностике СПИД ФГБУ «НИИ акушерства и гинекoлогии» им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург Соколов Д.И. — д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД ФГБУ «НИИ акушерства и гинекoлогии» им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург
131
шдицтасм иммуюпогш Оригинальные статьи
2013, Т. 15, № 2, стр. 131-140 *
© 2013, СПб РО РААКИ
Medical Immunology 2013, Vol. 15, No 2, pp.131-140 © 2013, SPb RAACI
placental secretory factors influence to thp-1 cells phenotype and thp-1 cells transendothelial migration
Stepanova O.I., Kozonov G.R., Tsitskarava D.Z., Kuzminykh T.U., Korenkov D.A., Selkov S.A., Sokolov D.I.
D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, St. Petersburg, Russian Federation
Abstract. Decidual and placental macrophage pools are renewed due to its transendothelial monocyte migration from peripheral blood. Tissue macrophages control placental development and provide feto-maternal immunological tolerance. Preeclamptic pregnancy is accompanied by increased monocyte migration to decidual tissue and local inflammatory events. Regulatory mechanisms of monocyte recruitment to placental and decidual tissues is still unclear. Therefore we investigated the influence soluble placental factors (SPFs) during the first- and third-trimester normal pregnancy, as compared to effects of these factors in preeclamptic pregnancy. We studied biological actions of SPF upon transendothelial migration of monocyte-like THP-1 cells and their phenotypic pattern. Transendothelial migration of THP-1 cells was more intensive with first-trimester SPFs from normal pregnancy, when compared with third-trimester samples, and it was accompanied by decreased CDlla expression. SPFs from pre-eclamptic pregnancy caused an increase in transendothelial migration of THP-1 cells, as compared to SPFs from normal pregnancies, being accompanied by increased CDllb expression. The present study was supported by grants ГК № 02.740.11.0711, НШ-3594.2010.7, МД-150.2011.7 and a grant from St.-Petersburg Goverment for young scientists. (Med. Immunol., 2013, vol. 15, N 2, pp 131-140)
Keywords: placenta, preeclampsia, transendothelial migration, THP-1 cells
Address for correspondence (contact person):
Sokolov Dmitriy I.
PhD, MD, Laboratory of Immunology with an AIDS Diagnostic Group, D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology 199034, Russian Federation, St. Petersburg, Mendeleevskaya lane, 3.
Phone/fax: 7(812) 328-98-50, 323-75-45.
E-mail: [email protected]
Received 09.10.2012 Revision received 29.10.2012 Accepted 15.11.2012
Authors:
Stepanova O.I., Research Associate, Laboratory of Immunology with an AIDS Diagnostic Group,
D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology,
St. Petersburg
Kozonov G.R., Resident Physician, Laboratory of Immunology with an AIDS Diagnostic Group,
D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology,
St. Petersburg
Zizkarava D.Z., Resident Physician, Laboratory of Immunology with an AIDS Diagnostic Group,
D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology,
St. Petersburg
Kuzminykh T.U., PhD, MD, Chief, Obstetrics Department, D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology,
St. Petersburg
Korenkov D.A., PhD, Senior Research Associate, Laboratory of Immunology with an AIDS Diagnostic Group, D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology,
St. Petersburg
Selkov S.A., PhD, MD (Medicine), Professor, Chief, Laboratory of Immunology with an AIDS Diagnostic Group, D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology,
St. Petersburg
Sokolov D.I., PhD, MD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Immunology with an AIDS Diagnostic Group, D. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology,
St. Petersburg
132
2013, Т. 15, № 2 2013, Vol. 15, No 2
Трансэндотелиальная миграция THP-1 Transendothelial migration of THP-1 cells
Введение
Мононуклеарвр инфильтрирующие ткань плаценты, оказывают значительное влияние на ее развитие. Доля плацентарных макрофагов достигает 15% всех клеточных популяций ткани плаценты [26], Т- и В-клетки как в децидуальной части плаценты, так и в самой плаценте составляют минорную популяцию [10]. При физиологическом течении беременности децидуальные и плацентарные макрофаги участвуют в регуляции ангиогенеза, контролируют рост и диффе-ренцировку трофобласта, обеспечивают формирование иммунологической толлерантности. В плодовой части плаценты локализованы плацентарные макрофаги и лимфоциты плодового происхождения, в децидуальной — материнского. Количество макрофагов в эндометрии матки увеличивается перед имплантацией [23], что указывает на их роль в регуляции имплантации бластоцисты. Децидуальные макрофаги обнаруживаются в децидуальной ткани вокруг спиральных артерий матки, подвергающихся ремоделированию [6], что свидетельствует об их участии в регуляции этого процесса. Децидуальные макрофаги обладают способностью к фагоцитозу, секреции активных форм кислорода и таких цитокинов, как IFNy, IL-10 [21], IL-1, IL-6 [14], VEGF, P1GF, ангиопоэтины, MMP [6]. Децидуальные макрофаги принимают участие в регуляции формирования сосудистого русла матки при беременности и удалении апоптотических клеток. Плацентарные макрофаги секретируют M-CSF, VEGF, IL-10, IL-1, IL-6, IL-8, MCP-1 [10, 13], стимулируют рост и дифференцировку трофобласта, а также стимулируют ангиогенез в ткани плаценты [13, 17, 20]. Плацентарные макрофаги обладают фагоцитарной активностью [12] и принимают участие в удалении клеток, вошедших в апоптоз.
