CC BY
96
Experimental articles
УДК 582.548.25: 57.085.23
ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО
_ _____ __ _________ «_*
МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ КАННЫ САДОВОЙ (CANNAxHYBRIDA HORT.)
А. Ш. Тевфик И. В. Митрофанова Т. Н. Кузьмина
Никитский ботанический сад — Национальный научный центр НААН Украины, АР Крым
E-mail: in_vitro@ukr.net
Получено 14.04.2014
Получены регенеранты канны садовой (Cannaxhybrida hort.) сортов Suevia, Дар Востока, Ливадия. Установлено, что жизнеспособность и регенерационный потенциал микропобегов канны зависят от генотипа. Определены оптимальные регуляторы роста, влияющие на процесс морфогенеза растений in vitro. На этапе микроразмножения различных сортов канны садовой необходимо добавление в питательную среду 1,24-1,91 мг/л тидиазурона. Выявлено, что активное корнеобразование микропобегов сортов Дар Востока и Suevia индуцирует присутствие в питательной среде ауксинов: Р-индолил-3-уксусной и а-нафтилуксусной кислот. Отмечено, что микропобеги сорта Suevia способны образовывать спонтанные корни. Результаты гистологических исследований подтвердили формирование меристемоидов при культивировании эксплантов канны in vitro.
Ключевые слова: канна, регенерация, меристемоид.
В связи с высокой поражаемостью ценных сортов декоративних растений грибными и вирусными болезнями в последние годы активно разрабатываются новые методы диагностики белезней и размножения растений. Культура in vitro в комплексе с другими методами обеспечивает оздоровление растений, позволяет получать посадочный материал в большем количестве и в более сжатые сроки, чем при использовании традиционных методов размножения [1, 2].
Канна садовая (Canna х hybrida hort.) — многолетнее травянистое растение семейства Cannaceae Juss, порядка Zingiberales Nakai, c подземным симподиальным корневищем и с прямым ложным стеблем высотой 0,5-2,5 м. При оформлении садов и парков канны создают крупные красочные массивы благодаря ярким цветкам различной окраски и бананоподобным листьям [3, 4]. Имеются лишь единичные сообщения зарубежных ученых, касающиеся биотехнологических исследований канны таких видов, как Canna indica L. и Canna edulis Ker. Поэтому выявление морфогенетического потенциала органов и тканей в условиях in vitro перспективных сортов канны садовой является актуальным.
Целью исследования было выявление морфогенетического потенциала органов и
тканей и разработка биотехнологических приемов микроразмножения перспективных сортов канны садовой.
Материалы и методы
В исследовании использовали перспективные сорта канны садовой (Canna х hybrida hort.) из коллекционных насаждений Никитского ботанического сада (НБС, г. Ялта): 2 сорта селекции НБС (Дар Востока, Ливадия) и 2 сорта зарубежной селекции (President, Suevia).
Исследования проводили в лаборатории биохимии, биотехнологии и вирусологии растений НБС. В работе использовали общепринятые методы культуры органов и тканей растений [5], а также разработанные в отделе биотехнологии растений НБС [2]. В качестве первичных эксплантов использовали вегетативные почки.
Экспланты, прошедшие стерилизацию, в асептических условиях помещали в пробирки на агаризованную питательную среду. В качестве базовых сред использовали модифицированные питательные среды Мурасиге и Скуга (МС) [6] и Пирика [7] с регуляторами роста (Sigma, США): 1,5-4 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 1,27-1,91 мг/л тидиазурона (ТДЗ), 0,5 мг/л кинетина,
71
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 5, 2014
1,5 мг/л Р-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), 1 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК). Для индукции развития экспланты переносили в культуральную комнату с температурой 24 ± 1 °С, 16-часовым фотопериодом и интенсивностью освещения 2-3 клк.
Обработку результатов экспериментов проводили при помощи методов статистического анализа [8]. Повторяемость опытов была пятикратной.
Для проведения гистологических исследований в качестве фиксатора использовали смесь Карнуа (этиловый спирт : хлороформ: уксусная кислота 6:3:1). После фиксации объекты хранили в 70%-м этаноле.
