Влияние регуляторов роста на регенерационную способность канны садовой ( canna × hybrida Hort. ) в условиях in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Биология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2014, № 3 (3), с. 124-127

УДК 582.548.25:57.085.23

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА РЕГЕНЕРАЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ КАННЫ САДОВОЙ (CANNA х HYBRIDA HORT.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO

© 2014 г. А.Ш. Тевфик1, И.В. Митрофанова12, Т.Н. Кузьмина1

1 Никитский ботанический сад, Ялта 2УНЦ биологии и экологии субтропических растений и ландшафтоведения НУБиП, Ялта

[email protected]

Поступила в редакцию 15.05.2014

Индуцирована регенерация микропобегов канны садовой (Canna х hybrida Hort.) из вегетативной почки в условиях in vitro. Определены оптимальные концентрации цитокинина тидиазурон для активного побегообразования канны садовой сортов Суевия, Дар Востока и Ливадия (1.24-1.91 мг/л). Представлены результаты гистологических исследований образовавшихся меристемоидов канны. Получены укорененные растения 3 сортов канны садовой.

Ключевые слова: канна, меристемоид, регенерация, культура in vitro.

Введение

Канна садовая (Canna х hybrida Hort.) - многолетнее травянистое растение семейства Cannaceae Juss, порядка Zingiberales Nakai с прямым ложным стеблем высотой 0.5-2.5 м и с очередными крупными широкоовальными листьями от сизо-зеленой до фиолетово-красной окраски [1]. В последние годы канна часто используется при оформлении парков, садов, скверов и представляет интерес благодаря крупным малиновым, красным, оранжевым, лососевым, желтым цветкам, собранным в соцветия.

Применение методов культуры органов и тканей в комплексе с другими методами позволяет оздоровить растения, снижает потери при укоренении регенерантов, ускоряет селекционный процесс и создает условия для депонирования ценных сортов путем замедления роста и развития эксплантов в виде медленно растущих коллекций и криосохранения.

Цель настоящего исследования - изучение особенностей адвентивного побегообразования канны садовой в условиях in vitro.

Экспериментальная часть

Изучали перспективные сорта канны садовой из коллекционных насаждений Никитского ботанического сада - Национального научного центра (НБС-ННЦ, Ялта): Дар Востока, Ливадия и Суевия. Исследования проводили в лаборатории биохимии, биотехнологии и вирусологии растений НБС-ННЦ. Применяли методы

культуры органов и тканей растений общепринятые [2] и разработанные в отделе биотехнологии растений НБС-ННЦ [3]. В качестве первичных эксплантов использовали вегетативные почки. Экспланты, прошедшие стерилизацию, в асептических условиях помещали в пробирки на модифицированную питательную среду Му-расиге-Скуга (МС) [4]. В среды добавляли регуляторы роста: цитокинины - 6-бензиламинопурин (БАП) и тидиазурон (ТДЗ) (Sigma, США), ауксин - индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) (Sigma, США). Для индукции развития экспланты переносили в культуральную комнату с температурой 24±1°С, 16-часовым фотопериодом и интенсивностью освещения 2-3 клк.

Цитоэмбриологические препараты готовили по общепринятой методике [5]. Парафиновые срезы делали толщиной 12-15 мкм на ротационном микротоме марки МРТУ (Россия). Постоянные препараты окрашивали гематоксилином с подкраской алциановым синим [6]. Анализировали материал с помощью микроскопа AxioScope A.1 (Zeiss, Германия) методом светлого поля. Микрофотографии выполнены с помощью системы анализа изображения AxioCamERc5s и с применением программыAxioVisionRel. 4.8.2.

Обработку результатов экспериментов проводили при помощи методов статистического анализа [7]. Повторность опыта была пятикратной.

Результаты и их обсуждение

Важное значение для развития эксплантов имеет добавление в питательные среды регуля-

Таблица

Влияние регуляторов роста на адвентивное побегообразование канны садовой (шт.)

