УДК 615.015.37:616.155.394:[615.9:547.412.723]-092.9
ВЛИЯНИЕ РЕАЛЬДИРОНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ
© Л. Ф. Муфазалова
Башкирский государственный медицинский университет Россия, Республика Башкортостан, 450000 г. Уфа, ул. Ленина, 3.
Тел.: +7 (905) 353 61 17.
E-mail: lya-mufazalova@ya.ru
В статье представлены данные о состоянии нейтрофилов периферической крови крыс при интоксикации тетрахлорметаном (ТХМ) на 7, 14 и 28 сутки наблюдения и их изменении при использовании иммуномодулятора реальдирона. Установлено, что интоксикация ТХМ приводит к формированию глубокой лейкопении, угнетению микробицидности нейтрофилов, особенно в условиях блокады оксидантного киллинга (что коррелирует со снижением в них активности миелопероксидазы и уровня катионных белков). Применение реальдирона существенно корректирует повреждающее действие ТХМ на нейтрофилы: восстанавливает микробицидность, что сопровождается повышением в них активности миелопероксидазы и уровня неферментных катионных белков, предупреждает падение их поглотительной способности.
Ключевые слова: тетрахлорметан, нейтрофилы, микробицидность, реальдирон.
Тетрахлорметан (ТХМ) широко применяется в промышленности как растворитель масел, смол, каучука, для чистки и обезжиривания одежды [1, 2]. Достаточно хорошо изучена гепатотоксичность ТХМ [2, 3]. Однако высокая смертность при острых отравлениях ТХМ тесно связана и с его иммуно-токсическим действием [4, 5]. Основным механизмом повреждающего воздействия ТХМ является активация процессов перекисного окисления липидов. Это особенно важно для нейтрофилов, поскольку оксидативный стресс, нарушая редокс-статус нейтрофилов, может существенно нарушить антимикробный потенциал этих клеток [6].
Несмотря на многочисленные исследования, недостаточно изучено неблагоприятное влияние ТХМ на состояние нейтрофильных гранулоцитов, а также возможности коррекции этого повреждающего воздействия.
В связи с этим целью исследования явилось изучение эффективности применения реальдирона (рекомбинантный альфа - 2Ь интерферон), обладающего иммуностимулирующим действием, для коррекции токсического влияния ТХМ на нейтро-филы [7-9].
Протоколы экспериментов и содержание животных были составлены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1985) и приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».
Эксперименты выполнены на 135 белых неин-бредных крысах массой 180-200 г. Результаты регистрировали на 7, 14 и 28 сутки (три серии экспериментов) от окончания введения токсиканта. В каждой серии животные были разделены на 3 группы (по 15 животных в группе): контроль, ТХМ, ТХМ+Р (реальдирон). Животным на протяжении 4 суток (раз в день) вводили ТХМ внутрижелудочно в дозе 1.25 мл/кг 50% раствора в оливковом масле [10]. Реальдирон вводили в дозе 100 000 ЕД на крысу [11] внутримышечно 3-х кратно (в 0-й, 3-й и
6-й дни, считая день окончания введения ТХМ нулевым днем).
Определяли количество лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови, интенсивность кислородзависимого метаболизма (спонтанный и индуцированный НСТ-тест), фагоцитарную активность полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), антимикробную активность ПМЯЛ в условиях функционирования и блокады (азидом натрия) кислородзависимых факторов микробицидности в отношении грибов Candida albicans, активность миелопероксидазы (МП) и содержание катионных белков (КБ) в ПМЯЛ [6].
Результаты НСТ-теста оценивали после 30 минут инкубации суспензии ПМЯЛ в 0.1% растворе нитросинего тетразолия (“Chemapol”) морфологическим методом. В окрашенных метиловым зеленым мазках определяли процент активных клеток (содержащих гранулы восстановленного диформа-зана) и индекс активации (степень активации в перераспределении на 1 фагоцит, ИА). Показатели вычисляли для интактной суспензии фагоцитов (спонтанный НСТ-тест) и в процессе фагоцитоза частиц латекса (индуцированный НСТ-тест).
Фагоцитарную активность изучали по методу И.С. Фрейдлина [12]. Поглотительную способность ПМЯЛ оценивали микроскопически в фиксированных, окрашенных метиловым зеленым мазках крови. Рассчитывали процент активных фагоцитов (активность фагоцитоза - фагоцитарное число, ФЧ) и число поглощенных объектов в 100 подсчитанных ПМЯЛ (интенсивность фагоцитоза - фагоцитарный индекс, ФИ) [6].