Цитоэмбриологические препараты готовили по общепринятой методике [9], заключающейся в последовательном обезвоживании и пропитывании материала ксилолом с последующим переводом объекта в парафин. Парафиновые срезы толщиной 12-15 мкм делали на ротационном микротоме марки МРТУ (Россия). Постоянные препараты окрашивали гематоксилином с подкраской ал циановым синим [10]. Анализировали материал с помощью микроскопов Jenaval и AxioScopeA.1 (Zeiss, Германия) методами светлого поля, а также поляризационной микроскопии. Микрофотографии выполнены с помощью системы анализа изображения AxioCamERc5s и цифровой фотокамеры OlympusSP-350 с применением программы AxioVisionRel. 4.8.2.
Результаты и обсуждение
Одним из факторов, который оказывает влияние на процессы морфогенеза органов и тканей растений in vitro, является состав питательной среды. В зависимости от поставленных задач, этапов клонального микроразмножения в питательные среды добавляют регуляторы роста цитокининового и ауксинового типов действия [6]. Для инициации развития в условиях in vitro первичных эксплантов (вегетативных почек) канны садовой нами была использована модифицированная питательная среда Мурасиге-Ску-га с 2-4 мг/л БАП и 1 мг/л ГК3 [11].
Собственно микроразмножение. В процессе исследования в качестве индукторов адвентивного побегообразования применяли цитокинины БАП и ТДЗ. Микропобеги канны садовой сортов Suevia, Дар Востока и Ливадия, культивируемые на питательной среде с добавлением 1,27-1,91 мг/л ТДЗ, на 12-е сут образовывали адвентивные побеги. Последующее культивирование таких побегов способствовало увеличению их длины (рис. 1).
Длина адвентивного побега сорта Suevia при добавлении в питательную среду МС 1,5 мг/л БAП и 1,5 мг/л ИУК на 18-е сут культивирования составила 3 см. Однако при дальнейшем культивировании на данной питательной среде отмечали меньшее количество сформировавшихся адвентивных побегов на эксплант, чем при использовании 1,27 мг/л
B
Рис. 1. Адвентивное побегообразование канны садовой на 21-е сут культивирования:
А — у сорта Suevia на питательной среде МС с 1,27 мг/л ТДЗ; Б — у сорта Ливадия на питательной среде МС с 1,94 мг/л ТДЗ; В — у сорта Дар Востока на питательной среде МС с 1,27 мг/л ТДЗ
(здесь и далее масштаб 1 см)
72
Experimental articles
ТДЗ (до 7 шт./эксплант). На 60-е сут культивирования на питательной среде, дополненной БАП и ИУК, образованы 2 дополнительных микропобега на эксплант.
Исследования показали, что в базальной части некоторых микропобегов канны садовой сорта Suevia формируются меристемои-ды зеленой и светло-бежевой окраски. Количество меристемоидов и их окраска зависели от продолжительности культивирования. Так, на 120-е сут культивирования наблюдали образование меристемоидов зеленой окраски (5,67 ± 0,41 шт./эксплант). При дальнейшем культивировании отмечали формирование меристемоидов белой окраски (табл. 1).
У канны садовой сорта Ливадия на питательной среде МС, дополненной 2,55 мг/л ТДЗ, на 10-е сут культивирования появлялись адвентивные побеги. В процессе дальнейшего культивирования таких эксплан-тов наблюдали постепенное потемнение и отмирание основного побега. При отделении адвентивных побегов от основного побега и последующем культивировании формировались меристемоиды и новые адвентивные почки. Через 90 сут культивирования in vitro на данной питательной среде коэффициент размножения составил 6,5±0,75 (табл. 2). Однако, уже на 100-е сут культивирования образовавшиеся меристемоиды начинали коричневеть, что чаще всего приводило к их гибели.
Результаты исследований показали, что продолжительное культивирование экс-плантов сорта канны садовой Ливадия на питательной среде с 1,91 мг/л ТДЗ индуцировало образование меристемоидов. Так, на 120-е сут культивирования было получено 11,0 меристемоидов/эксплант. Вместе с тем через 6-7 мес в асептических условиях формировалось максимальное количество меристе-моидов (40 шт/эксплант) размером от 0,1 до 0,7 см. Наряду с этим применение 1,91 мг/л ТДЗ не вызывало последующей регенерации этих меристемоидов. Поэтому отдельные меристемоиды и группы меристемоидов (по 2-3 шт.) переносили на питательную среду МС, дополненную 1,5 мг/л БАП и 1,5 мг/л ИУК.
