CC BY
551
УДК 581.163 + 582.623.2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ДЛЯ МАССОВОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ДЕКОРАТИВНЫХ И ПЛОДОВО-ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР В БОТАНИЧЕСКОМ САДУ СГУ
Е. А. Блюднева, Т. А. Крицкая, А. С. Кашин
Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского Учебно-научный центр «Ботанический сад» 410010, г. Саратов, ул. Ак. Навашина, 1 Е-mail: kriczkaya.tatyana@mail.ru, kashinas2@yandex.ru
В культуру in vitro введены растения 29 сортов 14 видов 13 родов, принадлежащих к 3 семействам. Для каждого сорта или вида растений оптимизированы условия стерилизации эксплантов, состав питательных сред на стадиях эксплантации, микроразмножения и укоренения регенерантов. Получение посадочного материала этих форм растений на основе клонального микроразмножения доведено до стадии создания малой серии продукции.
Ключевые слова: клональное микроразмножение, получение посадочного материала растений.
THE USE OF CLONAL MICROPROPAGATION FOR MASS PRODACTION OF PLANTING MATERIAL OF ORNAMENTAL AND FRUIT CROPS IN THE BOTANICAL GARDEN OF SARATOV STATE
UNIVERSITY
E. A. Bludneva, T. A. Kritskaya, A. S. Kashin
There are 29 varieties of 14 species of 3 families introduced in the in vitro culture. It is optimized conditions of the sterilization of the explants, the composition of the culture media at the stages of explantation, microreproduction and rooting for the each varieties/species of plants. The generation of planting material of this forms of plants brought to the stage to the making a small series prodaction.
Key words: clonal micropropagation, generation of planting material.
В последние десятилетия метод клонального микроразмножения растений получил широкое распространение в России и за рубежом. В
основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реа-лизовывать присущую ей тотипотентность, то есть давать начало целому растительному организму под влиянием экзогенных воздействий (Катаева, Бутенко, 1983). Ряд преимуществ, отличающих культуру in vitro от традиционных способов вегетативного размножения растений (высокий коэффициент репродукции; ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; роспроизводство трудно размножаемых традиционными способами растений; получение оздоровленного безвирусного материала; возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала), позволил занять данному методу прочные позиции в современной биотехнологии.
процесс клонального микроразмножения принято разделять на четыре этапа: 1) выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2) собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов; 3) укоренение размноженных побегов; 4) адаптация их к почвенным условиям, выращивание растений в условиях теплицы (Бутенко, 1999).
В настоящее время опубликовано большое число работ по усовершенствованию методов клонального микроразмножения растений и по подбору условий культивирования для различных растительных объектов (Высоцкий, 2006; Митрофанова и др., 1997; Коновалова, 2008; Семе-рикова и др., 2008; Митрофанова, 2009). Наиболее полно разработанные технологии находят свое применение в сельском хозяйстве и при массовом производстве посадочного материала.
Исследования по подбору условий культивирования с целью получения посадочного материала ряда видов и сортов декоративных и плодово-ягодных культур с использованием клонального микроразмножения были начаты в учебно-научном центре «Ботанический сад» СГУ им. Н. Г. Чернышевского весной 2011 г. на базе лаборатории микроклонального размножения, созданной в ходе реализации программы развития инновационной инфраструктуры СГУ «Развитие инновационной инфраструктуры национального исследовательского университета путем создания высокотехнологичных научно-образовательных производственных структур».
На данный момент коллекция культиваров насчитывает 67 сортов, 34 вида 29 родов, принадлежащих 16 семействам. Из них растения 29 со-
ртов 14 видов 13 родов, принадлежащих к 3 семействам, были введены в культуру in vitro сотрудниками лаборатории микроклонального размножения УНЦ «Ботанический сад» СГУ Для реализации методов клональ-ного микроразмножения выбирались растения с ценными признаками (плодово-ягодные, декоративно-цветущие и др.). Часть образцов уже в виде пробирочных культур была любезно предоставлена коллегами из других ботанических садов (таблица). Для всех введённых в культуру in vitro видов и форм растений технология получения посадочного материала на основе клонального микроразмножения растений доведена до стадии создания малой серии продукции. Общее количество растений-ре-генерантов, адаптированных к нестерильным условиям, составила около 3.5 тысяч экземпляров.