Антимикробную активность определяли по числу колониеобразующих единиц микробов (С. albicans, штамм 2), выросших через 3 суток на среде высева. Контролем служил высев микроба из среды реакции, не содержащей фагоцитирующих клеток (ПМЯЛ). Инактивирующую активность фагоцитов выражали в процентах микробных клеток, инактивированных фагоцитами (индекс инактивации, ИИ).
А
Л
Рис. 1. Влияние ТХМ на некоторые показатели функциональной активности ПМЯЛ и их коррекция реальдироном. А - 7 сутки наблюдения. Б - 14 сутки наблюдения. В - 28 сутки наблюдения. Л - лейкоциты. КЗМ - кислородзависимая микроби-цидность, индекс инактивации. КНЗМ - кислороднезависимая микробицидность, индекс инактивации. НСТ лат - индуцированный НСТ-тест, индекс активации. ФИ - фагоцитарный индекс.
Рис. 2. Влияние ТХМ (А) и коррекция его воздействия реальдироном (Б) на содержание миелопероксидазы в ПМЯЛ (7-е, 14-е и 28-е сутки наблюдения). ПА - процент КБ-активных клеток. СЦК - средний цитохимический коэффициент.
Рис. 3. Влияние ТХМ (А) и коррекция его воздействия реальдироном (Б) на содержание катионных белков в ПМЯЛ (7-е, 14е и 28-е сутки наблюдения). ПА - процент КБ-активных клеток. СЦК - средний цитохимический коэффициент.
Активность МП и КБ оценивали по интенсивности окраски (пользуясь 5-бальной шкалой), вычисляли процент активных клеток в мазке (ПА) и средний цитохимический коэффициент (СЦК) по О. АзІаМ, Ь. Уе^а [13]: СЦК=(1а+2в+3с+4ё)/100, где 0-4 - интенсивность окраски, а, в, с, ё - количество ПМЯЛ с соответствующей интенсивностью окраски [14].
Статистическую обработку проводили с использованием методов вариационной статистики [15], пакета программ 8іа1із1іеа 6.0. Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Вилка. При нормальности распределения признака оценку значимости различий проводили с использованием ^критерия Стьюдента, достоверными считали различия при уровне значимости р < 0.05. Данные представлены в % к контролю.
Воздействие ТХМ приводило на 7 сутки к глубокой лейкопении (до 66.1%, р < 0.01), формирование которой было обусловлено снижением числа лимфоцитов (до 62.1%, р < 0.001). Наблюдалось угнетение как оксидантных, так и неоксидант-ных микробицидных систем ПМЯЛ (индекс инактивации (ИИ) составил 59.1% (р < 0.001) и 24.8% (р < 0.001) соответственно) (рис. 1, А). Снижение образования активных форм кислорода (АФК) в условиях индукции (индуцированный НСТ-тест) и активности МП в ПМЯЛ (число МП-позитивных клеток составило 67.9% (р < 0.001), а СЦК - 67.8% (р < 0.001)) свидетельствует об угнетении как пе-роксидазозависимых, так и пероксидазонезависи-мых факторов кислородзависимого киллинга ПМЯЛ (рис. 2, А).
Угнетение неоксидантного киллинга ПМЯЛ (ИИ - 24.8%) цитохимически подтверждалось снижением уровня КБ: процент КБ-позитивных клеток составил 36.3% (р < 0.001), СЦК - 38.8% (р < 0.001) в этих клетках (рис. 3, А). Отмечено и снижение поглотительной способности ПМЯЛ (фагоцитарый индекс (ФИ) составил 76.4%, р < 0.001) (рис. 1, А).
Применение реальдирона (7 сутки) ослабило выраженность лейкопении за счет увеличения числа нейтрофилов (до 153.2%, р < 0.001) и в 2 раза (по
отношению к ТХМ) повысило активность неокси-дантных микробицидных систем ПМЯЛ (ИИ -50.6%, р < 0.001) (рис. 1, А). Цитохимически это проявилось двухкратным (по отношению к ТХМ) повышением уровня КБ: процент КБ-позитивных клеток составил 76.8% (р < 0.001), СЦК - 77.9%, (р < 0.001) в нейтрофилах (рис. 3, Б).