При беременности, осложненной гестозом, децидуальные макрофаги участвуют в развитии местного воспаления в ткани плаценты [1]. В настоящее время механизмы привлечения моноцитов в ткань плаценты и децидуальную ткань матки при физиологической беременности и механизмы развития воспаления в этих тканях при беременности, осложненной гестозом, остаются недостаточно изученными.
В регуляции миграции лимфоцитов и моноцитов в ткань плаценты и децидуальную ткань принимают участие цитокины IL-8, МСР-1 [8] и RANTES [2, 8], IL-15 [24], секретируемые децидуальными эндотелиальными клетками и тро-фобластом [11]. Кроме того миграция зависит от экспрессии эндотелиальными клетками, лимфоцитами и моноцитами поверхностных адгезионных молекул. Важную роль в процессе трансэндотелиальной миграции моноцитов играют молекулы р2-интегринов CD18/CD11a, CD18/ CD11b, которые связываются с молекулами ICAM-1(CD54) на поверхности ЭК [22].
Ранее нами было отмечено изменение экспрессии молекул CD31, CD62E, CD62P и CD54 эндотелиальными клетками под влиянием факторов, секретируемых тканью плаценты [4], однако остается неизученным изменение фенотипа моноцитов в условиях развития физиологической и патологической беременности. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение влияния факторов, секретируемых тканью плаценты в первом и третьем триместре физиологической беременности, а также при беременности, осложненной гестозом, на активность трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 и фенотип этих клеток.
Материалы и методы
Использовали плаценты, полученные при искусственном аборте у женщин с физиологическим течением беременности на сроке 9-11 недель (п = 19, группа 1); плаценты женщин, у которых беременность протекала без осложнений на сроке 38-39 недель (п = 32, группа 2); плаценты женщин с беременностью, осложненной гестозом на сроке 38-39 недель (п = 34, группа 3). Получено информированное согласие пациенток на обследование ткани плаценты. Все плаценты на сроке 38-39 недель получены при родоразрешении путем кесарева сечения. Диагноз гестоза установлен на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности — наличия протеинурии, отеков, гипертензии. Кусочки плацентарной ткани из центральной части плаценты культивировали в питательной среде DMEM/F12 (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Sigma, США) и в питательной среде DMEM/F12 без добавления ЭТС в течение 24 часов. Затем кондиционированные среды собирали и замораживали при температуре -20 °С до исследования.
Исследования проводили с использованием эндотелиальных клеток линии ЕА.Ну926, воспроизводящих основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие эндотелиальным клеткам макрососудов [9]. Для культивирования использовали среду DMEM/F12 (Sigma, США) с добавлением 10% ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина (Sigma, США) и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина («ICN», США), HAT (Sigma, США). Также в работе использовали моноцитоподобные клетки линии тнр-1.
Накануне опыта пересевали клетки линии EA.hy926. Часть полученной клеточной суспензии ресуспензировали в культуральной среде и вносили во вставки для 24-луночных планшетов с поликарбонатным фильтром (размер пор 8 мкм, BD Falkon, США) в количестве 40000 клеток на вставку, инкубировали сутки до образования конфлюэнтного монослоя при 37 °С во влаж-
133
Степанова О.И. и др. Stepanova O.I. et al.
Медицинская Иммунология Medical Immunology
ной атмосфере, 5% С02. Затем в верхнюю камеру (вставка с эндотелиальными клетками на фильтре, рис. 1) вносили клетки линии THP-1 в количестве 1 х 106 клеток в 200 мкл среды DMEM/ F12 с добавлением 10% ЭТС. В нижнюю камеру (лунка 24-луночного планшета, рис. 1) вносили 700 мкл кондиционированных сред, полученных после культивирования ткани плаценты, разведенных культуральной средой в соотношении 1:1. В качестве положительного контроля в нижнюю камеру вносили 50 Ед/мл TNFa («Рефно-лин», Латвия специфическая активность препарата 1 Ед — 0,06 нг). Затем клетки инкубировали 24 часа при 37 °С во влажной атмосфере, 5% С02, после чего оценивали количество мигрировавших в нижнюю камеру клеток линии ТНР-1 и их фенотип методом проточной цитофлуорометрии (FacsCantoII [BD, США]). Количество мигрировавших клеток оценивали в пробирках для подсчета абсолютного количества клеток True count («BD», США). При этом клетки линии ТНР-1 окрашивали моноклональными антителами против CD18, CDlla, CDllb и CD11c (BD, США) в соответствии с указаниями производителя. В качестве контроля неспецифического связывания антител использовали окрашивание клеток неспецифическими изотипическим антителами (BD, США). Статистическую обработку данных проводили в программе AtteStat 12.1.7, используя критерий Стьюдента, непараметрические критерии Манна-Уитни и Вилкоксона.
