CC BY
167
УДК 634.1:581.143.6
ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА РАСТЕНИЙ НА АДВЕНТИВНЫЙ ОРГАНОГЕНЕЗ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ IN VITRO
Д.Н. Сковородников, Н.В. Леонова, А.В. Озеровский, А.А. Варавка
В работе изучено влияние регуляторов роста ауксиновой и цитокининовой природы на каллусогенез и адвентивный органогенез в культуре листовых эксплантов земляники садовой in vitro.
Ключевые слова: ягодные культуры, земляника, каллусогенез, морфогенез, регуляторы роста растений.
Введение
Одним из весьма перспективных направлений интенсивно развивающейся в настоящее время сельскохозяйственной биотехнологии является клеточная селекция. Выращивание соматических тканевых культур и регенерация из них целых растений в ряде случаев позволяют получать сомакло-нальные варианты, то есть генетически измененные растения-регенеранты. Индуцированные из изолированных соматических тканей генотипы подчас сочетают ряд качественных и количественных признаков, которые очень трудно соединить в одном растении известными селекционными методами. Для успешного проведения работ по тканевой селекции необходимо, прежде всего, добиться высокой, стабильной и массовой регенерации растений in vitro [1, 2].
Цель настоящего исследования заключалась в определении оптимальных условий адвентивного органогенеза у листовых эксплантов земляники садовой.
Методика исследования
Питательная среда готовились на основе минеральной части сред Мурасиге-Скуга (МС) (Murashige & Skoog, 1962) (3). В качестве источников углеводов в питательную среду вводили сахарозу в количестве 30 г/л, а для придания среде полутвердой консистенции - агар-агар в концентрации
0,7 %.
К группе цитокининов и веществ с цитокининовой активностью изучали 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрации 2 мг/л, тидиазурон (TDZ) и ^(2-хлор-4-пиридил)-К'фенилмочевину (CPPU) в концентрациях 0.1, 0.5 и 1 мг/л. Из группы ауксинов во всех вариантах в среду вводили ß-индолилмасляную кислоту (ИМК) в концентрации 0.5 мг/л.
В качестве источников эксплантов использовали листовые пластинки от стерильных пробирочных растений земляники, которые не требовали дополнительной стерилизации. Листья скальпелем изолировали на увлажненной фильтровальной бумаге и помещали по 2 экспланта в пробирку Флоринского адаксиальной стороной к среде. Для увеличения площади поранения скальпелем срезали базальную часть листа. В течение 10 дней экспланты культивировали при низкой освещенности (200-300 лк), а затем пробирки выставляли на стеллажи с подсветкой в 2500-3000 люкс.
В течение учетного периода определяли динамику образования каллусов и адвентивных побегов. Через месяц подсчитывали частоту регенерации и количество образовавшихся побегов на экс-плант.
Результаты и обсуждения
Интенсивные исследования морфогенеза растений затруднены интегральным характером морфогенетических процессов, зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов и их взаимодействий.
В качестве источников эксплантов на землянике чаще всего используют листовые пластинки или диски, изолированные от культивируемых in vitro растений. Некоторые авторы отмечают преимущество использования листовых пластинок в сравнении с дисками, что, по-видимому, можно объяснить их более обширными повреждениями тканей [2]. Положительные результаты дает нанесение на интактную листовую пластинку нескольких надрезов по центральной жилке, что способствует увеличению частоты регенерации побегов. Причем органогенез чаще всего идет у основания жилки листа.
Поэтому в нашей работе мы придерживались двух основных принципов при изолировании эксплантов: с одной стороны осуществить поранения листовых пластинок, а с другой, уменьшить площадь повреждения тканей. Для этого мы острым скальпелем отсекали лишь небольшую (1-2 мм) базальную часть листовой пластинки, которая обладает более морфогенным потенциалом, чем апикальная часть листа.
При повреждении тканей от манипуляций инструментами, некроз тканей был отмечен спустя
3-5 дней после изолирования. Зависимости отмирания листовых эксплантов от изучаемых вариантов регуляторов роста в первые дни культивирования не наблюдалось. Однако, через три недели был отмечен некроз листовых пластинок в некоторых вариантах. Поэтому для более адекватной оценки влияния изучаемых вариантов и предотвращения токсичного воздействия на соседние листовые пластинки, такие экспланты были удалены из культуральных сосудов через неделю после изолирования.