Особенности отбора эксплантов и их ввода в стерильную культуру. Изоляция эксплантов производилась в сухую погоду, растения-доноры оценивались визуально. Большое внимание уделялось качеству побегов, отсутствию на них следов внешних повреждений и/или поражения инфекцией. В качестве первичных эксплантов использовались латеральные почки и узловые сегменты побегов текущего года. Наиболее оптимальным сроком изоляции являлась фаза активного роста растения (период апрель-май и сентябрь-октябрь).
поверхностная стерилизация проводилась согласно общепринятой методике. В работе с древесными растениями возник ряд трудностей. Так как исходный материал брался из полевых условий, он отличался высокой степенью внешней и внутренней загрязненности, особенно при изъятии материала летом, во время активного роста. Для повышения эффективности стандартной методики применялось предварительное выдерживание объектов в растворе синтетического моющего средства в течение 20-30 минут с последующим отмыванием их в проточной воде. Также применялась дополнительная дробная стерилизация растворами фунгицида и/или антибиотика, чтобы уничтожить патогенные микроорганизмы и споры грибов.
В качестве основных стерилизующих агентов использовались растворы гипохлоритов (в частности бытовые отбеливатели «Белизна» и «Domestos») и препарата «Лизоформин-3000». Концентрация раствора зависела от размеров эксплантов, наличия или отсутствия покровных чешуй, степени загрязненности. питательной инициальной средой для первичных эксплантов являлась среда по Мурасиге и Скугу (Murashige,
Перечень объектов коллекции in vitro лаборатории микроклонального размножения растений
УНЦ «Ботанический сад» СГУ
№ Семейство Название видо- или сортообразца Введено в культуру сотрудниками
1 Fragaria xananassa Duchesne ex Rozier сорт «Московский деликатес» ВРБС*
2 Cerasus vulgaris Mill, сорт «Студенческая» УНЦ БС СГУ"
3 Cerasus vulgaris Mill, сорт «Молодёжная» УНЦ БС СГУ
4 Cerasus vulgaris Mill, сорт «Орлица» УНЦ БС СГУ
5 Cerasus vulgaris Mill, сорт «Банкетная» УНЦ БС СГУ
6 Cerasus vulgaris Mill, сорт «Русинка» ГБС
7 Kenia japónica (L.) DC. УНЦ БС СГУ
8 Pentaphylloidesfniticosa (L.) O. Schwarz сорт «Goldfinger» УНЦ БС СГУ
9 Rosaceae Prunns domestica L. сорт «Султан Эрик» НБС-ННЦ***
10 Prunus divari cata Ldb. сорт «Алая заря» УНЦ БС СГУ
11 Rosa hybtida L. сорт «Crimson Glory» УНЦ БС СГУ
12 Rosa chinensis Jacq. УНЦ БС СГУ
13 Rnbiis idaens L. сорт «Шапка Мономаха» ВРБС
14 Rnbiis idaens L. сорт «Брянское диво» ВРБС
15 Rnbiis idaens L. сорт «Бальзам» УНЦ БС СГУ
16 Rnbiis idaens L. сорт «Бриллиантовая» ГБС""
17 Rnbiis idaens L. сорт «Золотая осень» ГБС
18 Rubus idaens L. сорт «Оранжевое чудо» ГБС
№ Семейство Название видо- или сортообразца Введено в культуру сотрудниками
19 Riibiis caeshis L. сорт «Честер Торнлесс» ВРБС
20 Ru bus caesius L. сорт «Tornfree» УНЦ БС СГУ
21 Rosaceae Rubus caesius L. сорт «Блэк Сэтин» ВРБС
22 Sorbus aucuparia L. сорт «Гранатная» УНЦ БС СГУ
23 Spiraea japónica L. сорт «Shirobana» УНЦ БС СГУ