Результаты
При спонтанной трансмиграции клеток линии ТНР-1 через монослой клеток линии EA.hy926 в присутствии культуральной среды DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС в нижней камере было 2621З±47З клеток линии ТНР-1. Количество клеток линии ТНР-1 в нижней камере увеличивалось
после добавления в нее TNFa в концентрации 50 Ед/мл (5З078±7244, р < 0,01) по сравнению со спонтанным уровнем. Количество клеток линии ТНР-1 в нижней камере увеличивалось после добавления в нее кондиционированных сред плацент женщин группы 1 по сравнению со спонтанным уровнем их миграции (рис. 2). Количество клеток, мигрировавших в нижнюю камеру после внесения в нее секреторных продуктов плацент женщин группы 2 или плацент женщин группы 3 было ниже по сравнению со спонтанным уровнем (рис. 2). Интенсивность трансмиграции в присутствии в нижней камере секреторных продуктов ткани плацент женщин группы 1 была выше, чем в присутствии секреторных продуктов ткани плацент женщин группы 2 (рис. 2). При внесении в нижнюю камеру секреторных продуктов плацент женщин группы 3 интенсивность трансмиграции клеток линии ТНР-1 была выше по сравнению с интенсивностью миграции при внесении в нижнюю камеру секреторных продуктов плацент женщин группы 2 (рис. 2).
Параллельно с оценкой интенсивности миграции клеток линии ТНР-1 через монослой эндотелиальных клеток линии EA.hy926 оценивали экспрессию адгезионных молекул клетками линии ТНР-1 до и после их миграции. До внесения в верхнюю камеру клетки линии ТНР-1 конститутивно экспрессировали CD18, CDlla, CDllb и CD11c (спонтанный уровень, рис. 2).
Анализ данных, полученных при спонтанной трансэндотелиальной миграции, показал, что в верхней и нижней камерах количество клеток линии ТНР-l, экспрессирующих CD18, CDllb (рис. ЗА), и CDlla, CD11c (рис. ЗВ) было ниже по сравнению с базовым уровнем экспрессии этих молекул. Отмечено, что количество клеток линии ТНР-l, экспрессирующих CDlla и CDllb, в нижней камере было меньше, чем
Рисунок 1. Схема внесения клеток и действующих факторов в экспериментах по трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 через монослой эндотелиальных клеток линии EA.hy926
1З4
2013, Т. 15, № 2 2013, Vol. 15, No 2
Трансэндотелиальная миграция THP-1 Transendothelial migration of THP-1 cells
в верхней камере после спонтанной трансэндотелиальной миграции (рис. ЗА, В). После спонтанной миграции из верхней камеры в нижнюю интенсивность экспрессии CD18 и CDlla клетками линии ТНР-1 снижалась (рис. ЗБ, Г).
При анализе экспрессии молекул CD18, CDlla немигрировавшими клетками линии ТНР-1 в верхней камере было показано, что внесение в нижнюю камеру TNFa (50 Ед/мл) приводило к снижению количества клеток в верхней камере, экспрессирующих CD18 и CDlla, по сравнению со спонтанным уровнем (табл. 1). При анализе экспрессии CD18, CDlla мигрировавшими клетками линии ТНР-1 в нижней камере установлено, что внесение в нижнюю камеру TNFa приводило к снижению количества клеток, экспрессирующих CD18 и CDlla, по сравнению со спонтанным уровнем. Одновременно количество клеток линии ТНР-1, экспрессирующих CDllb, при добавлении TNFa в нижнюю камеру было выше по сравнению со спонтанным уровнем. При этом в присутствии TNFa интенсивность экспрессии клетками линии ТНР-1 молекул CD18, CDlla была ниже, а интенсивность экспрессии CDllb была выше по сравнению со спонтанным уровнем экспрессии клетками в нижней камере (табл. 1). Индуцированная TNFa трансэндотелиальная миграция сопровождалась снижением количества клеток линии ТНР-1, экспрессирующих CD18 и CDlla, а также снижением интенсивности экспрессии этих
молекул клетками в нижней камере по сравнению с верхней (табл. 1).
Анализ экспрессии CD18, CDlla, CDllb немигрировавшими клетками линии ТНР-1 в верхней камере показал, что внесение в нижнюю камеру кондиционированных сред, полученных после культивирования ткани плацент женщин всех исследованных групп, приводило к снижению относительного количества клеток, экспрессирующих эти адгезионные молекулы, по сравнению со спонтанным уровнем (среда DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС) (табл. 2). При этом количество клеток, экспрессирующих CD11c, было снижено только при внесении кондиционированных сред плацент женщин группы 2 и группы З по сравнению со спонтанным уровнем. Внесение в нижнюю камеру кондиционированных сред ткани плацент всех исследованных групп приводило также к снижению интенсивности экспрессии адгезионных молекул CD18, CDlla немигрировавшими клетками линии ТНР-1 в верхней камере по сравнению со спонтанным уровнем (табл. З). При этом по сравнению со спонтанным уровнем интенсивность экспрессии CDllb была ниже при внесении кондиционированных сред плацент женщин группы l (физиологическая беременность, 9-ll недель) и группы З, а интенсивность экспрессии CD11c была ниже при внесении кондиционированных сред групп 2 и З (табл. З).
Межгрупповой сравнительный анализ показал, что количество немигрировавших клеток
уровень гестоз
Рисунок 2. Относительное количество клеток линии ТНР-1, мигрировавших через монослой эндотелиальных клеток EA.hy926 в нижнюю камеру после внесения в нее культуральной среды (спонтанный уровень) или секреторных продуктов плацент исследованных групп беременных женщин
Примечание. Достоверность различий между группами: группы «9-11 недель», «38-39 недель» и «38-39 недель гестоз» отличаются от спонтанного уровня миграции в нижнюю камеру ♦♦ - p < 0,01; ♦♦♦ - p < 0,001, группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель» ¥¥¥ - p < 0,001; группа «38-39 недель» отличается от группы «38-39 недель гестоз» ф - p < 0,05.
1З5
Степанова О.И. и др. Stepanova O.I. et al.