Сорт Питательная среда Продолжительность культивирования, суток

30 60 90

Суевия МС + 1.27 мг/л ТДЗ 1.25±0.29 2.75±0.29 4.25±0.29

МС + 1.5 мг/л БАП + 1.5 мг/л ИУК 0.75±0.29 2.0±0.47 2.0±0.47

Дар Востока МС + 1.27 мг/л ТДЗ 0.75±0.29 1.75±0.29 2.75±0.29

МС + 1.5 мг/л БАП + 1.5 мг/л ИУК - - -

торов роста [3]. Предварительно нами были проведены исследования по получению дополнительных побегов канны садовой сорта Су-евия. Однако коэффициент адвентивного побегообразования был невысоким [8]. В связи с этим в последующих исследованиях для индукции адвентивного побегообразования нами были использованы БАП и ТДЗ.

У микропобегов канны садовой сортов Дар Востока и Суевия на среде МС, дополненной 1.27 мг/л ТДЗ, на 12-е сутки культивирования отметили появление адвентивных побегов. При последующем культвировании отмечали увеличение их количества. Так, на 90-е сутки микропобеги канны садовой сортов Дар Востока и Суевия образовали в среднем от 2.75 до 4.25 дополнительных побегов/эксплант соответственно (таблица).

При длительном культивировании канны садовой сорта Суевия (150 суток и субкультивирование каждые 30 суток на эту же питательную среду) наблюдали образование до 7 адвентивных побегов на эксплант. Кроме того, в базальной части некоторых побегов наблюдали формирование меристемоидов (5-10 шт./эксплант).

Результаты исследования показали, что увеличение концентрации ТДЗ до 1.91 мг/л при культивировании эксплантов сорта Суевия приводило к образованию каллуса ярко-зеленой окраски, который впоследствии темнел и отмирал. Вместе с тем, при добавлении в питательную среду МС 1.5 мг/л БАП и 1.5 мг/л ИУК отмечали меньше сформировавшихся адвентивных побегов (2 шт./эксплант), чем при использовании 1.27 мг/л ТДЗ. Возможно это связано с активным корнеобразованием (до 7 корней на эксплант). Наряду с этим, при культивировании микропобегов канны садовой сорта Дар Востока на питательной среде МС с 1.5 мг/л БАП и 1.5 мг/л ИУК дополнительные побеги не формировались. Были получены ре-генеранты с хорошо развитыми корнями (5.0±0.47 шт./микропобег).

В процессе исследований, при использовании 1.91 мг/л ТДЗ, на начальном этапе культи-

вирования у канны садовой сорта Ливадия развивались вытянутые в длину адвентивные побеги. В этом случае продолжительное культивирование эксплантов индуцировало образование меристемоидов. Так, через 6-7 месяцев в асептических условиях отметили образование до 40 меристемоидов размером от 0.1 до 0.7 см. Культивирование микропобегов канны садовой сорта Ливадия на питательной среде МС, дополненной 2.55 мг/л ТДЗ, также способствовало образованию меристемоидов. Однако на 100-е сутки культивирования такие меристемоиды начинали коричневеть.

Проведенные гистологические исследования позволили выявить некоторые особенности развития образующихся меристемоидов канны садовой (рисунок).

В процессе исследований было отмечено, что при добавлении в питательную среду ТДЗ у сорта Ливадия образовалось скопление мери-стемоидов в основании микропобега. В некоторых случаях можно было наблюдать дальнейшее развитие этих структур за счет активного деления клеток (рисунок А). Однако длительное культивирование меристемоидов на питательной среде МС с 2.55 мг/л ТДЗ приводило к их постепенному отмиранию (рисунок Б). Вместе с тем, в основании микропобегов сорта Суевия формировались отдельные зоны, обладающие меристематической активностью, и меристемо-иды (рисунок В). В базальной части некоторых микропобегов сорта Суевия наблюдали образование неморфогенного каллуса (рисунок Г). Клетки каллуса были паренхимного типа — крупные, вакуолизированные, не способные к дедифференциации.

Как показали наши исследования, увеличение некоторых меристемоидов и дальнейшее формирование вегетативных почек канны садовой сорта Ливадия происходили на 30-е сутки. При перенесении на среду МС с добавлением 1.5 мг/л БАП и 1 .5 мг/л ИУК уже сформировавшихся микропобегов размером 1.5 см происходило их удлинение на 5 см и разворачивание пары листьев. При продолжительном культиви-

126

А.Ш. Тевфик, И.В. Митрофанова, Т.Н. Кузьмина

- А '

* Г.' И" Г, -f „ iî>» 'V : . О- V У*- к,

у..- '

* - v. . -'-. л

100 цт

i-r-i V'.

