CC BY
12СЕНТЯБРЬ - ОКТЯБРЬ 2010
Рейтинговое голосование читателей
проводится на сайтах ФГУЗ РПОХБВ Роспотребнадзора www. rpohv.ru и журнала toxreview.ru.
Профилактическая токсикология
Конкурс «Лучшая работа молодого ученого»
Алтаева А.А.
Учреждение Российской Академии Медицинских Наук
Научно- исследовательский институт экологии
человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина, Москва
УДК 57.05 : 615.917
Влияние разных режимов введения акриламида на цитогенетические и структурно-функциональные показатели щитовидной железы крыс
В]
:
ыявлено мутагенное , действие АА в дозе, соответствующей 0,1ЬБ 50 на клетки ЩЖ при разных временных параметрах. Отмечено также повышение про-лиферативных процессов в этом органе, определенных по показателям «сумма клеток с
двумя и более ядрами» и «доля интерфолликулярной ткани». Увеличение пролиферации сопровождалось повышением функциональной активности ЩЖ, оцениваемой по увеличению доли коллоида с резорбцией. Полученные данные позволяют предположить, что
АА, вызывая цитогенетиче-ские нарушения и изменение пролиферации клеток ЩЖ, приводит к развитию новообразований в этом органе.
Ключевые слова: щитовидная железа, акриламид, цитогенетические нарушения, пролиферация, апоптоз
Введение. По данным ВОЗ распространенность рака щитовидной железы (ЩЖ) за последние 20 лет увеличилась более чем в два раза. В настоящее время установлен ряд канцерогенов, тропных непосредственно к ткани ЩЖ. Одним из таких соединений является акриламид (АА), который широко используется в промышленности и быту. АА благодаря своему низкомолекулярному весу и высокой растворимости в воде и биологических жидкостях легко проникает через все биологические мембраны [5], поэтому он быстро всасывается слизистыми оболочками и кожей, хорошо распределяется в органах и тканях.
Согласно руководству Европейской Комиссии [4], АА относится: к группе 2 А (МАИР) - «вероятно, вызывает рак у людей», ко 2-й группе мутагенов -«может вызывать генетические повреждения» и к 3-й группе токсичности- «возможен риск
бесплодия». В литературе имеются неодназначные данные о токсическом действии АА на ЩЖ, кроме того, мутагенное действие АА in vivo на клетки ЩЖ до настоящего времени не изучено. В связи с этим, целью исследования являлось изучение временных параметров ци-тогенетических и структурно-функциональных изменений ЩЖ при действии АА.
Материалы и методы исследования Исследования проведены на 42 самцах крыс Wistar, массой 170-240 г, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986) и требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к Приказу Минздрава СССР от 12.08.1977г. № 755) и одобрены Комитетом по Этике НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина РАМН.
Во время проведения эксперимента животных содержали на стандартной диете в условиях свободного доступа к воде и пище. ЩЖ относится к органам с медленнообновляющи-мися клеточными популяциями [1], поэтому для выявления микроядер, которые образуются в процессе деления клетки, необходимо стимулировать проли-феративную активность ЩЖ путем гемитиреоидэктомии (ГТЭ). Под эфирным наркозом животным проводили левостороннюю ГТЭ. В каждой группе было по 7 животных. После ГТЭ крысам перораль-но с помощью зонда вводили раствор АА (Acrylamide, extrapure; Helicon) в дистиллированной воде в дозе 12,4 мг/кг, соответствующей 0,1 LD50 каждые два дня: на 48-й, 96-й и 144 час после ГТЭ согласно методике, предложенной Гансбургским М.А [1]. Животных усыпляли парами эфира. Материал забирали на 3-е сутки после одно-
кратного и трехкратного введения. Сравнение исследуемых цитогенетических показателей проводили по отношению к ЩЖ крыс после ГТЭ без введения АА, а морфологических- по двум контролям. Контролем 1 служила щитовидная железа ин-тактных животных, контролем 2- доля ЩЖ, оставшаяся после ГТЭ, взятая на 9 сутки.