Оставшиеся здоровые листовые пластинки уже к концу первой недели культивирования визуально увеличились в размерах и в некоторых вариантах деформировались в результате разрастания тканей, иногда наблюдалось отрывание места среза экспланта от питательной среды, что по нашему мнению может снизить эффект изучаемых регуляторов роста. Поэтому периодически культуральные сосуды открывали и проводили придавливание срезов листовых пластинок к питательной среде.
Спустя несколько недель культивирования было отмечено отмирание эксплантов. Резкое увеличение гибели эксплантов было отмечено в вариантах с самой низкой концентрацией TDZ (0,1 мг/л) и самой высокой концентрации СРРи (1 мг/л). В варианте TDZ 0,5 + ИМК 0,5 гибель первых эксплантов замечена лишь после 40 дней культивирования.
Начало каллусообразования на изолированных листовых эксплантах было отмечено спустя 19 дней культивирования эксплантов. Интенсивный каллусогенез (более 50%) наблюдался в вариантах с содержанием ВАР 2 мг/л, TDZ 0,5 мг/л, TDZ 1 мг/л и СРРи 0,1 мг/л. Слабой дедифференцировкой клеток характеризовались варианты TDZ 0,1 мг/л и СРРи 1 мг/л (табл. 1).
На основе полученных итоговых результатов, можно сделать вывод, что частота каллусообра-зования увеличилась в вариантах с ВАР 2 мг/л, TDZ 0,5 мг/л , TDZ 1 мг/л и СРРи 0,1 мг/л.
Концентрации TDZ 0,5 + ИМК 0,5 и TDZ 1 + ИМК 0,5, показали лучше результат, чем TDZ
0.1 + ИМК 0,5.
Таблица 1
Частота каллусообразования в культуре листовых эксплантов земляники садовой
Вариант Изолировано эксплантов, шт Эксплантов с калус-сом, шт Частота каллусо-обра-зования, %
1. ВАР 2 + ИМК 0,5 40 26 65
2. TDZ 0.1 + ИМК 0,5 40 0 0
3. TDZ 0.5 + ИМК 0,5 40 36 90
4. TDZ 1 + ИМК 0,5 40 34 85
5. CPPU 0.1 + ИМК 0,5 40 22 57,9
6. CPPU 0.5 + ИМК 0,5 40 12 30
7. CPPU 1 + ИМК 0,5 40 2 5,3
Утолщения в местах среза листа стали появляться через 10 дней культивирования в вариантах с более высоким концентрациями TDZ (0,5, 1 мг/л). Каллусы плотной консистенции образовывались, как правило, в местах поранений, и как исключение на неповрежденных участках. Цвет каллусов варьировал в различных оттенках зеленого в течение первого месяца культивирования, затем становился бурым вследствие накопления фенольных веществ в клетках.
Широкое распространение при регенерации адвентивных побегов из различных источников эксплантов земляники получил цитокинин пуринового ряда - 6-БАП в сочетании с различными концентрациями ауксинов (2,4-Д, ИМК, НУК) [1, 2]. В зависимости от генотипа растений, регенерация может наблюдаться и без добавления в среду ауксинов [2, 4].
Как правило, выбор оптимальных концентраций экзогенных гормонов при культивировании тканей in vitro носит случайный характер, а отсутствие стандартизированных методов среди исследователей часто способствует появлению противоречивых и невоспроизводимых результатов.
Первые меристематические очаги были отмечены в варианте с присутствием в среде в качестве источника цитокинина TDZ в концентрации 0,5-1 мг/л спустя 1 месяц после изолирования эксплантов к этому времени сформировались адвентивные почки и побеги размером 3-7 мм. В большинстве случаев регенеранты формировались в месте среза центральной жилки листа. На некоторых каллусах можно было обнаружить меристематические очаги, которые хорошо просматривались под бинокулярным микроскопом.
Образование адвентивных побегов начало проявляться спустя 30 дней культивирования эксплантов и было отмечено у вариантов ВАР 2 мг/л, TDZ 0.5 мг/л, TDZ 1 мг/л. У остальных вариантов образование адвентивных побегов не наблюдалось (табл. 2).
