CC BY
122
6. Kirichenko, N. G. Pastbischa pustyn' Kazahstana [Tekst] / N. G. Kirichenko. - Alma-Ata: "Nauka" KazSSR, 1980. - 276 р.
7. Lavrenko, E. M. Stepi Evrazii [Tekst] / E. M. Lavrenko, Z. V. Karamysheva, R. I. Nikulina. -L.: Nauka, 1991. - 146 р.
8. Malysheva, G. S. Rastitel'nost' melovyh obnazhenij nacional'nogo parka "Hvalynskij" [Tekst]/ G. S. Malysheva, P. D. Malahovskij // Povolzhskij jekologicheskij zhurnal. - 2011. - №2. -Р. 223-230.
9. Opyt i strategiya zaschitnogo lesorazvedeniya v pravoberezh'e Srednego Dona Volgogradskoj oblasti [Tekst] / A. T. Barabanov, A. S. Manaenkov, A. I. Uzolin, A. V. Kulik // Niva Povolzh'ya. - № 4(45). - 2017. - 17-23 р.
10. Resursy biosfery pustyn' Srednej Azii i Kazahstana [Tekst] / Pod red. N. T. Nechaevoj. -M.: Nauka, 1984. - 192 р.
11. Rozhkov, V. A. Metody izucheniya kornevyh sistema rastenij v pole i laboratorii [Tekst] : ucheb. - metodich. posobie / V. A. Rozhkov, I. V. Kuznecova, H. R. Rahmatulloev. - M.: GOU VPO MGUL, 2008. - 51 р.
12. Cherepanov, S. K. Sosudistye rasteniya Rossii i sopredel'nyh gosudarstv [Tekst] / S. K. Cherepanov. - SPb.: Mir i sem'ya, 1995. - 990 р.
13. Jekosistemy i blagosostoyanie cheloveka: opustynivanie [Tekst] / Doklad mezhdunarodnoj programmy: Ocenka jekosistem na poroge tysyacheletiya/ Institut mirovyh resursov. - Vashington, okrug Kolumbiya. - 2005. - 36 р.
E-mail: [email protected]
УДК 634.723:631.535
ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ
РАЗМНОЖЕНИИ СМОРОДИНЫ ЧЕРНОЙ
EFFECT OF GROWTH REGULATORS FOR MICROCLONAL BREEDING OF BLACK CURRANT
Л.В. Григорьева1, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Н.А. Куликова2, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент О.Г. Гиченкова2, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
1 2 2 L.V. Grigor'eva , H.A. Kulikova , O.G. Gichenkova
1ФГБОУ ВО «Мичуринский государственный аграрный университет» 2Волгоградский государственный аграрный университет
1FGBOU VO «Michurinsk State Agrarian University» 2Volgograd State Agrarian University
Одним из разделов биотехнологии является клеточная инженерия, занимающаяся выделением и культивированием тканей и клеток животных и растительных организмов. Растения, в отличие от животных, не теряют своей способности реализовывать генетическую информацию, сохраняют свою информацию в ядре. Растительная клетка способна дать начало новому идентичному организму, что является основой многих методов генетики. Одним из методов размножения растений является микроклональное размножение - способ вегетативного размножения в условиях in-vitro. В отличие от клонирования растения черенками, почками или клубнями, размножение растения «в пробирке» имеет ряд преимуществ, что влияет на выбор метода размножения растения. В статье рассмотрены вопросы, связанные с использованием синтетических регуляторов роста из группы ауксинов и цитокининов на всех этапах микроклонального размножения смородины черной.
One of the sections of biotechnology is cellular engineering, which is engaged in the extraction and cultivation of tissues and cells of animals and plant organisms. Plants, unlike animals, do not lose their ability to realize genetic information, preserving their information in the nucleus. The plant cell is able to give rise to a new identical organism, which is the basis of many methods of genetics. One of the methods of plant reproduction is microclonal reproduction - a method of vegetative repro-
duction in conditions of in-vitro. Unlike cloning plants cuttings, buds and tubers, propagation of plants "in vitro" has a number of advantages that increasingly influences the choice of method of plant propagation. The article deals with the issues related to the use of synthetic growth regulators from the group of auxins and cytokinins at all stages of microclonal reproduction of black currant.
Ключевые слова, клеточная инженерия, микроклональное размножение, смородина черная, сорта, регуляторы роста, ауксины, цитокинины.