Медицинская Иммунология Medical Immunology
А
спонтанный
уровень
□ CD18
в верхней в нижнеи камере камере
□ CD11b
с
-&
8000 р
7000 -6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 -0
f
ООО
♦♦
спонтанный уровень
□ CD18
в верхней камере
в нижней камере
□ CD11b
уровень камере □ CD11a □ CD11c
камере
5 а> 5 О
5 S'
8 *
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
О
спонтанный в верхней в нижней уровень камере камере
□ CD11a □ CD11c
Б
В
Г
Рисунок 3. Изменение экспрессии CD18, CD11a, CD11b, CD11c клетками линии THP-1 в процессе спонтанной миграции через монослой эндотелиальных клеток линии EA.hy926
Примечание. А - относительное количество клеток линии ТНР-1, экспрессирующих адгезионные молекулы CD18 и CD11b; Б -интенсивность экспрессии адгезионных молекул CD18 и CD11b на клетках линии ТНР-1; В - относительное количество клеток линии ТНР-1, экспрессирующих адгезионные молекулы CD11a и CD11c; Г - интенсивность экспрессии адгезионных молекул CD11a и CD11c клетками линии ТНР-1. Достоверность различий между группами: группы «экспрессия в верхней камере» и «экспрессия в нижней камере» отличаются от базового уровня экспресии адгезионных молекул клетками линии THP-1 ♦ - p < 0,05; ♦♦ - p < 0,01, ♦♦♦ -p < 0,001; экспрессия клетками в нижней камере отличается от экспрессии клетками в верхней камере ° - p < 0,05; 000 - p < 0,001.
линии ТНР-1 в верхней камере, экспрессирующих CDlla, было ниже при внесении в нижнюю камеру кондиционированных сред плацент женщин группы 2 по сравнению с группой
1 (табл. 2). При этом количество этих же клеток, экспрессирующих CDllb, было выше в группе 2 по сравнению с группой 1, а также выше в группе 3 по сравнению с группой 2 (табл. 2). Следует отметить, что интенсивность экспрессии немигрировавшими клетками линии ТНР-1 молекулы CD18 была выше при внесении в нижнюю камеру кондиционированных сред плацент женщин группы 2 по сравнению с группой 1 (табл. 3). При этом интенсивность экспрессии CDllb клетками линии ТНР-1 была выше при культивировании в присутствии кондиционированных сред плацент женщин группы 3 по сравнению с группой
2 (табл. 3).
Анализ экспрессии CD18, CDlla мигрировавшими клетками линии ТНР-1 в нижней камере показал, что внесение в нижнюю камеру кондиционированных сред, полученных после куль-
тивирования ткани плацент всех исследованных групп, приводило к снижению количества клеток, экспрессирующих эти адгезионные молекулы, по сравнению со спонтанным уровнем (табл. 2). При этом количество клеток, экспрессирующих CDllb и CD11c, было снижено только при внесении кондиционированных сред плацент женщин группы 2 и группы 3, по сравнению со спонтанным уровнем (табл. 3). Внесение в нижнюю камеру кондиционированных сред плацент женщин всех исследованных групп приводило также к снижению интенсивности экспрессии адгезионных молекул CD18, CDlla и CDllb мигрировавшими клетками линии ТНР-1 в нижней камере по сравнению со спонтанным уровнем (табл. 3). При этом по сравнению со спонтанным уровнем интенсивность экспрессии CDllc была ниже при внесении кондиционированных сред плацент группы 2 и группы 3 (табл. 3).
Межгрупповой сравнительный анализ показал, что количество мигрировавших клеток линии ТНР-1 в нижней камере, экспрессирующих
136
ТАБЛИЦА 1. ОТНОСИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК ЛИНИИ ТНР-1, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ CD18, CD11a,CD11b И CD11c, И ИНТЕНСИВНОСТЬ ИХ ЭКСПРЕССИИ, В ВЕРХНЕЙ И НИЖНЕЙ КАМЕРАХ ПОЛИКАРБОНАТНОЙ ВСТАВКИ ПОСЛЕ ТРАНСЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ МИГРАЦИИ
Адгезионные молекулы Относительное количество клеток линии ТНР-1 (%), экспрессирующих адгезионные молекулы, Интенсивность экспрессии адгезионных молекул клетками ТНР-1 (относительные единицы флуоресценции)
в верхней камере при внесении в нижнюю камеру в нижней камере при внесении в нижнюю камеру в верхней камере при внесении в нижнюю камеру в нижней камере при внесении в нижнюю камеру
среды DMEM/ F12 с добавлением 10% ЭТС (спонтанный уровень) TNFa, 50 Ед/мл среды DMEM/ F12 с добавлением 10% ЭТС (спонтанный уровень) TNFa, 50 Ед/мл среды DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС (спонтанный уровень) TNFa, 50 Ед/мл среды DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС (спонтанный уровень) TNFa, 50 Ед/мл
CD18 91,9±1,0 87,5±2,2* 90±1,3 76,6±2,7#* 6314±549,4 7154,4±399,3 3829,6±286,1# 2844,3±214,6#*
CD11a 78,1 ±1,9 73,9±1,9* 61,4±3,4# 32,7±6,1#* 2175±163,3 2261,3±64,5 1834,2±88,4# 1179,1 ± 125,4#*
CD11 b 31,9±4,4 36,2±5,1 25,2±3,5# 35,8±3,1 * 1507,4±200,8 1450,5±151,4 1192,2±96,5 1371,4± 108,1 *
CD11c 57,5±0,7 54,8±1,8 56,6±3,9 54,1 ±5,5 1732,5±150,8 1886,0±46,3 1882±99,5 1817,0±163,4
Примечание. Достоверность различий между группами: группа «нижняя камера» отличается от группы «верхняя камера» * - р < 0,05; группа «TNFa, 50 Ед/мл» отличается от группы «среда DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС» * - р < 0,05.
