CC BY
223
УДК 633.66:34.31.33
ОСОБЕННОСТИ КАЛЛУСОГЕНЕЗА И РЕГЕНЕРАЦИИ STEVIA REBAUDIANA (BERTONI) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
Е.О. Колесникова, Т.П.Жужжалова
Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы имени АЛ. Мазлумова, Россия, 396030, Воронежская область, пос. ВНИИСС, д.86
E-mail: biotechnologiya@mail.ru
Изучена возможность индукции каллусогенеза и регенерации побегов стевии из недифференцированной ткани. Показано влияние экзогенных гормонов, генотипа, эксплантов и длительности их культивирования на процессы формирования каллуса и образования микроклонов.
Ключевые слова: Stevia rebaudiana, культура in vitro, каллусогенез, регенерация, гормоны, генотип, эксплант.
Введение
Интродукция сахароносных культур с ценными пищевыми и лекарственными свойствами привлекает большое внимание в связи с ежегодным увеличением количества людей с проблемой сахарного диабета и ожирения. Наиболее перспективна в этом отношении стевия (Stevia rebaudiana Bertoni), сладость которой определяется комплексом дитерпеновых гликозидов (стевиозид, ре-баудиозиды А, В, С, Д, Е и др.), содержащихся во всех надземных органах [1,2].
Успех интродукции стевии определяется способностью растений адаптироваться к новым условиям. В связи с этим необходима работа по созданию сортов с адаптивными свойствами для возделывания в ЦЧР. Стевия - преимущественно вегетативно размножаемая культура, в связи, с чем ей необходима дополнительная изменчивость для формирования базы отбора. При создании селекционного материала в этом случае целесообразно применять биотехнологические методы увеличения генетического разнообразия.
Важным резервом получения исходного материала является сомаклональная изменчивость, спектр которой затрагивает как структуру ДНК, так и структуру кариотипа, без переноса чужеродных геномов [3]. Эта изменчивость основана на спонтанных мутациях, возникающих в выращиваемой in vitro каллусной ткани, из которой регенерируют растения. При этом у сома-клонов обнаруживаются варианты, превосходящие исходные сорта по хозяйственно ценным признакам [4,5]. Сомаклональная изменчивость даёт возможность расширить генетическое разнообразие и получить в культуре in vitro ценные генотипы растений, ускоряя, таким образом, селекционный процесс. В связи с этим актуальным является выявление условий, способствующих активному образованию каллуса, морфогенезу и увеличению частоты изменчивости получаемых регенерантов стевии.
Объекты и методы исследования
В качестве объектов исследований были использованы 4 генотипа различной плоидно-сти из коллекции стевии: №о (диплоид) - контроль, №19 (диплоид), №37 (триплоид), №28 (тетраплоид).
Для индукции каллусогенеза и последующей регенерации побегов было приготовлено 50 вариантов питательных сред MS (РН=5.8-6.о) с добавлением гормонов: 6-БАП, ИУК, ГК, 2,4Д в концентрациях от 0.01 до 4 мг/л в различных сочетаниях. Культивирование эксплантов проводилось на свету при 16-ти часовом фотопериоде, при температуре 23-26 °С, освещённости 5 тыс. люкс и влажности воздуха 70%.
В качестве эксплантов были использованы части стебля и листа стевии. Каллусы культивировались в течение 1, 2, 3 пассажей и т. д. в течение года на одной и той же среде, а также на среде для регенерации побегов.
Опыты проводились в трёхкратной повторности по 20 эксплантов на вариант. Всего было введено более 1500 эксплантов. Математическая обработка данных была проведена по Б.А. Доспехову [6], с использованием компьютерных программ.
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований показали, что лимитирующим фактором образования каллуса из специализированных клеток стевии являлось наличие в питательной среде фитогормонов, главным образом ауксинов и цитокининов. На безгормональной среде у экс-плантов не наблюдалось процессов каллусогенеза и регенерации, что связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению.
Присутствие в составе питательной среды от 0,05 мг/л до 1 мг/л ауксина 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 Д) способствовало 100%-му каллусогенезу как стеблевых, так и листовых эксплантов. Высокие концентрации 2,4 Д вызывали образование бежевых рыхлых структур, состоящих из сильно оводненных клеток, легко распадающихся на отдельные агрегаты. Со временем при старении у каллусов появлялась коричневая окраска, обусловленная накоплением в них фенолов (рис. 1).