Таблица 2
Частота регенерации побегов (36 дня культивирования)___________________
Вариант Изолировано Количество экс- Частота регене- Количество по-
эксплантов, шт. плантов с побегами, шт. рации, % чек на эксплант, шт.
ВАР 2 + ИМК 0,5 40 2 5 3,0
TDZ 0.1 + ИМК 0,5 40 0 0 0
TDZ 0.5 + ИМК 0,5 40 8 20 2,5
TDZ 1 + ИМК 0,5 40 6 15 2,7
CPPU 0.1 + ИМК 0,5 40 0 0 0
CPPU 0.5 + ИМК 0,5 40 0 0 0
CPPU 1 + ИМК 0,5 40 0 0 0
Анализ данных таблицы показал, что варианты TDZ 0,5 мг/л и TDZ 1 мг/л дали лучшие результаты образования адвентивных побегов, у которых частота регенерации составила 20 % и 15% соответственно. Контрольный вариант ВАР 2 имел частоту регенерации в 5%. В остальных результатах органогенез отмечен не был.
Выводы
1. Максимальной способностью к каллусогенезу обладали экспланты культивируемые на питательных средах в присутствии с высокими концентрациями тидиазурона (0,5-1 мг/л); промежуточное положение занимали варианты с различными концентрациями CPPU; минимальное количество образовавшихся каллусов было отмечено в контрольном варианте (6-БАП + ИМК);
2. Для индукции образования адвентивных побегов культивировать изолированные листовые экспланты использовать тидиазурон в концентрации 0,5 мг/л в сочетании с ИМК 0,5 мг/л.
The article studies effects of auxins and cytokinins on callusogenesis and organogenesis in leaf explants of strawberry cultivated in vitro.
The key words: berry cultures, callusogenesis, morphogenesis, plant growth regulators
Список литературы
1. Расторгуев, С.Л. Регенерация растений из изолированных соматических тканей земляники и малины / Расторгуев С.Л. // Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур: метод. рекомендации. Мичуринск, 1996. С. 40-61.
2. Хамукова, Ф.Н. Регенерация растений земляники и малины из эксплантов различного происхождения: автореф. дис. ... канд. с.-х. наук. / Хамукова, Ф.Н.М., 1996. 16 с.
3. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений. /Тиссера Б. // В кн.: Биотехнология растений: культура клеток. М., 1989. С. 97-127.
4. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / Mu-rashige T., Skoog F.// Physiol. Plant. 1962. V. 15, № 13. P. 473-497.
5. Debnath S.C., Strawberry culture in vitro: applications in genetic transformation and biotechnology / S.C. Debnath, J.A. Teixeira da Silva // Fruit, Vegetable and cereal science and biotechnology, 1(1), Global Science Books 2007.P. 1-12.
Об авторах
Сковородников Д.Н. - кандидат сельско-хозяйственных наук, доцент ФГОУ ВПО Брянская государственная сельскохозяйственная академия, 241050, г. Брянск, пр-т Ст.-Димитрова, 106-70, skovorodnikov d@mail.ru, т. 8-920-05-26-37
Озеровский А.В. - кандидат сельско-хозяйственных наук, ФГОУ ВПО Брянская государственная сельскохозяйственная академия, 243365, Брянская обл., Выгоничский р-н, с. Кокино, ул. Советская 2а, т. 8-919-191-53-42
Леонова Н.В. кандидат сельско-хозяйственных наук, доцент ФГОУ ВПО Брянская государственная сельскохозяйственная академия, 241050, г. Брянск, пр-т Ст.-Димитрова, 106-70, т. 89208462186
Варавка А.А. - аспирант ФГБОУ ВПО Брянская государственная сельскохозяйственная академия, 243365, Брянская обл., Выгоничский р-н, с. Кокино, ул. Советская 5а, т. 8-950-697-31-57.
INFLUENCE OF PLANTS GROWTH REGULATORS ON ORGANOGENESIS OF STRAWBERRY IN VITRO
D.N. Skovorodnikov, A.V. Ozerovsky, N.V. Leonova, A.A. Varavka