ТАБЛИЦА 2. ОТНОСИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК ЛИНИИ ТНР-1, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ АДГЕЗИОННЫЕ МОЛЕКУЛЫ CD18, CD11a, CD11b, CD11c В ВЕРХНЕЙ И НИЖНИХ КАМЕРАХ ВСТАВКИ ПОСЛЕ ИХ ИНКУБАЦИИ В ПРИСУТСТВИИ КОНДИЦИОНИРОВАННЫХ СРЕД ТКАНИ ПЛАЦЕНТ ВСЕХ ИССЛЕДОВАННЫХ ГРУПП
Адгезионные молекулы Относительное количество клеток линии ТНР-1 (%), экспрессирующих адгезионные молекулы, после инкубации
в верхней камере в нижней камере
при внесении в нижнюю камеру среды DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС (спонтанный уровень) при внесении в нижнюю камеру секреторных продуктов ткани плацент женщин при внесении в нижнюю камеру среды DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС (спонтанный уровень) при внесении в нижнюю камеру секреторных продуктов ткани плацент женщин
с физиологической беременностью (9-11 недель) (группа 1) с физиологической беременностью (39-39 недель) (группа 2) с беременностью, осложненной гесто-зом (38-39 недель) (группа 3) с физиологической беременностью (9-11 недель) (группа 1) с физиологической беременностью (39-39 недель) (группа 2) с беременностью, осложненной гестозом (38-39 недель) (группа 3)
CD18 91,9±1,0 87,9±0,5“* 86,9±0,5“* 87,4±0,4*** 90±1,3 82,310,7***“ 86,810,9***^ 87,2±0,7“*
CD11a 78,1 ±1,9 70,5±0,6“* 65,5±0,5“,¥¥¥ 66±0,5*** 61,4±3,4 55,2±2,6* 40+1 д*** ¥¥¥### 45±1,2*** ***
CD11 b 31,9±4,4 22,7±0,4“* 25,2±1,1***¥¥ 29,7±0,3“*w 25,2±3,5 23,3±0,6 16,711,1*“^* 18,6±0,7*** ***
CD11c 57,5±0,7 53,3±1,7 53,1 ±0,3*** 53,6±0,3*** 56,6±3,9 52,9±3,7 50,110,7*“** 48,7±0,6“* ***
Примечание. Достоверность различий между группами: группы «9-11 недель», «38-39 недель» и «38-39 недель гестоз» отличаются от спонтанного уровня * - р < 0,05;
*** - р < 0,001; группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель» [Т - р < 0,01;[,[Y - р < 0,001; группа «38-39 недель» отличается от группы «38-39 недель гестоз» w -р < 0,001; количество клеток в нижней камере отличается от количества клеток в верхней камере в присутствии кондиционированных сред плацент одной и той же группы * - р < 0,05; ## - р < 0,01; ### - р < 0,001.
2013, Т. 15, № 2 Трансэндотелиалъная миграция ТНР-1
2013, Vol. 15, No 2 Transendothelial migration of THP-1 cells
OJ
oo
ТАБЛИЦА 3. ИЗМЕНЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ЭКСПРЕССИИ АДГЕЗИОННЫХ МОЛЕКУЛ CD18, CD11a, CD11b, CD11c КЛЕТКАМИ ЛИНИИ ТНР-1 В ВЕРХНЕЙ И НИЖНИХ КАМЕРАХ ВСТАВКИ ПОСЛЕ ИХ ИНКУБАЦИИ В ПРИСУТСТВИИ КОНДИЦИОНИРОВАННЫХ СРЕД ТКАНИ ПЛАЦЕНТ ВСЕХ ИССЛЕДОВАННЫХ ГРУПП
Адгезионные молекулы Интенсивность экспрессии адгезионных молекул (относительные единицы флуоресценции) клетками линии ТНР-1
в верхней камере в нижней камере
при внесении в нижнюю камеру среды DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС (спонтанный уровень) при внесении в нижнюю камеру секреторных продуктов ткани плацент женщин при внесении в нижнюю камеру среды DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС (спонтанный уровень) при внесении в нижнюю камеру секреторных продуктов ткани плацент женщин
с физиологической беременностью (9-11 недель) (группа 1) с физиологической беременностью (39-39 недель) (группа 2) с беременностью, осложненной гестозом (38-39 недель) (группа 3) с физиологической беременностью (9-11 недель) (группа 1) с физиологической беременностью (39-39 недель) (группа 2) с беременностью, осложненной гестозом (38-39 недель) (группа 3)
CD18 6314±549,4 4064±105*** 5052,2±186,4*** ^ 5428± 164,3*“ 3829,6±286,1 3392,9167,3*“** 3150,31105,2*“** 3358,3193,3*“*
CD11a 2175±163,3 1698,7±26,1*** 1719±18,8*** 1775±20,1 **♦ 1834,2±88,4 1582,4±39,3“* ** 1415,9131,5*“^ 1462,9120,6*“
CD11 b 1507,4±200,8 1278,4±14,2*** 1293±51,1 1434,2±26,1 **♦ * 1192,2±96,5 902,9±19“* * 741+44 J+++ ** 793,7135,5*“***
CD11c 1732,5±150,8 1605,2±64,4 1585,8±9,5*** 1606,2± 12,9*** 1882±99,5 1829,7±58 1611,3127,7*“*** 1596,9130,6*“***
Примечание. Достоверность различий между группами: группы «9-11 недель», «38-39 недель» и «38-39 недель гестоз» отличаются от спонтанного уровня *** - р < 0,001; группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель» ггг - р < 0,001;гг - р < 0,01;г - р < 0,05; группа «38-39 недель» отличается от группы «38-39 недель гестоз»
* - р < 0,05; экспрессия в нижней камере отличается от экспрессии в верхней камере в присутствии кондиционированных сред плацент одной и той же группы # - р < 0,05;
