Индукция каллусогенеза in vitro у листовых эксплантов малины Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

*УДК - 634.711:581.143.6 ^

ИНДУКЦИЯ КАЛЛУСОГЕНЕЗА IN VITRO У ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ МАЛИНЫ

Д.Н. Челяев, Д.Н. Сковородников

В работе показано влияние регуляторов роста ауксиновой и цитокининовой природы, а также условий освещенности на каллусогенез в культуре листовых эксплантов малины in vitro.

Ключевые слова: ягодные культуры, малина, каллусогенез, морфогенез, регуляторы ростарастений.

Введение

В повышении продуктивности плантаций малины, особенно в условиях ухудшающейся экологической обстановки, важную роль отводят селекционному улучшению существующих сортов. Однако процесс создания сортов традиционными методами довольно длителен. Так, на получение нового сорта малины с учетом всех этапов его формирования требуется 12-15 лет [1, с. 20].

Для оптимизации традиционного селекционного процесса необходимо активно использовать современные биотехнологические методы: клональное микроразмножение ценных генотипов, индукцию сомаклональных вариантов, клеточную и тканевую селекция на устойчивость к стрессовым факторам, получение трансгенных растений [2, с. 3].

Мощный источник генетического разнообразия в культуре in vitro - сомаклональная вариабельность, которая отмечается в соматических тканях, а также возникает при прохождении стадии длительного неорганизованного роста клеток in vitro. Это свойство позволяет вести при последующей регенерации растений ненаправленную и направленную (при использовании селективных сред) селекцию в условиях in vitro [3, с. 40]. Появление сомаклональных вариантов в первую очередь связывают с регенерацией растений из каллусных тканей или получаемых из них суспензионных культур.

Целью данного исследования было определение оптимальных условий для индукции каллусообразования на листовых пластинках и черешках малины.

Материалы и методы

Источником исходных эксплантов служили пробирочные растения элитной формы ремонтантной малины 13-118-1, культивируемые на безгормональной среде Мурасиге-Скуга (1962). В качестве эксплантов использовались листовые пластинки и черешки. Для культивирования изолированных органов в эксперименте применялась среда МС с добавлением регуляторов роста ауксиновой и цитокининовой природы: ВАР - 1мг/л, 2,4-Д - 1мг/л, CPPU + 2,4-Д + ВАР по 1мг/л, CPPU + 2,4-Д по

0,5мг/л, CPPU - 1,5мг/л + 2,4-Д - 0,5мг/л, CPPU - 1мг/л.

Скальпелем у листовых пластинок отсекали базальную часть и помещали их в чашки Петри абаксиальной стороной к среде. Культивирование осуществляли в термостате при отсутствии освещения. Через 2 недели темновой инкубации половину материала из каждого варианта выставили на свет (t°=20-22°C) с 16-часовым фотопериодом.

Результаты исследования

Через неделю после начала культивирования, в вариантах с присутствием в питательной среде цитокининов, листовые пластинки приобрели гофрированную поверхность в результате активного деления клеток. Незначительная часть эксплантов погибла в результате повреждения при изолировании, а на некоторых появились некротические пятна.

Для индукции каллусообразования, как правило, необходимо присутствие в питательной среде двух классов фитогормонов - ауксинов и цитокининов (4, с. 395). Ауксины вызывают процесс дедиффе-ренцировки клеток, а цитокинины - пролиферацию дедифференцированных клеток. В наших исследованиях, каллусогенез наблюдался при использовании изучаемых регуляторов роста, как по отдельности, так и в различном сочетании (Рис. 1). Более интенсивно каллусообразование происходило в темноте.

Характер каллусогенеза зависел от возраста исходного материала: у листьев, изолированных в базальной части побега, каллус образовывался по периферии листовой пластинки, в то время как на молодых у основания в месте среза.