Keywords: cell engineering, microclonal reproduction, black currant, varieties, growth regulators, auxins, cytokinins.
Введение. Всевозможные методы клеточной инженерии дают возможность получать ткани или даже целые организмы из отдельных клеток как растительных, так и животных. Одним из таких методов является клонирование, означающее для групп растений получение идентичных организмов от одного растения-производителя вегетативным способом.
Клонирование позволяет сохранить редкие и исчезающие виды растений, сократить продолжительность селекционного процесса, использовать высокий коэффициент размножения, ускорить процесс перехода от ювенильной до репродуктивной фазы, получить экономически эффективный результат, провести работы в течение года и освободить растения от различных заболеваний (вирусных, грибных или бактериальных) за счёт использования меристемной культуры [6].
Растительный организм как объект клонирования выбран неслучайно. он больше всех поражается вирусными заболеваниями. Получить безвирусное растение возможно двумя способами, из верхушечных почек с апикальным доминированием, не успевших заразиться вирусом от старых клеток, и введением гена вируса в плазмиду бактерии c целью размножения и дальнейшего введения оболочки вируса в растение для получения антигена от вирусных заболеваний [4, 5].
Используя растительный организм, мы имеем следующие преимущества над животными клетками, дифференциация растительных клеток, позволяющая образовывать целое растение, удобство встраивания чужого гена и введения отбора на продуктивность [1].
Микроклональное размножение растений, проходящее в условиях in-vitro, имеет ряд преимуществ над другими традиционными методами вегетативного размножения за счёт уникальной способности клетки использовать присущее ей свойство тотипотентно-сти, т.е. способности клетки с помощью деления давать начало целому организму [3].
Проведение работ по разработке и усовершенствованию клонального микроразмножения на примере смородины черной (Ribes nigrum) определяет актуальность и новизну данного направления исследований.
Материалы и методы. Работы по изучению биологических особенностей мик-роклонального размножения Ribes nigrum в условиях in-vitro проводились в период с 2014 по 2017 гг. в лаборатории биотехнологии растений на базе ГБУ ВО «Волгоградский региональный ботанический сад».
Объектами исследований являлись следующие сорта смородины черной. «Тамерлан», «Шалунья», «Кармелита» селекции ВНИИС им. И.В. Мичурина.
Основной целью работы было определение влияния регуляторов роста на корне-образование смородины при микроклональном размножении.
Исследования проводились согласно общепринятым классическим методикам по культивированию клеток и разработке питательных сред.
Растительный материал культивировался в лаборатории, оборудованной стеллажами с освещением от 1200 до 2000 лк. Расстояние от светильников до края лабораторной посуды было равно 40 см. Соблюдался 16-часовой световой и 8-часовой темновой периоды, при температуре 23 - 26оС и относительной влажности воздуха 70 %.
ИЗВЕСТИЯ"
№ 3 (51), 2018
Исследования проводились согласно общепринятым классическим методикам в трехкратной повторности с десятью вариантами (10 пробирок) в каждой повторности.
Подготовительным этапом являлся подбор элитного растительного материала 23-х летнего возраста без инфекционных признаков для получения стартового стерильного материала. Следующим этапом было введение экспланта в культуру т^Ито на питательную среду с базовым сбалансированным составом по содержанию макро- и микроэлементов, органических соединений и витаминов, для перехода растительных клеток из одной стадии в другую - в стадию роста тканей экспланта. Собственно размножение происходило на последующих этапах, где получали максимальное количество побегов, их удлинение и укоренение. На последней стадии микрорастения переносили в тепличные условия для их акклиматизации.
Стерилизация посуды, инструментов, материалов проводилась в специальном помещении. В микробиологическом боксе стерилизовали экспланты с помощью хлор-содержащего агента Лизоформин-3000 (действующее вещество - глутаровый альдегид, глиоксаль и дидецилдиметиламмоний хлорид) и раствором бытовой белизны с различной временной экспозицией. Микрочеренки, подготовленные с помощью скальпеля, подвергали ступенчатой стерилизации: 1) промывание в слабом мыльном растворе в течение 15 минут; 2) промывание в проточной воде в течение 2,5 часов; 3) стерилизация 95 % раствором этанола в течение 30 секунд; 4) ополаскивание в стерильной дистиллированной воде; 5) стерилизация раствором лизоформина и белизны (разная концентрация и экспозиция); 6) промывание в стерильной дистиллированной воде.