Рис. Гистологические исследования органогенеза канны садовой: а - образование меристемоида сорта Ливадия; б - отмирающий меристемоид сорта Ливадия; в - образование меристемоида сорта Суевия; г - неморфогенный каллус сорта Суевия

ровании образовалось до 4 корней/эксплант длиной до 5 см.

Выводы

Выявлено, что для активного адвентивного побегообразования при культивировании эксплантов сортов Ливадия необходимо добавление в питательную среду 1.91 мг/л ТДЗ. Для сортов Дар Востока и Суевия оптимальной концентрацией является 1.24 мг/л ТДЗ. Гистологический анализ подтвердил получение меристе-моидов сортов Суевия и Ливадия. Установлено, что для получения регенерантов канны садовой на этапе ризогенеза необходимо присутствие в питательных средах ИУК.

Авторы выражают благодарность научному сотруднику лаборатории дендрологии и цветоводства НБС-ННЦ Н.В. Зубковой за любезно предоставленные растения канны садовой.

Работа выполнена в рамках научно-технических программ НБС-ННЦ НААН Украины по теме 10.00.02.08 «Створити бiотехнологiчнi системи соматичного ембрюгенезу та органогенезу в in vitro садових культур i виявити особливос-тi д iагностування фтопатоген'в при розмноженш

i депонуваннi цнного рослинного генофонду» (№ ГР Ф. 0111U003361).

Список литературы

1. Феофилова Г.Ф. Ассортимент и технология выращивания перспективных сортов канны для южных районов страны // Труды Никитского ботан. сада. 1991. Т. 112. С. 41-50.

2. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.

3. Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. Киев: Аграрна наука, 2011. 344 с.

4. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. № 3. P. 473-497.

5. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1970. 255 с.

6. Жинкина Н.А., Воронова О.Н. К методике окраски эмбриологических препаратов // Ботан. журн. 2000. Т. 85. № 6. С. 168-171.

7. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

8. Тевфик А.Ш. Регенерация растений канны садовой (Canna х hybrida Hort.) в культуре вегетативных почек in vitro // Труды Никитского ботан. сада. 2012. С. 426-435.

THE INFLUENCE OF GROWTH REGULATORS ON REGENERATION CAPACITY OF GARDEN CANNA (CANNA x HYBRIDA HORT.) IN VITRO

A.Sh Tevfik, I.V. Mitrofanova, T.N. Kuzmina

Regeneration in vitro of microshoots from vegetative buds of canna (Canna x hybrida Hort.) has been induced. The optimal concentrations of cytokinin TDZ (1.24-1.91 mg/l) for active shoots formation of Canna cvs. Suevia, Dar Vostoka, Livadia have been established. The results of histological studies are presented of canna meristemoids that have developed. Rooting plants of 3 canna cultivars have been obtained.

Keywords: Canna, meristemoid, regeneration, in vitro culture.

References

1. Feofilova G.F. Assortiment i tekhnologiya vyrash-chivaniya perspektivnykh sortov kanny dlya yuzhnykh raionov strany // Trudy Nikitskogo botan. sada. 1991. T. 112. S. 41-50.

2. Butenko R.G. Kul'tura izolirovannykh tkanei i fiziologiya morfogeneza rastenii. M.: Nauka, 1964. 272 s.

3. Mitrofanova I.V. Somaticheskii embriogenez i or-ganogenez kak osnova biotekhnologii polucheniya i sokhraneniya mnogoletnikh sadovykh kul'tur. Kiev: Agrarna nauka, 2011. 344 s.

4. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. № 3. P. 473-497.

5. Pausheva Z.P. Praktikum po tsitologii rastenii. M.: Kolos, 1970. 255 s.

6. Zhinkina N.A., Voronova O.N. K metodike okraski embriologicheskikh preparatov // Botan. zhurn. 2000. T. 85. №.6. S. 168-171.

7. Lakin G.F. Biometriya: Ucheb. posobie dlya biol. spets. vuzov. M.: Vysshaya shkola, 1990. 352 s.

8. Tevfik A.Sh. Regeneratsiya rastenii kanny sadovoi (Canna x hybrida Hort.) v kul'ture vegetativnykh pochek in vitro // Trudy Nikitskogo botan. sada. 2012. S. 426-435.