Минимальная частота каллусообразования была отмечена в варианте с использованием 6-БАП в концентрации 1 мг/л. В тоже время исходные листовые пластинки имели зеленый цвет и оставались жизнеспособными более продолжительное время, в сравнении с другими вариантами. Тогда как в присутствии в среде 2,4-Д в концентрации 1мг/л экспланты погибли в первую очередь. На свету в присутствии ауксина каллус образовывался мелким (1-2мм).

Сочетание в среде 2,4-Д и двух синтетических аналогов цитокининов различной природы (6-1 - производное аденина и СРРи - производное дифенилмочевины) привело к более интенсивному каллусообразованию у листьев нижних ярусов, у которых оно отмечалось не только по краю, но и по поверхности листовой пластинки.

Ю

О

о

о

Ч

Ч

100,0

80,0

60,0

40,0

20,0

0,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 СК £ го 1

БАП-1мг/л 2,4Д-1мг/л CPPU-lMr/л СРРи-0,5мг/л СРРи-1,5мг/л CPPU-lMr/л

2,4Д-1мг/л 2,4Д-0,5мг/л 2,4Д-0,5мг/л

6-БАП-1мг/л

Рисунок 1. Влияние регуляторов роста и темновой инкубации на частоту каллусообразования в культуре листовых эксплантов малины

Использование сочетания CPPU и 2,4-Д привело к образованию каллусов как и в случае с одним 2,4-Д не только по краю, но и по всей поверхности эксплантов. Листовые пластинки продолжительное время оставались жизнеспособными в темноте по сравнению с экземплярами, культивируемыми на свету. Присутствие в питательной среде 2,4-Д вызывало образование рыхлого неморфогенного каллуса белого цвета.

В варианте CPPU - 1мг/л наблюдался каллусогенез в местах среза черешков, а также на самих черешках, причем на адаксиальной стороне экспланта каллус почти в 3 раза был крупнее, чем на абаксиальной.

Нами было замечено, что экспланты быстрее погибают при их частой посадке на питательную среду. Так, культивируемые 15-20 листовых пластинок в чашке Петри оставались жизнеспособными в течение большего, чем вариантах с количество эксплантов 30 и более.

Выводы

1. максимальная частота каллусообразования у малины in vitro достигается при культивировании листовых эксплантов на питательной среде MS с добавлением CPPU в концентрации 1 мг/л и CPPU в сочетании с 2,4-Д в концентрации 1,5 мг/л и 0,5 мг/л соответственно;

2. увеличению интенсивности каллусогенеза способствовало культивирование изолированных тканей в темноте;

3. характер каллусообразования зависел от возраста изолированных листовых пластинок и типа применяемого регулятора роста.

The article studies effects of auxins and cytokinins as well as lighting conditions on callusogenesis in leaf explants of raspberry cultivated in vitro.

The key words: small fruits, raspberry, callusogenesis, morphogenesis, plant growth regulators

Список литературы

1. Казаков И.В. Использование метода микроклонального размножения для ускорения селекционного процесса и производства посадочного материала малины / И.В. Казаков, С.Н. Евдокименко, В.Л. Кулагина, И.В. Денисов // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: Сб. докл. и сообщ. XVIII Мечуринских чтений. Мичуринск, 1998. - с. 20-22.

2. Кашин В.И. Перспективы использования биотехнологических приемов в создании новых высокоадаптивных форм плодовых и ягодных растений / В.И. Кашин, В.А. Высоцкий // Использование

шотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: Сб. докл. и сообщ. Мечуринскихчтений. Мичуринск, 1998. - с. 3-8.

3. Расторгуев С.Л. Регенерация растений из изолированных соматических тканей земляники и малины / С.Л. Расторгуев // Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур (Метод. реком.) Мичуринск, 1996. - с. 40-61.

4. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений. Под ред. Третьякова Н.Н. - 2-е изд. М.: КолосС, 2005. - 656с.

Об авторах

Челяев Д.Н. - аспирант Брянской государственной сельскохозяйственной академии,

chelavev@rambler.ru

Сковородников Д.Н. - кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Брянской государственной сельскохозяйственной академии, 8коуого^1коу d@mail.ru,