Результаты и обсуждение. На рисунке 1 представлены данные по выходу жизнеспособных эксплантов черной смородины в зависимости от концентрации агента и экспозиции.
90
80
-г 70
л -
я
я
4 С
и И
0
01
х
\в о и о с
и и К
5
60
50
40
30
20
В Тамерлан ® Шалунья ЕЭ Кармелита
10
0
1 2 3 4 5
Рисунок 1 - Зависимость жизнеспособности эксплантов черной смородины от режимов стерилизации (2014-2017 гг), %
1 - лизоформин 3 %, 3 минуты; 2 - лизоформин 3 %, 5 минут;
3 - лизоформин 5 %, 3 минуты; 4 - белизна 35 %, 10 минут; 5 - белизна 35 %, 15 минут
По результатам данных на рисунке 1 видно, что наиболее эффективным режимом стерилизации является 3 % раствор лизоформина с продолжительностью действия 5 минут, где выход жизнеспособных эксплантов составил от 68 % у сорта Тамерлан и до 78 % у сорта Камерлита. В пределах 45-51 % жизнеспособных эксплантов наблюдалось при обработке раствором белизны в течение 10-15 минут, что является самым низким результатом.
Питательные среды, применяемые для культивирования клеток, условно разделяют на две группы: для травянистых и древесных растений. В наших опытах использовались следующие среды для выращивания эксплантов:
1. Питательная среда Мурасиге-Скуга (MS0), созданная физиологами растений Т. Мурасиге и Ф. К. Скугом в 1962 году. Число, стоящее после букв, обозначает концентрацию сахарозы в среде.
2. Среда Гамборга и Эвелега (среда В5), разработанная в 1968 году.
3. Питательная среда под аббревиатурой WPM (woody plant medium), которую разработали В. McCown и G. Lloyd в 1990 г.
К настоящему времени разработано много питательных сред с разным составом для культивирования клеток, но точных сведений о том, какая питательная среда обеспечивает лучший рост того или иного экспланта, пока нет [8, 9, 10].
Все вышеперечисленные питательные смеси дополнялись цитокинином 6-БАП (6-бензиламинопурин или кинетин) с концентрацией 0,5 мг/л для стимулирования деления клеток.
Таблица 1 - Влияние минерального состава питательной среды на коэффициент размножения смородины черной, среднее 2014-2017 гг.
№ Название Коэффициент размножения, шт
п/п сорта М80+6-БАП 0,5 мг/л WPM+6-БАП 0,5 мг/л В5+6-БАП 0,5 мг/л
1. Тамерлан 14±0,05 4±0,01 6±0,3
2. Шалунья 16±0,3 7±0,3 8±0,4
3. Кармелита 14±0,1 6±0,2 7±0,05
Данные таблицы 1 показывают лучший рост эксплантов на среде Мурасиге-Скуга (МS0), что повлияло на выбор питательной среды для дальнейших экспериментов. С небольшой разницей наблюдался коэффициент размножения на двух других средах, где наилучшей была среда Гамборга и Эвелега (В5).
К основным группам классических гормонов относят цитокинины, поддерживающие апикальную меристему побега, и ауксины, стимулирующие рост побегов как по фототропизму, так и по гравитропизму. В наших опытах использовались два синтетических стимулятора роста из группы цитокининов: цитадеф и кинетин и одно вещество группы ауксинов - гетероауксин [2].
Для определения влияния концентрации регуляторов роста на коэффициент размножения смородины черной использовали следующие варианты сред: 6-БАП (0,5 мг/л); 6-БАП (1,0 мг/л); Цф (цитадеф) 0,5 + ИУК 0,02 мг/л (гетероауксин); ЦФ1,0 + ИУК 0,02 мг/л.
Таблица 2 - Влияние регуляторов роста в составе питательной среды
на коэффициент размножения смородины черной, среднее 2014-2017 гг.