Проведенные гистологические исследования позволили выявить некоторые особенности развития образующихся меристемои-дов канны садовой (рис. 2).
В процессе исследований удалось индуцировать образование меристемоидов у сорта Ливадия, в результате можно было наблюдать скопления меристематических очагов в основании микропобега. Кроме того, в некоторых случаях отмечено дальнейшее развитие этих структур в виде меристемы побега и примордиальных листьев (рис. 2, А). На рис. 2, Б показано, что у канны формируется множество адвентивных почек. Отмечено также появление трахеоподобных структур и скопление паренхимных клеток (рис. 2, Б).
Таблица 1. Образование меристемоидов канны садовой сорта Suevia в зависимости от продолжительности культивирования на питательной среде МС,
дополненной 1,27 мг/л ТДЗ
Продолжительность культивирования, сут Количество образовавшихся меристемоидов, шт/эксплант Количество меристемоидов зеленой окраски,% Количество меристемоидов бежевой окраски,%
120(контроль) 5,67±0,41 100,00 0
150 8,50±0,33* 76,47 23,53
165 13,50±0,33* 43,50 56,50
180 20,25±0,55* 33,30 66,70
Здесь и далее: * — Р < 0,05.
Таблица 2. Влияние продолжительности культивирования и концентрации ТДЗ в питательной среде МС _________________на формирование меристемоидов канны садовой сорта Ливадия________________
Продолжительность культивирования, сут 1,91 мг/л ТДЗ 2,55 мг/л ТДЗ
Количество меристемоидов на эксплант, шт. Средняя длина меристемоидов, см Количество меристемоидов на эксплант, шт. Средняя длина меристемоидов, см
30(контроль) 2,00 ± 0,47 0,90 ± 0,19 1,75 ± 0,29 0,53 ± 0,13
60 2,25 ± 0,29 0,63 ± 0,03 4,0 ± 0,71* 0,49 ± 0,08
90 3,75 ± 0,29* 0,55 ± 0,07 6,5 ± 0,75* 0,5 ± 0,05
120 11,00 ± 0,47* 0,45 ± 0,08 - -
73
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 5, 2014
Рис. 2. Гистологические исследования органогенеза in vitro канны садовой:
А — развитие меристемы побега и примордиальных листьев сорта Ливадия;
Б — образование адвентивных почек в основании микропобега сорта Ливадия;
В — гистогенез у сорта Ливадия;
Г — неморфогенный каллус сорта Suevia;
Д — образование меристемоида сорта Suevia;
Е — гистогенез у сорта Suevia
Длительное культивирование некоторых меристемоидов сорта Ливадия способствовало их удлинению и разворачиванию листьев (рис. 3, В).
Результаты гистологического анализа показали, что у сорта Suevia развиваются отдельные меристематические зоны, из которых затем формируются меристемоиды (рис. 2, Д). У сортов Suevia и Ливадия наблюдали также другой тип дифференциации тканей — гистогенез (рис. 2, Е). Образующийся в основании микропобегов сорта Suevia неморфогенный каллус (рис. 2, Г) состоял из клеток, не способных к дедифференциации. Клетки, составляющие каллус, паренхимного типа — крупные, вакуолизированные.
При культивировании экспланта сорта President (рис. 3, Б) на питательной среде МС, дополненной 1,5 мг/л БAП и 1,5 мг/л ИУК, наблюдали разворачивание листьев. Вместе с тем у канны этого сорта, по сравнению с сортом Suevia, образования дополнительных побегов и корней не отмечали. Культивирование на питательных средах с ТДЗ вызывало образование каллуса в основании микропобегов. После отделения и при последующем культивировании каллус темнел и отмирал.
В процессе исследований у микропобегов сорта канны садовой Дар Востока на пита-
тельной среде Пирика, дополненной 0,5 мг/л кинетина и 1,0 мг/л НУК, было отмечено разворачивание листьев и образование корней (рис. 3, А).
Укоренение микропобегов in vitro. Как показали наши исследования, некоторые экспланты канны садовой сорта Suevia способны к спонтанному корнеобразованию. Так, при культивировании микропобегов этого сорта отмечено спонтанное корнеобразование на 37-е сут культивирования.