На 14 сутки сохранялась индуцированная ТХМ лейкопения (64.8%, р < 0.001), формирование которой было уже связано со снижением числа как нейтрофилов (до 59.1%, р < 0.02), так и лимфоцитов (до 65.9%, р < 0.001) (рис. 1, Б).
Также на 14 сутки сохранялась депрессия ок-сидантного киплинга ПМЯЛ (ИИ - 61.3%, р < 0.001), в то время как интенсивность неокси-дантного киллинга увеличилась по сравнению с 7 сутками, но не восстановилась (ИИ - 60.5%. р < 0.01) (рис. 1, Б).
Подавление кислородзависимого метаболизма ПМЯЛ (14 сутки) в индуцированном НСТ-тесте в сочетании со снижением активности миелоперок-сидазы (процент МП-позитивных клеток составил 72.2% (р < 0.001), а СЦК - 72.8% (р < 0.001)) свидетельствует о сохраняющемся угнетении пероксида-зозависимых и пероксидазонезависимых оксидант-ных микробицидных систем ПМЯЛ (рис. 2, А).
Повышение активности кислороднезависимых микробицидных систем ПМЯЛ при воздействии ТХМ на 14 сутки наблюдения (ИИ - 60.5%) подтверждалось также и двукратным (по сравнению с 7 сутками) повышением уровня КБ: процент КБ-положительных клеток составил 66.3% (р < 0.001), СЦК - 67.1% (р < 0.001) в ПМЯЛ (рис. 3, А). Следует отметить статистически значимое увеличение числа нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе (до 131.0%, р < 0.01), при снижении их поглотительной способности (до 78.5%, р < 0.05).
Использование реальдирона (14 сутки) полностью восстанавливало активность оксидантных и неоксидантных микробицидных систем ПМЯЛ (ИИ составил 103.4% и 107.0% соответственно). При этом реальдирон устранял депрессию ТХМ кисло-родзависимого метаболизма нейтрофилов (индуцированный НСТ-тест) (рис. 1, Б), что согласуется с
данными других авторов об активирующем влиянии реальдирона на оксидантный метаболизм ней-трофильных гранулоцитов [7].
Реальдирон также повышал (14 сутки), но не восстанавливал активность МП: процент МП-
позитивных клеток составил - 86.3% (р < 0.002), СЦК - 87.6%, (р < 0.05) (рис. 2, Б).
Восстановление активности неоксидантного киллинга ПМЯЛ (ИИ - 107.0%) под влиянием ре-альдирона (14 сутки) сопровождалось повышением до нормы уровня КБ: процент КБ-позитивных клеток составил 113.5%, СЦК - 113.6% в ПМЯЛ (рис. 3, Б). Применение реальдирона снижало до нормы число фагоцитирующих клеток (90.4%) при восстановлении их поглотительной активности (110.1%) (рис. 1, Б).
На 28 сутки сохранялись индуцированные токсикантом лейкопения (73.6%, р < 0.001) и депрессия кислородзависимого киллинга ПМЯЛ (ИИ составил 76.0%, р < 0.02) (рис. 1, В). Это сопровождалось уменьшением образования АФК (индуцированный НСТ-тест) и активности МП (процент МП-позитивных клеток составил 74.1% (р < 0,001), СЦК - 74.3% (р < 0.01)) в ПМЯЛ, что свидетельствует о сохраняющемся угнетении пероксидазозави-симых и независимых механизмов микробицидно-сти (рис. 2, А).
Также на 28 сутки сохранялась депрессия и неоксидантных микробицидных систем ПМЯЛ (ИИ - 78.1%, р < 0.01) (рис. 1, В), что коррелировало со снижением уровня КБ в этих клетках (процент КБ-положительных клеток составил 71.6% (р < 0.001), СЦК - 72.6% (р < 0.001)) (рис. 3, А).
В группе животных, получавших реальдирон (28 сутки наблюдения), активность оксидантных и неоксидантных микробицидных систем ПМЯЛ, как и на 14 сутки, не отличалась от таковой у интакт-ных животных (ИИ составил 104.3% и 113.0% соответственно) (рис. 1, В). Использование реальди-рона повышало, но не восстанавливало интенсивность оксидантного метаболизма ПМЯЛ и нормализовало активность МП (СЦК - 111.9%) (рис. 2, Б). Также восстанавливались уровень КБ (процент КБ-позитивных клеток составил - 93.9%, СЦК -91.3%) (рис. 3, Б) и поглотительная способность ПМЯЛ (рис. 1, В).