24 Stephanandra tanakae Fraiich. Et Sav. УНЦ БС СГУ
25 Ri bes nigrum L. сорт «Зуша» УНЦ БС СГУ
26 Ri bes nigrum L. сорт «Чудное мгновение» УНЦБС СГУ
27 Ribes nigrum L. сорт «Элевеста» УНЦБС СГУ
28 Ribes nigrum L. сорт «Багира» УНЦБС СГУ
29 Ribes nigrum L. сорт «Загадка» УНЦБС СГУ
30 Grossulariaceae Ribes nigrum L. сорт «Десертная Ольхиной» УНЦБС СГУ
31 Ribes nigrum L. сорт «Тамерлан» УНЦБС СГУ
32 Ribes nigrum L. сорт «Дачница» УНЦБС СГУ
33 Ribes nigrum L. сорт «Черный жемчуг» УНЦБС СГУ
34 Ribes nigrum L. сорт «Маленький принц» УНЦБС СГУ
35 Ribes nigrum L. сорт «Чаровница» УНЦБС СГУ
36 Ericaceae Rhododendronponticum L. сорт «Мадам Массон» ГЪС
37 Rhododendron brachycarpum D. Don ГЪС
№ Семейство Название видо- или сортообразца Введено в культуру сотрудниками
38 Ericaceae Rhododendron brachycarpum D. Don copr«Helsinki University» ГБС
39 Rhododendron brachvcatpum D. Don сорт «Haaga» ГБС
40 Rhododendron hybridum Ker Gawl. сорт «Hellikii» ГБС
41 Vaccinium vitis-idaea L. сорт «Мазовия» ГБС
42 Vaccinium idiginosum L. сорт «North country» ГБС
43 Capriloliaceae Lonicera caerulea L. сорт «Гжелка» ВРБС
44 Lonicera caerulea L. сорт «Московская 23» ВРБС
45 Lonicera caerulea L. сорт «Камчадалка» УНЦ БС СГУ
46 Lonicera caerulea L. сорт «Лазурная» УНЦ БС СГУ
47 Weigela х hybrida Jacg. сорт «Eva Rathke» УНЦ БС СГУ
48 Weigela x hybrida Jacg. сорт «Candida» УНЦ БС СГУ
49 Ranimculaceae Clematis xjouiniana Schneid сорт «Серебряный ручеёк» ВРБС
50 Clematis xjouiniana Schneid сорт «Изобилие» ВРБС
51 Clematis xjouiniana Schneid сорт «Принцесса Диана» ВРБС
52 Clematis xjouiniana Schneid сорт «Полярный» ВРБС
53 Oleaceae Syringa vulgaris L. сорт «Сенсация» ГБС
54 Syringa vulgaris L. сорт «А. Громов» ГБС
55 Syringa vulgaris Г. сорт № 87 «Мадам Казимир Перье» ГБС
Окончание таблицы
№ Семейство Название видо- или сортообразца Введено в культуру сотрудниками
56 Actinidiaceae Actinidia kolomikta (Maxim.&Rupr.) Maxim.copr «Изобильная», $/c? ВРБС
57 Actinidia arguta (Siebold&Zucc.) Planch. ex Miq x Actinidia purpurea, $/c? ВРБС
58 Solanaceae Petunia xhybrida Vilm. сорт «Жемчужный прибой» ВРБС
59 Petunia xhybrida Vilm.copr «Salmón capri» ВРБС
60 Gesneriaceae Saintpaulia ionantha H. Wendl. сорт «Полярный медведь» ВРБС
61 Agavoideae Agave americana Г. НБС-ННЦ
62 Saxifragaceae Hendiera xhybrida L. сорт «Crème Brnlee» ГБС
63 Asparagaceae Commelina- ceae Hosta sieboldiana Engl. ВРБС
64 Tradescantia xandersoniana W. Pudw. сорт «Sweet Kate» открытого грунта ГБС
65 riliaceae Lilium caucasicum (Misez, ex Grossh.) Grossh. ВРБС
66 Alliaceae Allium regelianum A. Beck. ВРБС
67 Fabaceae Calophaca wolgarica (Г. fil.) DC. ВРБС
Примечание. ВРБС* - Волгоградский региональный ботанический сад, г.Волгоград; УНЦ БС СГУ" - Учебно-научный центр «Ботанический сад СГУ», г. Саратов (объекты введены в культуру in vitro сотрудниками лаборатории микроклонального размножения растений); НБС-ННЦ*** - Никитский ботанический сад - Национальный научный центр, г.Ялта, Украина; гбс**** _ Главный ботанический сад имени Н. В. Цицина РАН, г.Москва.