Наряду с этим среднее количество корней на эксплант на 94-е сут культивирования в асептических условиях составило
1,1 ± 0,31 шт. (рис. 4). На 145-е сут культивирования в условиях in vitro сформировалось до 4 корней/эксплант. При длительном культивировании увеличивалась средняя длина корней.
Для индуцирования ризогенеза микропобегов канны садовой использовали вещества ауксинового типа действия ИУК и НУК.
У сортов канны садовой Suevia и Дар Востока на 15-е сут культивирования на модифицированной питательной среде M^ дополненной 1,5 мг/л БАП и 1,5 мг/л ИУК, происходило образование корней. При последующем культивировании наблюдали активный рост корешков первого, а также образование корешков второго порядка. Так, на 60-е сут культивирования на данной среде отмечали образование
74
Experimental articles
Рис. 3. Микропобеги канны садовой:
А — укорененный микропобег у канны сорта Дар Востока; Б — сорта President; В — сорта Ливадия
Таблица 3. Влияние продолжительности культивирования и регуляторов роста на образование корней канны садовой
Продолжительность культивирования, сут Питательная среда Suevia Дар Востока
К-во образовавшихся корней/ эксплант, шт. Средняя длина корней, см К-во образовавшихся корней/ эксплант, шт. Средняя длина корней, см
30 (контроль) МС + 1,5 мг/л БАП + 1,5 мг/л ИУК 1,75 ± 0,29 2,00 ± 0,71 3,00 ± 0,47 2,70 ± 0,24
Пирика + 0,5 мг/л кинетина + 1,0 мг/л НУК 3,00 ± 0,81 2,81 ± 0,61 1,50 ± 0,33 0,73 ± 0,17
60 МС + 1,5 мг/л БАП + 1,5 мг/л ИУК 6,25 ± 1,19* 3,56 ± 0,41 5,00 ± 0,47* 7,43 ± 0,99*
Пирика + 0,5 мг/л кинетина + 1,0 мг/л НУК 6,50 ± 1,00* 6,16 ± 0,95* 2,25 ± 0,29 3,00 ± 0,35*
90 МС + 1,5 мг/л БАП + 1,5 мг/л ИУК - - - -
Пирика + 0,5 мг/л кинетина + 1,0 мг/л НУК - - 6,00 ± 0,47* 3,28 ± 0,49*
Примечание: при данном сроке культивирования высаживали на адаптацию.
вередим
К4ЛНЧ«СТ*
образовав!
нхея
корней ка эксплант,
HIT
■средняя длина корней, см
Рис. 4. Изменение количества и длины спонтанно образующихся корней эксплантов сорта Suevia при культивировании in vitro
5-6 корней длиной около 8 см.
Наряду с этим помещение микропобегов сорта Suevia на питательную среду Пирика с 0,5 мг/л кинетина и 1,0 мг/л НУК позволило индуцировать активное корнеобразование (6,5 шт./эксплант) на 60-е сут культивиро-
94 (гантредь) 125 137 145
Продолжительность культивирования, сут
вания (табл. 3). Микропобеги образовывали 6 корней/побег и при более длительном культивировании. Развитие полноценных регенерантов с хорошо развитыми корнями у сорта Дар Востока отмечали на 90-е сут культивирования.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что на способность микропобегов канны садовой формировать дополнительные побеги большое влияние оказывает состав регуляторов роста в питательной среде. Так, активное побегообразование микропобегов сортов Дар Востока и Suevia происходило на модифицированной питательной среде МС с добавлением 1,24 мг/л ТДЗ. Показано, что регенерационная способность микропобегов сорта Ливадия повышалась при оптимальной концентрации ТДЗ 1,91 мг/л. Проведенный гистологический анализ подтвердил, что в условиях in vitro морфогенетический потенциал этой куль-
75
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 5, 2014
туры реализуется через этап формирования меристемоидов в основании микропобегов у сортов Suevia и Ливадия. Выявлены особенности ризогенеза in vitro и получены регенеранты 3 сортов.
REFERENCES
1. Mitrofanova I. V. Microclonal propagation of subtropical and tropical fruits (overview). Trudy Nikitskogo botanitcheskogo sada. 1997, V. 119, P. 63-95. (In Russian).