А Б
Рис. 1. Неморфогенный каллус стевии: А - через 3 месяца; В - через 7 месяцев культивирования
На среде, содержащей 0.5 мг/л 2,4 Д происходило образование светлого каллуса средней плотности с зелёными меристематическими очагами (рис. 2), из 18.8% которых регенерировали витрифицированные побеги (по 2 шт.)
Рис. 2. Каллус с морфогенными очагами на питательной среде, включающей 2,4 Д
Низкая концентрация 2,4 Д (0,05 мг/л) вызывала в культуре каллусных тканей корневой органогенез с частотой 25,0 %.
При добавлении в питательную среду только цитокинина 6-бензиламинопурина (6-БАП) в концентрации от 0.2 мг/л до 1 мг/л частота каллусообразования и регенерации (чаще прямой) составила лишь 12.5-18.8%. Объём каллусов превышал размер исходных эксплантов не более чем в 2 раза. Это свидетельствовало о том, что эндогенного уровня ауксинов стебля и листа стевии оказалось не достаточно для эффективного образования неорганизованной пролиферирующей ткани.
Введение в среду с цитокинином ауксина (3-индолиуксусной кислоты) в соотношении 1:1 вызывало 100% образование зелёного каллуса, имеющего плотную глобулярную структуру, развивающегося со средней интенсивностью. Регенерация при этом происходила редко (18.8%). При соотношении данных гормонов 1:3, частота регенерации увеличивалась до 39.0%. Высокие концентрации ИУК (2-4 мг/л) вызывали при 100%-м каллусогенезе прекращение регенерации побегов.
На данном этапе исследований наиболее эффективной питательной средой для 100%-го образования каллуса, склонного к морфогенезу, оказалась среда №27, включающая ауксин,
цитокинин и гиббереллин в невысоких концентрациях. Неорганизованная масса клеток при этом была компактной, имела зелёный цвет и мелкоглобулярную структуру. Регенерация происходила с частотой 53.7 % (рис. 3).
А
Б
Рис. 3. Формирование на среде № 27 каллусных структур (А) и микроклонов из каллуса стевии (Б)
Положительное влияние гиббереллина на образование морфогенного каллуса, способного к регенерации, очевидно связано со способностью этого вещества стимулировать рост зачатков стебля [7].
При использовании на среде №27 в качестве эксплантов верхней части стебля, у стевии наблюдался 100% каллусогенез и максимальный процент регенерации, что согласуется с литературными данными о том, что формирование каллусной ткани и успешную регенерацию растений можно получать из различных вегетативных органов, являющихся меристематически активными [8]. При культивировании средней части стебля каллусогенез происходил на 40%, а регенерация - на 33.7% реже, чем из верхней части. У эксплантов из нижней части стебля каллусогенез составил лишь 20%, а регенерации не наблюдалось вообще (рис. 4).
Было установлено, что кроме состава питательной среды на процессы каллусо-генеза и регенерации побегов стевии, оказывали влияние генотипические различия. Изучаемые сортообразцы формировали каллус (100 %) на средах 27, 45, 46 (рис. 5).
Однако регенерация побегов происходила по-разному. На оптимальной для регенерации побегов из каллуса питательной среде (№27) хорошие результаты показали диплоидные и триплоидные сортообразцы № 0 - 53.7%, № 19 - 53.3%, № 37 - 56.7% (стеблевые экспланты). У тетраплоидного № 28 образовали побеги только 27.5% каллусов из стеблевых эксплантов.
На питательной среде, содержащей БАП и ИМК (5:1), каллусы из стеблевых эксплантов сортообразцов №№ 0,19 и 37 регенерировали с частотой 15%, 12.5% и 20.0%, соответственно. У № 28 на данной среде не наблюдалось образования побегов из каллусов ни у стеблевых, ни у листовых эксплантов. На среде № 45 регенерации из каллусов не наблюдалось ни у одного сортообразца.
На частоту регенерации и изменчивость микроклонов стевии также оказывала влияние длительность культивирования каллуса. При этом во время первого пассажа (3 месяца) количество
Верхняя часть Средняя часть Нижняя часть Часть стебля
□ Каллусогенез □ Регенерация из каллуса
Рис. 4. Каллусогенез и регенерация стевии в зависимости от экспланта НСР05(каллусогенез)=6,5; НСР05(регенерация)=8,9
регенерирующих каллусов составило 53.7%. Во втором и в третьем пассаже (5 и 7 месяцев) частота регенерации увеличивалась до 62.5%, далее каллусы переставали регенерировать (рис. 6).