Skoog, 1962), дополненная 6-БАП в концентрации 0.1-0.5 мг/л. В некоторых случаях в инициальную среду добавлялась ГК в концентрации 0.1-1.5 мг/л для активации вывода осенних почек из состояния покоя. Полученные экспланты ежедневно осматривались на наличие инфекции и некроза. При наличии видимой инфекции наиболее ценные экспланты повторно подвергались стерилизации и пересадке на новую среду, а менее ценные - уничтожались. При регистрации внутренней инфекции под основанием побега экспланты пересаживались на среду, содержащую антибиотик в концентрации 100-400 мг/л. При отсутствии какой-либо инфекции на 7-10-й день после посадки экпланты переводились на этап размножения.
Условия культивирования и собственно микроразмножения.
Для этапа размножения микропобегов наиболее универсальной средой была MS с добавлением цитокининов. Помимо нее в нашей работе были использованы питательные среды Woody plant medium (Lloud, McCown, 1980), QL (Quoirin, Lepoivre, 1977), В5 (Gamborg, Evelegh, 1968), Нича (Nitsch, 1969), Андерсона (Anderson, 1980), Уайта (White, 1934) и их модификации. Для разных сортов (даже в пределах одного вида) минеральный состав питательной среды подбирался индивидуально. Успешные результаты были получены при чередовании сред с разным минеральным составом, что подтверждает литературные данные (Шипунова, 2009). Например, у черной смородины сортов «Зуша», «Багира» и др. качество эксплантов заметно улучшалось при чередовании пассажей на среды MS и WPM. Единственным источником углеводов в среде служила сахароза.
В качестве цитокининов чаще всего использовались 6-БАП, кинетин и зеатин. Концентрация цитокининов подбиралась индивидуально в зависимости от состояния экспланта и желаемого результата, чаще всего она составляла от 1,0 до 3,0 мг/л (рис. 1, 2). Повышенная концентрация 6-БАП приводила к увеличению коэффициента размножения, однако побеги в этом случае получались маленькими, трудно отделяемыми от основного побега, наблюдалось обводнение побегов. Иногда совместное использование цитокининов и ауксинов в соотношении 10:1 или 5:1 на этапе размножения давало значительное увеличение коэффициента размножения.
Культивировались растения при температуре 22-25°C, при 16-часовом фотопериоде. Длительность пассажа составляла от 20 до 60 дней.
Рис. 1. Зависимость количества образовавшихся адвентивных побегов за один пассаж от концентрации БАП (мг/л) у чёрной смородины сорта «Зуша»
Рис. 2. Микропобеги чёрной смородины сорта «Зуша» на средах с различной концентрацией БАП, мг/л, слева направо: 0,1; 0,2; 0,5
Для подготовки побегов к последующему этапу ризогенеза экспланты пересаживались на среды, содержащие ГК в концентрации 0,51,0 мг/л, либо БАП замещался на кинетин в концентрации 1-2 мг/л, что способствовало «вытягиванию» побегов по длине и улучшало качество листовой пластинки (рис. 3).
Рис. 3. Малина сорта «Золотая осень»: слева - экспланты на этапе микроразмножения на среде с БАП 0,5 мг/л; справа - экспланты на этапе доращивания на среде, содержащей кинетин 1,0 мг/л и ГК 0,5 мг/л
Укоренение побегов. В качестве сред для укоренения использовались те же среды, на которых размножались экспланты, только минеральный состав уменьшали вдвое, а цитокинины замещались ауксинами. В качестве индукторов ризогенеза для большинства культур использовались ИУК, ИМК и НУК. Наиболее эффективным оказалось использование ИМК в концентрации 1,0 мг/л (вишня, слива). Совместное действие ИМК и ИУК в концентрации по 0,5 мг/л каждая приводило к увеличению процента укоренившихся побегов. Такое сочетание оказалось наиболее эффективным для укоренения различных сортов клематисов, что подтверждает литературные данные (Коротков, Комарова, 2004). Для некоторых их сортов («Изобилие», «Полярный») оказался эффективным прием выдерживания растений в темноте непродолжительное время (3 суток) с последующим возвратом на обычный световой режим. Ризогенез в данном случае составлял от 75 до 100%, причем качество корней также было лучше.