Таким образом, воздействие ТХМ приводит к формированию глубокой лейкопении, подавлению микробицидности нейтрофилов, особенно в условиях блокады оксидантного киллинга. Применение реальдирона существенно корректирует и в ряде случаев нивелирует повреждающее действие ТХМ на нейтрофилы.
Учитывая, что интоксикация ТХМ рассматривается как наиболее универсальная модель химического стресса [16], представляет очевидный интерес изучение эффективности реальдирона при отравлении другими химическими веществами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Халепо А. И., Уланова И. П. Исследование процессов повреждения и механизмов защиты при воздействии химического фактора // Актуальные проблемы «Медицины труда»: Сборник трудов Института медицины труда РАМН. М.: Изд-во РАМН, 2001. С. 25-73.
2. Мышкин В. А., Ибатуллина Р. Б., Бакиров А. Б. Поражения печени химическими веществами. (Функционально -метаболические нарушения, фармакологическая коррекция). Уфа: Изд-во Гилем, 2007. 177 с.
3. Лемза С. В., Ажунова Т. А., Мондодоев А. Г. Фармакоте-рапевтическая эффективность комплексного растительного средства «гепатон» при экспериментальном повреждении печени // Бюллетень ВСнЦ СО РАМН.- 2010. №2 (72). С. 181-184.
4. Забродский П. Ф., Германчук В. Г., Киричук В. Ф., Карпенко Н. И. Влияние тетрахлорметана на показатели иммунной системы // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2004. Т.137. №1. С. 56-58.
5. Забродский П. Ф., Киричук В. Ф., Лим В. Г. Изменение цитоки-нового профиля и редукция функции субпопуляций лимфоцитов при подостром отравлении тетрахлорметаном // Бюлл. экс-перим. биологии и медицины. 2009. Т.147. №1. С. 55-57.
6. Долгушин И. И., Андреева Ю. С., Савочкина А. Ю. Ней-трофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.: Изд-во РАМН, 2009. 208 с.
7. Шкапова Е. А., Куртасова Л. М., Савченко А. А. Клеточная чувствительность к реаферону у больных почечно-клетоным раком после реаферонотерапии // Бюлл. экспе-рим. биологии и медицины. 2007. Т.144. №7. С. 90-92.
8. Кудряшова И. П., Оспельникова Т. П. Интерфероны и другие цитокины при хроническом пиелонефрите // Вестник РАМН. 2010. №9. С. 18-23.
9. Оспельникова Т. П., Егорова О. Н., Балабанова Р. М. Ин-терфероны и другие цитокины при ревматических заболеваниях // Вестник РАМН. 2010. №7. С. 3-7.
10. Саратиков А. С., Венгеровский А. И. Влияние гепатопро-текторов, содержащих фосфолипиды, на зависимую от цитохрома Р-450 антитоксическую функцию печени при экспериментальном токсическом гепатите. // Бюлл. экспе-рим. биологии и медицины. 1999. Т.127. №4. С. 392-394.
11. Гончарова И. А., Жанаева С. Я. Изменение функции печени при стимуляции и депрессии макрофагов у крыс Вис-тар с токсическим гепатитом // Бюлл. СО РАМН. 2004. №4 (114). С. 84-87.
12. Фрейдлин И. С. Система мононуклеарных фагоцитов. М.: Медицина, 1984. 272 с.
13. Astalgi J. H., Verga L. The glycogen content of the cell of lymphatic leukemia // Acta haematol. (Basel). 1957. V.17. P. 129-135.
14. Ягода А. В., Локтева Н. А. Клиническая цитохимия. Ставрополь: Изд-во СтГМА, 2005. 485 с.
15. Гареев Е. М. Основы математико-статистической обработки медико-биологической информации. Уфа: Изд-во ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет Роздрава», 2009. 346 с.
16. Халимов А. Р., Сергеева С. А., Камилов Ф. Х. Коррекция ладастеном гормонального дисбаланса у крыс при воздействии четыреххлористого углерода // Медицинский вестник Башкортостана. 2006. №1. С. 269-271.
Поступила в редакцию 05.02.2012 г.