2. Mitrofanova I. V. Somatic embryogenesis and organogenesis as a base of biotechnology of obtaining and conservation perennial horticultural plants. Kyiv: Ahrarna nauka. 2011, 344 p. (In Russian).
3. Dashkeev E. A. Canna in Moldova. Kishinev: Shtinitsa. 1975, 65 p. (In Russian).
4. Feofilova G. F. Assortment and growing technology of promising canna varieties for homeland’s south regions. Trudy Nikitskogo botanitcheskogo sada. 1991, V. 112, P. 41-50. (In Russian).
5. Butenko R. G. Culture of isolated tissues and physiology of plants morphogenesis. Moscow: Nauka. 1964, 272 p. (In Russian).
Авторы выражают благодарность научному сотруднику лаборатории дендрологии и цветоводства НБС-ННЦ Н. В. Зубковой за любезно предоставленные растения канны садовой.
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962, 15(3), 473-497.
7. Pierik R. L. M. Anthurium andraeanum plant-lets produced from callus tissues cultivated in vitro. Physiol Plant. 1976, N 7, P. 80-82.
8. Lakin G. F. Biometrics: a textbook for universities biological specialties. Moscow: Vysshaia shkola. 1990, 352 p. (In Russian).
9. Pausheva Z. P. Handbook of plants cytology. Moscow: Kolos. 1970, 255 p. (In Russian).
10. Zhinkina N. A., Voronova O. N. The coloring method of embryological preparations. Bo-tanicheskii zh. 2000, 85(6), 168-171. (In Russian).
11. Tevfik A Sh. Horticultural Canna (Canna x hybrida hort.) plants regeneration in culture of vegetative buds in vitro. Trud~Y Nikitskogo botanitcheskogo sada. 2012, V. 134, P. 426435. (In Russian).
ОСОБЛИВОСТІ КЛОНАЛЬНОГО МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ КАННИ САДОВОЇ (CANNA х HYBRIDA HORT.)
А. Ш. Тевфік, І. В. Митрофанова,
Т. Н. Кузьміна
Нікітський ботанічний сад — Національний науковий центр НААН України, АР Крим
E-mail: in_vitro@ukr.net
Одержано регенеранти канни садової (Canna х hybrida hort.) сортів Suevia, Дарунок Сходу, Лівадія. Встановлено, що життєздатність та регенераційний потенціал мікропагонів канни залежать від генотипу. Визначено оптимальні регулятори росту, які впливають на процес морфогенезу рослин in vitro. На етапі мікророзмно-ження різних сортів канни садової слід додавати в живильне середовище 1,24-1,91 мг/л тидіа-зурону. Виявлено, що активне коренеутворення мікропагонів сортів Дарунок Сходу та Suevia індукує присутність в живильному середовищі ауксинів: Р-індоліл-3-оцтової та а-нафтилоцто-вої кислот. Відзначено, що мікропагони сорту Suevia здатні утворювати спонтанні корені. Результати гістологічних досліджень підтвердили формування меристемоїдів за культивування експлантів канни in vitro.
Ключові слова: канна, регенерація, меристемоїд.
THE PECULIARITIES OF CLONAL MICROPROPAGATION OF CANNA GARDEN (CANNA х HYBRIDA HORT.)
A. Sh. Tevfik, I. V. Mitrofanova,
T. N. Kuzmina
Nikitsky Botanical Garden —
National Scientific Centre of the National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine,
Crimea Autonomic Republic, Ukraine
E-mail: in_vitro@ukr.net
Regenerants of Canna (Canna х hybrida hort.) cvs. Suevia, Dar Vostoka and Livadia have been obtained. Dependence of viability and regenerative capacity of Canna microshoots on genotype has been found. The optimal concentrations of growth regulators that influence on morphogenesis in vitro have been determined. At the micropropagation stage of different cultivars of Canna it needs the addition of 1.24-1.91 mg/l thidiazuron to culture medium. The active rooting of Canna microshoots cvs. Dar Vostoka and Suevia on the culture medium Mu-rashige & Skoog and Pierik with auxins P-indol-3-acetic acid and а-naphthylacetic acid have been observed. The ability of Canna cv. Suevia microshoots to spontaneous root formation has been shown. The formation of meristemoids in culture in vitro of Canna explants have been confirmed by the results of histological investigations.
Key words: canna, regeneration, meristemoid.
76