От использования НУК в качестве индуктора ризогенеза мы были вынуждены отказаться из-за усиленного каллусообразования в базальной
части побега, несмотря на то что процент укорененных побегов был не ниже, а в некоторых случаях и выше, чем на ИМК (рис. 4, 5).
Рис. 4. Ризогенез клематиса «Полярный» на среде % MS с НУК 1,0 мг/л
Рис. 5. Ризогенез клематиса «Полярный» на % MS с ИМК 0,5 мг/л
Адаптация к нестерильным условиям. Укорененные растения-ре-генеранты извлекали из питательной среды, отмывали дистиллированной водой и высаживали в смесь земли, песка и торфа в соотношении 3:1:1. Предварительно субстрат проливался раствором «Фитоспорин».
Адаптацию регенерантов к тепличным условиям производили при 23-24°С и 16-часовом фотопериоде. Сосуды с высаженными регенеран-тами помещали в герметично закрытые полиэтиленовые пакеты.
Со второго дня после высадки регенерантов полиэтиленовые пакеты приоткрывали на несколько часов в день, с каждым днем увеличивая время экспозиции с целью адаптации растений.
Через 2 - 3 недели после высадки регенерантов сосуды с ними полностью освобождали от полиэтиленовых пакетов. К этому времени ре-генеранты адаптировались к нестерильным условиям и давали прирост. Выживаемость регенерантов составила 75-90%.
Заключение
В культуру in vitro введены растения 29 сортов 14 видов 13 родов, принадлежащих к 3 семействам цветковых. получение посадочного материала этих форм растений на основе клонального микроразмножения доведено до стадии производства малой серии продукции.
Благодарности. Благодарим сотрудников лаборатории биохимии, биотехнологии и вирусологии растений Никитского ботанического сада - Национального научного центра (Украина) и лично проф. И. В. Митрофанову; сотрудников лаборатории биотехнологии растений Главного ботанического сада им. Н. В. Цицина РАН и лично канд. с.-х. наук О. И. Молканову; сотрудников Волгоградского регионального ботанического сада и лично канд. биол. наук О. И. Короткова за неоценимую помощь, оказанную нам в период становления лаборатории.
Список литературы.
Бутенко Р. Г. Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М. : ФБК-Пресс, 1999. 159 с.
Высоцкий В. А. Биотехнологические приёмы в решении задач современного садоводства // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира : материалы Всерос. науч.-практ. конф. Волгоград, 24-25 августа 2006 г. Волгоград : Издатель, 2006. С. 6-11.
Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. М., 1983. 96 с.
Шипунова А. А. Клональное микроразмножение сортовой вишни // Вестн. Тюмен. гос. с.-х. академии. 2009. № 3 (10). С. 27-31
Коротков О. И., Комарова И. А. Особенности укоренения сортовых групп клематисов в зависимости от их происхождения : материалы IX Региональной конф. молодых исследователей Волгогр. обл. Волгоград, 9-12 ноября 2004 г. Волгоград, 2004. С. 27-28.
Anderson W. S. Mass propagation by tissue culture : principls and techniques // On nursery production of fruit plants through tissue culture-applications and feasibility : Proc. of confer. Maryland, 1980. P. 1-10.
Gamborg O. L., Evelegh D. E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. 1968. Vol. 46, № 5. P. 417-421.
Lloud G., McCown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture // Proc. Intern. Plant Prop. Soc. 1980. Vol. 30. P. 420-427.
Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, № 13. P. 473-497.
Nitsch J. P. Experimental androgenesis in Nicotiana // Phytomorphology. 1969. Vol. 19, № 3. P. 389-404.
Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. // Acta Hortic. 1977. Vol. 78. P. 437-442.
White P. R. Potentially unlimited growth of excised tomato root tips in a liquid medium // Plant Physiol. 1934. Vol. 9. P. 585-600.
УДК 581.543.6:581.48:631.531(031)
ОСОБЕННОСТИ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН SALVIA TESQUICOLA KLOK. & POBED В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ
Т. Ю. Гладилина, И. В. Шилова
Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского Учебно-научный центр «Ботанический сад» 410010, Саратов, ул. Академика Навашина, 1 Е-mail: flor1980@mail.ru
Приводятся результаты лабораторных исследований особенностей прорастания семян шалфея сухостепного, собранных с коллекционных растений. Установлено, что семена шалфея сухостепного всходят не энергично, всхо-