№ Название Контроль 6-БАП 6-БАП ЦФ 0,5+ИУК ЦФ 1,0+ИУК
п/п сорта (без гормонов) 0,5 мг/л 1,0 мг/л 0,02 мг/л 0,02 мг/л
1. Тамерлан 1,7±0,4 3,5±0,1 4,5±0,3 9,0±0,4 8,5±0,1
2. Шалунья 1,6±0,2 3,0±0,1 3,5±0,2 7,5±0,3 6,0±0,4
3. Кармелита 1,7±0,5 3,8±0,3 4,0±0,1 8,2±0,3 6,8±0,1
По результатам данных таблицы 2 видно, что наибольший коэффициент размножения смородины черной по всем сортам наблюдался при совместном использовании цитокининов и ауксинов на варианте ЦФ 0,5 мг/л + ИУК 0,02 мг/л и на варианте ЦФ 1,0 мг/л + ИУК 0,02 мг/л с чуть меньшим результатом. Варианты с применением только цитокининов уступали совместным регуляторам роста, но показали наилучшие результаты в сравнении с контролем (без применения искусственных стимуляторов роста).
Укоренение размноженных побегов - важный этап микроклонального размножения, обеспечивающий адаптацию растения и успех вегетативного размножения в условиях т^Нто. На этапе укоренения использовали два вещества группы ауксинов: гетероауксин (ИУК) - С10ЩМ02 и индолил-3-масляную кислоту (ИМК) - С12Н^02, влияющие на рост клетки в зоне растяжения, стимулирующие рост камбия, регулирующие коррелятивный рост и взаимодействие отдельных органов, а также помогающие формировать придаточные корни [7].
Таблица 3 - Влияние концентрации и типа ауксинов на количество _корней сортов черной смородины, среднее 2014-2017 гг._
№ п/п Название сортов Количество корней, шт.
ИУК 1,0 мг/л ИУК 2,0 мг/л ИМК 1,0 мг/л ИМК 2,0 мг/л
1. Тамерлан 6±0,3 4±0,2 4±0,3 3±0,2
2. Шалунья 8±0,1 6±0,04 5±0,2 2±0,1
3. Кармелита 7±0,1 3±0,5 5±0,03 4±0,3
Сравнительный анализ полученных данных таблицы 3 показывает оптимальное влияние гетероауксина в концентрации 1,0 мг/л на все изучаемые сорта смородины черной. При увеличении концентрации гетероауксина дозой до 2,0 мг/л количество корней снижалось на 2 - 4 штуки. При использовании индолил-3-масляной кислоты с разной концентрацией результаты были более низкими в сравнении с применением ге-тероауксина.
Заключение. В результате исследований проводилась стерилизация эксплантов с выбором оптимальной дозы лизоформина, которая отмечалась при 3 % концентрации препарата с длительностью обработки в 5 минут.
Следующим этапом исследований был подбор оптимальной питательной среды по минеральному составу и с максимальным коэффициентом размножения всех сортов Ribes nigrum, где наилучшие результаты показала среда Мурасиге-Скуга с добавкой цитадефа в дозе 0,5 мг/л и гетероауксина в дозе 0,02 мг/л.
На момент укоренения побегов лучший вариант на всех сортах смородины черной был с добавкой гетероауксина в концентрации 1,0 мг/л.
Использование регуляторов роста, воздействующих на процессы регенерации придаточных корней у черенков смородины черной, стимулирует развитие камбия и мобилизует естественные силы растения, обеспечивая большой экономический эффект при малых затратах труда и средств.
Библиографический список
1. Астахов, А.И. Смородина черная: состояние и перспективы селекции [Текст]/А.И. Астахов // Современное состояние культур смородины и крыжовника: сб. науч. тр. ВНИИ садоводства им. И.В. Мичурина. - Мичуринск, 2007. - С. 21-31.
2. Евсеева Р.П. К вопросу о применении сочетаний фиторегуляторов в культуре тканей плодовых растений [Текст] /Р.П. Евсеева // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии: материалы 6 Междунар. конф. 26- 28.06.2001. - М., 2001.
3. Молканова, О.И. Научные основы сохранения устойчивого воспроизводства генофонда растений в культуре in vitro [Текст] /О.И. Молканова, О.Г. Васильева, Л.Н. Коновалова // Вестник Удмуртского университета. «Биология. Науки о земле». - 2015. - Вып. 2.
4. Питомниководство садовых культур [Электронный ресурс] : учеб. / Н.П. Кривко [и др.]. - Санкт-Петербург : Лань, 2015. - Режим доступа: https://eianbook.com/book/56606. - Загл. с экрана.
5. Плодоводство [Электронный ресурс] : учеб. пособие / Н.П. Кривко [и др.]. - Санкт-Петербург : Лань, 2014. - Режим доступа: https://eianbook.com/book/51724. - Загл. с экрана.