27 45 46
Номер варианта питательной среды □ о стебель Шо лист □ 19 стебель Ш19 лист ■ 37 стебель Ш37 лист □ 28 стебель НСР05=5,7; НСР05(факторА)=2,02; НСР05(фактор В)=2,33; НСР05(факторС)=1,б5
Рис. 5. Регенерация побегов из каллуса на разных питательных средах в зависимости от генотипа
регенерация морфологические изменения
число пассажей
1
2
3
4
Рис. 6. Частота регенерации и количество регенерантов с видимыми изменениями в зависимости от числа пассажей
Подсчёт видимых морфологических изменений (очередное, мутовчатое листорасположение, неправильная форма или раздвоение листа) после каждого пассажа показал, что с увеличением времени культивирования каллусов увеличивалось количество изменённых растений. Так после первого пассажа наблюдалось 20 % таких растений. После второго пассажа их
было 30%, а после третьего - 6о% (рис. 6, 7). При этом длительное культивирование каллуса повышало частоту регенерации на 8.8% (до третьего пассажа), а частоту изменённых растений - на 10-30%.
Рис. 7. Микроклоны с морфологическими изменениями: А - растение с неправильными листорасположением и формой листа (при черенковании), Б - микроклон стевии с очередным листорасположением (в пробирке)
Б
К сожалению не все морфологические изменения окажутся результирующими. Поэто- му требуется выявление в дальнейшем тех признаков, которые определяют продуктивность стевии.
Из полученных сомаклональных вариантов путём микроклонирования были сформированы линии, отличающиеся наибольшей интенсивностью роста и развития. Они подлежат изучению по количеству ядерной ДНК, оценке морфологического развития в условиях закрытого и открытого грунта, а также выявлению наследуемости изменений в последующих поколениях.
Заключение
В ходе проведённых исследований была выявлена возможность получения растений-регенерантов стевии из каллуса. Процессы каллусообразования и регенерации определялись качественным и количественным содержанием гормонов в питательной среде, генотипом, типом эксплантов и длительностью их культивирования. Состав питательной среды, включаю- щий MS-основу и гормоны 6-БАП, ИМК и ГК, при культивировании эксплантов из верхней части стебля в течение 2-3-х пассажей обеспечивали loo %-ный каллусогенез и максимальную частоту регенерации стевии.
Для увеличения генетической изменчивости сомаклонов стевии необходимо продолжать работу по подбору оптимальных факторов, способствующих повышению эффективности образования морфогенного каллуса, склонного к регенерации в течение нескольких пассажей.
Список литературы
1. Frohne D. Systematik des Planzenreichs / D. Frohne, U. Jensen. - Stuttgart, l992. - 25.
2. Tanaka O. Chemistry of Stevia rebaudiana Bertoni - New source of natural sweeteners // Resent Adv. Nat. Prod. Res. - l98o. - Vol. l. - P. lll-ll9.
3. Расторгуев С.Л. Изменчивость растений-регенерантов земляники, полученных методом тканевых культур // Вопросы современной науки и практики. Университет им. В.И. Вернадского. - 2008. -
№l(ll), Том 2. - С. 46 - 47.
4. Чеченева Т.Н. Изменчивость злаков в культуре in vitro и в процессе регенерации растений // Физиология и биохимия культурных растений. - 2006. - 38, №2. - С. 16з-171.
5. Щербатенко И.С. Биотехнологические методы конструирования и отбора вирусоустойчивых форм растений // Микробиологический журнал. - l993. - Т. 55, №l. - С. 89-l0l.
6. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - М.: МГУ. - 1985. - 268 с.
7. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. - М.: Высш. шк., 1998. - 416 с.
8. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. - Киев: Наукова думка, 1990.280 с.
PECULIARITIES OF STEVIA REBAUDIANA (BERTONI) CALLUS FORMATION AND REGENERATION UNDER IN VITRO CULTURE
E.O. Kolesnikova, T.P. Zhuzhzhalova
The A.L. Mazlumov All-Russian Re- search Institute of Sugar Beet, Ramon, 86, Voronezh Region, 396030, Russia
E-mail: biotechnologiya@mail.ru
Possibility of inducing callus formation and regeneration of shoots from undifferentiated tissue in stevia has been studied. Influence of ex- ogenous hormones, genotype, expiants and duration of their cultivation on the processes of callus formation and development of microclones is shown.
Key words: Stevia rebaudiana, in vitro culture, callus formation, regeneration, hormones, genotype, explant.