## - р < 0,01; ### - р < 0,001.
S
О
S
н
о
Я
о
X
43
о
о
о
S
X
Ё
О
н
о
и
X
М 'С Я
* о 1
§ 3 § »
я Я
я
N *
Я я
о
Г4 о
on Я ^ Я
В >с Н * ^
ж 8 з ЯЗЯ я
I я -ь- о • ч
яз 8
е s
й я
gcg
я
о о
Я
Р
S
Я ы
S' я 3 ^ ё ё
о к Н S S * О я S Й о О)
§1
Иач
Н$8 о Я м
4 sc S
5 Н § 2 g S ч я я
5 Я Н <Т> о д
,______, S
О
N
о н
со и
S
н сг о
S СО
О
О
4^
О) ■
е
S
W
S
О
и
о
4
5 X о о
я
о
Sc
о\
о
43 со р о w S
СО рн S _
5 к
50 Я
гу Я « Р
51 Я
„я ЕЕ о
(О ^
о ч ■ я
ё
я
я
Я
ё
о
я
ч
й
я а
Я |
S я
" Я Я
* 5
о Я О о
° ~ о> “
Ч р
w о
4 Я я о
5 я я я
СО нЧ
‘ о
и w е и
о в
О й
ON S ьо
43 О w О
___ О
^ S “ S
S Р * р
4 о «
5 о S S со
о
N
о н о
S _
Iй
о Я
я
й р
§ я
а я
я Я
О Р
Ф Е *я
-ч §
4 Я
оо р
J Я
ь- й
5
я
я р
я я
Н я
“я
о Я
Н
о\
о
« со
р S
-■ W р
со со
о д
о
о
fcl
jj <П>
3 я я a
в &
S я
Я Я о
0 О О
и я X й и S
1 | S
я ^ ^
р
и S О 8
^3 о о
С -К
-Н н-н
S
и в Е S В я S и
я
я
р я
ч s
я тз
Ч О о Я
я
я яр
Я ^ •8 §
0 S
со
40 ^
1
н- О н- О
Я
S 43
р Q
й й
о S ^ 43 СО ч-
sc 5
§ g
НН ни
г g
оо 5
LJ
^ й
а> S я Я
Ч S
ч о
я ч о я
й
я
й
X
я я ч о я я
* р
о S » ц — в
оч Я й-1 ч о
и «
I S
►3
•с ^ я 2 я Я * -н а\ Я 3 Е о 2 н о й 43
U |
я я
К и a ОРЯ
я
р
и
я я я я я о я я я
§
ё
я
Е „ *
х 43 ^ р ч-л S 43 £ О О ^ »
ё ^
Е » 3 я я *2
О Я
3 Й
п СО
►е
р
и ►§
8 §
X ™
Я о о о о X Я 43 Я о Я ч О я И 43 Р >< Я « Я S
Е Е
х х
О
сп
о
CD
CD
Stepanova О.I. et al. Medical Immunology
2013, Т. 15, № 2 2013, Vol. 15, No 2
Трансэндотелиальная миграция THP-1 Transendothelial migration of THP-1 cells
ками молекулы CD54, являющейся лигандом адгезионных молекул моноцитов CDlla, CDllb, CD11c, под влиянием факторов, секретируемых тканью плаценты в третьем триместре физиологической беременности, была ниже по сравнению с экспрессией в присутствии факторов плацент первого триместра [4]. Одновременно при трансэндотелиальной миграции количество моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 в верхней камере, экспрессирующих CDlla, было ниже. Эти данные указывают на участие CD54 и CDlla в описанном ранее снижении количества моно-нуклеаров в ткани плаценты в третьем триместре беременности [12], что соответствует завершению развития ткани плаценты.