Препараты для цитогенети-ческого анализа готовили с помощью модифицированного метода получения изолированных клеток ЩЖ путем фиксации в формалине и щелочной диссоциации для последующего анализа, окрашивания азур-эозином по Романовскому и по Фельгену. Цитогенетическое действие оценивали с помощью расширенного микроядерного теста [2]. В фолликулярных клетках ЩЖ (А-клетках) анализировали частоту цитогене-тических показателей: долю клеток с микроядрами, протру-зиями, межъядерными мостами, сумму цитогенетических нарушений, а также другие кариоло-гические показатели: пролиферацию (сумму клеток с двумя и
более ядрами) и апоптоз (доля клеток с кариопикнозом, кари-орексисом, кариолизисом, апоп-тический индекс). Микроскопический анализ зашифрованных препаратов проводили под иммерсионным объективом при увеличении '1000. Подсчитывали 1000 клеток от каждого животного.
Материал для морфологического анализа забирали также от животных, с введением АА по аналогичной схеме, что и для цитологических исследований. Кусочки щитовидной железы фиксировали в 10% нейтральном формалине. Микропрепараты готовили по стандартной гистологической методике, окрашивали гематоксилином-эозином. Стереометрически анализировались следующие показатели в процентах: соотношение фолликулярной и интерфолликулярной ткани; соотношение фолликулярных кубических и цилиндрических эпителиоцитов к плоским эпителиоцитам; соотношение коллоида с резорбцией и без нее. Стереометрию осуществляли путем наложения сетки со стороной квадрата 2,5
см. на монитор компьютера со спроецированным изображением исследуемого участка ЩЖ. Долевое соотношение определяли по числу точек пересечения сторон квадрата.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA for Windows 5.0. Сравнение цитогенетических показателей групп проводили по критерию X2, морфологических показателей - по критерию t. Корреляцию цитогенетических и морфологических показателей определяли с помощью анализа Спирмена. Отличия считали достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение. В ЩЖ интактных крыс после ГТЭ (контроль) доля клеток с микроядрами составила 0,17%о, доля клеток с протрузиями составила 0,66%, с межъядерными мостами 0,33%, а сумма цитогенетических нарушений - 1,17%. Интегральный показатель пролиферации у интакт-ных крыс, включающий клетки ЩЖ с двумя и более ядрами, составил 13,2%, апоптический индекс - 3,5% (Табл. 1).
Таблица1
Кариологические показатели в А-клетках ЩЖ крыс при однократном и трехкратном введении акриламида в дозе, соответствующей 0,1 Ю 50
Показатели Доля клеток с исследуемыми показателями (х ср. ± m), в %о
Контроль 1 введение 3 введения
Цитогенетические показатели
Доля клеток с микроядрами 0,17±0,17 0,86±0,26* 0,57±0,3
Доля клеток с протрузиями 0,66±0,33 3,86±0,91*** 3,85±1,53***
Доля клеток с межъядерными мостами 0,33±0,21 0,29±0,29 1,28±0,36*
Сумма клеток с цитогенетическими нарушениями 1,17±0,54 5,0±1,11*** 5,71±1,71***
Показатели пролиферации
Сумма клеток с двумя и более ядрами 13,17±3,24 8,0±1,29** 32,43±12,45***
Показатели деструкции ядра
Доля клеток с кариопикнозом 3,5±1,65 6,86±1,56*** 16,29±4,98***
СЕНТЯБРЬ -
О КТЯ Б Р Ь 2 О 1 О
Показатели Доля клеток с исследуемыми показателями (х ср. ± т), в %о
Контроль 1 введение 3 введения
Доля клеток с кариорексисом 0 0,14±0,14 0,29±0,18
Доля клеток с кариолизисом 0 0 0
Апоптический индекс клеток 3,5±1,65 7,0±1,63* 16,57±5,04***
Примечание. *-р<0,05; ***-р<0,001- значимые отличия от контрольной группы при сравнении данных по х2-
Результаты оценки действия АА на клетки ЩЖ крыс представлены в таблице 1. При однократном действии мутагена отмечено повышение частоты клеток ЩЖ с цитогенетически-ми нарушениями в 4,3 раза. При увеличении кратности введения АА, которое приводит к увеличению суммарной воздействующей дозы, частота клеток с цитогенетическими нарушениями также повышалась и превы-
шала аналогичный показатель в группе контроля в 4,9 раза. При этом наиболее значительно по сравнению с однократным воздействием, в 4,4 раза достоверно увеличилась доля клеток с межъядерными мостами.