6. Паутов А.А. Размножение растений [Электронный ресурс]: учебник / А.А. Паутов. -СПб: СПбГУ, 2013. - Режим доступа: http://znanium.com/catalog/product/941413
7. Регуляторы роста растений [Текст]/ Г. С. Муромцев [и др.] ; под ред. Г. С. Муромцева. - М. : Колос, 1979. - 246 с.
8. Ходаева, В. П. Размножение сортов картофеля в культуре in vitro на различных питательных средах = Reproduction of Potato Cultivars in Vitro on Different Nutrient Media [Текст] / В. П. Ходаева, В. И. Куликова // Достижения науки и техники АПК. - 2016. - № 10. - С. 66-68.
9. Черемисин, А.И. Влияние состава питательной среды при микроклональном размножении сортов и гибридов картофеля [Текст] / А.И. Черемисин, В.Н. Кумпан // Вестник Омского государственного аграрного университета. - 2017. - № 4. - С. 87-90.
10. Шумихин, С.А. Оптимизация питательной среды при микроклональном размножении георгины культурной [Текст] / С.А. Шумихин // Вестник Пермского университета. Серия Биология. - 2005. - № 6. - С. 59-63.
Referens
1. Astahov, A. I. Smorodina chernaya: sostoyanie i perspektivy selekcii [Tekst]/A. I. Astahov // Sovremennoe sostoyanie kul'tur smorodiny i kryzhovnika: sb. nauch. tr. VNII sadovodstva im. I. V. Michurina. - Michurinsk, 2007. - Р. 21-31.
2. Evseeva R. P. K voprosu o primenenii sochetanij fitoregulyatorov v kul'ture tkanej plodovyh rastenij [Tekst] /R. P. Evseeva // Regulyatory rosta i razvitiya rastenij v biotehnologii: materialy 6 Mezhdunar. konf. 26- 28.06.2001. - M., 2001.
3. Molkanova, O. I. Nauchnye osnovy sohraneniya ustojchivogo vosproizvodstva genofonda rastenij v kul'ture in vitro [Tekst] /O. I. Molkanova, O. G. Vasil'eva, L. N. Konovalova // Vestnik Udmurtskogo universiteta. "Biologiya. Nauki o zemle". - 2015. - Vyp. 2.
4. Pitomnikovodstvo sadovyh kul'tur [Jelektronnyj resurs] : ucheb. / N. P. Krivko [i dr.]. -Sankt-Peterburg : Lan', 2015. - Rezhim dostupa: https://eianbook.com/book/56606. - Zagl. s jekrana.
5. Plodovodstvo [Jelektronnyj resurs] : ucheb. posobie / N. P. Krivko [i dr.]. - Sankt-Peterburg : Lan', 2014. - Rezhim dostupa: https://eianbook.com/book/51724. - Zagl. s jekrana.
6. Pautov A. A. Razmnozhenie rastenij [Jelektronnyj resurs]: uchebnik / A. A. Pautov. - SPb: SPbGU, 2013. - Rezhim dostupa: http://znanium.com/catalog/product/941413
7. Regulyatory rosta rastenij [Tekst]/ G. S. Muromcev [i dr.] ; pod red. G. S. Muromceva. - M. : Kolos, 1979. - 246 р.
8. Hodaeva, V. P. Razmnozhenie sortov kartofelya v kul'ture in vitro na razlichnyh pitatel'nyh sredah = Reproduction of Potato Cultivars in Vitro on Different Nutrient Media [Tekst] / V. P. Hodaeva, V. I. Kulikova // Dostizheniya nauki i tehniki APK. - 2016. - № 10. - Р. 66-68.
9. Cheremisin, A. I. Vliyanie sostava pitatel'noj sredy pri mikroklonal'nom razmnozhenii sor-tov i gibridov kartofelya [Tekst] / A. I. Cheremisin, V. N. Kumpan // Vestnik Omskogo gosudarstven-nogo agrarnogo universiteta. - 2017. - № 4. - Р. 87-90.
10. Shumihin, S. A. Optimizaciya pitatel'noj sredy pri mikroklonal'nom razmnozhenii georginy kul'turnoj [Tekst] / S. A. Shumihin // Vestnik Permskogo universiteta. Seriya Biologiya. -2005. - № 6. - Р. 59-63.
E-mail: [email protected]