Установленное нами повышение трансэндотелиальной миграции клеток линии ТНР-1 под влиянием факторов, секретируемых тканью плаценты при гестозе, по сравнению с терминальными сроками физиологической беременности сопровождается повышенным количеством клеток линии ТНР-1 в верхней камере, экспрессирующих CDllb, а также повышенной интенсивностью экспрессии этой молекулы. Другими авторами была показана повышенная экспрессия CDlla, CDllb и CD11c на лейкоцитах периферической крови женщин с беременностью, осложненной гестозом [15, 16]. На мышиной модели показано, что активация CDllb на лейкоцитах усиливает их миграцию даже через интактный эндотелий [25]. Эти данные позволяют предположить, что повышение экспрессии CDllb лейкоцитами периферической крови и наличие градиента концентрации хемокинов является одним их механизмов развития воспаления в ткани плаценты и в децидуальной ткани при гестозе в условиях in vivo. Усиление экспрессии CDllb клетками линии ТНР-1, находящимися в верхней камере, в нашей модели может быть связано как с прямым воздействием секреторных продуктов тка-
ни плаценты (IL-6, IL-8 [3, 14]) на эти клетки, так и с индукцией этими факторами активации ЭК. Ранее отмечено, что секреторные продукты ткани плаценты при гестозе стимулируют синтез bFGF эндотелиальными клетками [5]. В присутствии провоспалительных цитокинов bFGF способен стимулировать трансэндотелиальную миграцию моноцитов [27]. Гестоз сопровождается секрецией тканью плаценты провоспалительных цитокинов TNFa, IFNy, IL-lв и повышенной по сравнению с физиологической беременностью секрецией IL-6 [3]. В таких условиях усиление секреции bFGF ЭК в присутствии факторов плацент женщин с беременностью, осложненной гестозом, может вносить вклад в развитие воспаления в ткани плаценты и в децидуальной ткани за счет привлечения моноцитов периферической крови.
Таким образом, полученные нами результаты отражают участие молекулы CDlla в механизмах привлечения моноцитов в условиях in vivo в ткань плаценты и децидуальную ткань по мере развития физиологической беременности. При беременности, осложненной гестозом, усиленная трансэндотелиальная миграция моноцитов опосредована усилением экспрессии CDllb моноцитами под влиянием факторов плацент женщин с беременностью, осложненной гестозом, что в совокупности с отмеченными ранее повышенной секрецией IL-6 тканью плаценты при гестозе и усиленной секрецией bFGF эндотелиальными клетками, способствует в условиях in vivo инициации и прогрессированию воспалительного процесса в ткани плаценты.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ ГК № 02.740.11.0711 и грантов Президента РФ № НШ-3594.2010.7 и МД-150.2011.7, гранта для молодых ученых Правительства Санкт-Петербурга (34/05-07/12-МУ).
Список литературы
1. Айламазян Э.К., Соколов Д.И., Сельков С.А. Гестоз и атеросклероз: общность патогенетических механизмов // Журнал акушерства и женских болезней. — 2009. — Т LVIII, № 1. — С. 4-15.
2. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. — СПб.: Фолиант, 2008. — 552 с.
3. Соколов Д.И., Лесничия М.В., Селютин А.В., Климова В.А., Аржанова О Н., Сельков С.А. Роль цитокинов в контроле развития плаценты в норме и при гестозе // Иммунология. — 2009. — № 1. — С. 22-27.
4. Степанова О.И., Львова Т.Ю., Пюрбеева Е.Н., Мирашвили М.И., Зайнулина М.С., Сельков С.А. , Соколов Д.И. Влияние растворимых продуктов ткани плаценты на экспрессию адгезионных молекул эндотелиальными клетками ЕА.Ну926 // Медицинская иммунология. — 2011. — Т. 16, № 6. — С. 589-596.
5. Степанова О.И., Сафронова Н.Ю., Фураева К.Н., Львова Т.Ю., Соколов Д.И., Сельков С.А. Влияние секреторных факторов плаценты на продукцию цитокинов эндотелиальными клетками // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2012. — Т. 154, № 9. — С. 361-364.
Ссылки 6-27 см. в References (стр. 140). See References for numbers 6-27 atp. 140.
References
1. Aylamazyan E.K., Sokolov D.I., Sel'kov S.A. Gestoz i ateroskleroz: obshchnost' patogeneticheskikh mekhanizmov [Eclampsia and atherosclerosis: a generality of pathogenetic mechanisms]. Zhurnal akusherstva i zhenskikh bolezney — Bulletin of Experimenental Biology and Medicine, 2009, vol. LVIII, no. 1, pp. 4-15.
139
Степанова О.И. и др. Stepanova O.I. et al.
Медицинская Иммунология Medical Immunology
2. Ketlinskiy S.A., Simbirtsev A.S. Tsitokiny [Cytokines]. St. Petersburg, Foliant — Foliant, 2008. 552p.
3. Sokolov D.I., Lesnichiya M.V., Selyutin A.V., Klimova V.A., Arzhanova О N., Sel'kov S.A. RoI' tsitokinov v kontrole razvitiya platsenty v norme i pri gestoze [The role of cytokines in the control of placental development in norm and in eclampsia]. Immunologiya — Immunology, 2009, no. 1, pp. 22-27.
4. Stepanova О.1., L'vova TYu., Pyurbeeva E.N., Mirashvili M.I., Zaynulina M.S., Sel'kov S.A. , Sokolov D.I. Vliyanie rastvorimykh produktov tkani platsenty na ekspressiyu adgezionnykh molekul endotelial'nymi kletkami EA.Hy926 [Influence of soluble placental tissue-derived molecules upon expression of adhesion molecules by EA.Hy926 endothelial cells]. Meditsinskaya immunologiya — Medical Immunology, 2011, vol. 16, no. 6, pp. 589-596.
5. Stepanova О.1., Safronova N.Yu., Furaeva K.N., L'vova TYu., Sokolov D.I., Sel'kov S.A. Vliyanie sekretornykh faktorov platsenty na produktsiyu tsitokinov endotelial'nymi kletkami [Placenta secretory factors influence on cytokines produktion by endotelial cells]. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny — Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2012, vol. 154, no. 9, pp. 361-364.
6. Cartwright J.E., Fraser R., Leslie K., Wallace A.E., James J.L. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction, 2010, vol. 140, pp. 803-813.
7. Chen Q., Stone P, Ching L.M., Chamley L. A role for interleukin-6 in spreading endothelial cell activation after phagocytosis of necrotic trophoblastic material: implications for the pathogenesis of preeclampsia. J. Pathol., 2009, vol. 217, pp. 122-130.
8. Denison F.C., Kelly R.W., Calder A.A., Riley S.C. Cytokine secretion by human fetal membranes, decidua and placenta at term. Human Reproduction, 1998, vol. 13, no. 12, pp. 3560-3565.
9. Edgell C.S., Mcdonald C.C., Graham J.B. Permanent cell line expressing human actor Vlll-related antigen established by hybridization (endothelium/somatic cell genetics/differentiated cell lines/von Willebrand factor/ hemostasis). Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1983, vol. 80, pp. 3734-3737.
10. Gomez-Lopez N., Guilbert L.J., Olson D.M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J. Leukoc. Biol., 2010, vol. 88, pp. 1-9.
11. Holtan S.G., Creedon D.J., Haluska P, Markovic S.N. Cancer and pregnancy: parallels in growth, invasion, and immune modulation and implications for cancer therapeutic agents. Mayo Clin. Proc., 2009, vol. 84, no. 11, pp. 985-1000.
12. Ingman K., Cookson V.J.K.W., Jones C.J.P, Aplin J.D. Characterisation of Hofbauer cells in first and second trimester placenta: incidence, phenotype, survival in vitro and motility. Placenta, 2010, vol. 31, pp. 535-544.
13. Khan S., Katabuchi H., Araki M., Nishimura R., Okamura H. Human villous macrophage-conditioned media enhance human trophoblast growth and differentiation in vitro. Biology of Reproduction, 2000, vol. 62, pp. 1075-1083.
14. Li C., Houser B.L., Nicotra M.L., Strominger J.L. HLA-G homodimer-induced cytokine secretion through HLA-G receptors on human decidual macrophages and natural killer cells. PNAS, 2009, vol. 106, no. 14, pp. 5767-5772.
15. Luppi P, Haluszczak C., Betters D., Richard C.A.H., Trucco M., DeLoia J.A. Monocytes are progressively activated in the circulation of pregnant women. J. Leukoc. Biol., 2002, vol. 72, pp. 874-884.
16. Mellembakken J.R., Aukrust P., Olafsen M.K., Ueland T., Hestdal K., Videm V. Activation of leukocytes during the uteroplacental passage in preeclampsia. Hypertension, 2002, vol. 39, pp. 155-160.
17. Pavlov O.V., Sel’kov S.A, Seliutin A.V, Anan’eva V.V. Secretion of tumor necrosis factor-alpha and interleukin 1 by placental macrophages in vitro during various pregnancy outcomes. Biull. Eksp. Biol. Med., 1999, vol. 128, no. 7, pp. 97-100.
18. Petreaca M.L., Yao M., Liu Y, DeFea K., Martins-Green M. Transactivation of vascular endothelial growth factor receptor-2 by interleukin-8 (IL-8/CXCL8) is required for IL-8/CXCL8-induced endothelial permeability. Molecular Biology of the Cell, 2007, vol. 18, pp. 5014-5023.
19. Schraufstatter I.U., Chung J., Burger M. IL-8 activates endothelial cell CXCRl and CXCR2 through Rho and Rac signaling pathways. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol., 2001, vol. 280, pp. L1094-L1103.
20. Seval Y, Korgun E.T., Demir R. Hofbauer cells in early human placenta: possible implications in vasculogenesis and angiogenesis. Placenta, 2007, vol. 28, pp. 841-845.
21. Singh U., Nicholson G., Urban B.C., Sargent I.L., Kishore U., LSpez Bernal A. Immunological properties of human decidual macrophages — a possible role in intrauterine immunity. Reproduction, 2005, vol. 129, pp. 631-637.
22. Smith C.W., Marlin S.D., Rothlein R., Toman C., Anderson D.C. Cooperative interactions of LFA-l and Mac-l with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest., 1989, vol. 83, pp. 2008-2017.
23. Van Mourik M.S.M., Macklon N.S., Heijnen C.J. Embryonic implantation: cytokines, adhesion molecules, and immune cells in establishing an implantation environment. J. Leukoc. Biol., 2009, vol. 85, pp. 4-19.
24. Verma S., Hiby S.E., Loke Y.W., King A.Human decidual natural killer cells express the receptor for and respond to the cytokine interleukin 15. Biology of Reproduction, 2000, vol. 62, pp. 959-968.
25. Woollard K.J., Suhartoyo A., Harris E.E., Eisenhardt S.U., Jackson S.P., Peter K., Dart A.M., Hickey M.J., Chin-Dusting J.P.F. Pathophysiological levels of soluble P-Selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-l activation. Circ. Res., 2008, vol. 103, pp. 1128-1138.
26. Yagel S., Livni N., Zacut D., Gallily R. Characterization and localization of human placental mononuclear phagocytes by monoclonal antibodies and other cell markers. Isr. J. Med. Sci., 1990, vol. 26, no. 5, pp. 243-249.
27. Zittermann S.I., Issekutz A.C. Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF, FGF-2) potentiates leukocyte recruitment to inflammation by enhancing endothelial adhesion molecule expression. Am. J. Pathol., 2006, vol. 168, pp. 835-846.
140