Сумма клеток с двумя и более ядрами при однократном воздействии достоверно увеличилась в 2 раза, и еще больше- в 4,7 раза-при трехкратном. Также достоверно повышается апоптический
индекс- в 2 раза при однократном и в 4,7 раза- при трехкратном введении. Другие кариологи-ческие показатели в зависимости от кратности воздействия достоверно не меняются .
Результаты структурно-функциональных изменений представлены в таблице 2. В том случае, когда показатели в 2-х контрольных группах достоверно не отличались, они были об-ьъеденены в общий контроль.
Таблица 2
Морфофункциональные показатели щитовидной железы крыс при однократном и трехкратном введении акриламида в дозе, соответствующей 0,1 Ю 50
Показатели Доля гистологических показателей ЩЖ в разных группах крыс, х ср. ± т
Контроль 1 Контроль 2 1 введение 3 введения
Фолликулярная ткань
Фолликулярная ткань 0,95±0,008 0,94±0,012 0,91±0,008** к1, к 2
Интерфолликулярная ткань
Интерфолликулярная ткань 0,05±0,008 0,06±0,012 0,09±0,008** к1, к2
Фолликулярный эпителий
Кубический и цилиндрический 0,367±0,121 0,724±0,08 0,617±0,066 0,763±0,062* к1
Плоский 0,633±0,121 27 0,276±0,08 0,383±0,066 0,237±0,062*к1
Состояние коллоида
Без резорбции 0,974±0,015 0,923±0,041 0,869±0,066
С резорбцией 0,026±0,015 0,077±0,041 0,131±0,066
Примечание. *-р<0,05; **- р<0,01- значимые отличия от контрольных групп. к1- ЩЖ интактных крысы; к2- оставшаяся доля ЩЖ после гемитиреоидэктомии.
После однократного введения АА отмечено уменьшение доли фолликулярной и увеличение доли интерфолликулярной ткани (табл. 2). При трехкратном введении АА, которое приводит к накоплению эффекта, доля интерфолликулярной ткани еще более достоверно увеличивалась при соответствующем снижении доли фолликулярной ткани, что подтверждается увеличением доли кубического и цилиндрического эпителия при соответствующем снижении плоского. Однако, практически такое же увеличение доли кубического и цилиндрического эпителия определено в ЩЖ после ГТЭ и при однократном введении АА, что позволяет отнести отмеченные изменения к последствиям ГТЭ.
При однократном введении исследуемого вещества отмечена тенденция к уменьшению доли коллоида без резорбции и увеличение доли коллоида с резорбцией. Увеличение кратности воздействия вызывает еще большее уменьшение доли коллоида без резорбции и увеличение доли коллоида с резорбцией, свидетельствующее об усилении функциональной активности ЩЖ.
Увеличение пролифератив-ной активности ЩЖ, определяемой по увеличению доли ин-терфоликуллярной ткани при структурно-функциональном анализе, согласуется с увеличе-
нием интегрального показателя пролиферации клеток, выявленном при цитогенетическом анализе. Усиление пролифера-тивной активности, наблюдаемое при увеличении кратности воздействия, является важным прогностическим признаком неопластического роста. На этом фоне наблюдали повышение функциональной активности ЩЖ по увеличению доли коллоида с резорбцией. Это подтверждается данными литературы о способности акри-ламида вызывать изменения гормонального фона в органах эндокринной системы и ЩЖ
[3].
При межгрупповом сравнении кариологических и структурно-функциональных показателей установлен высокий уровень корреляции Спирмена (к>0,8; р<0,05) между долей интерфолликулярной ткани и частотой клеток с микроядрами, а также апоптическим индексом.
Выводы. Таким образом, выявлено мутагенное действие АА в дозе, соответствующей 0,1ЬБ50, на клетки ЩЖ при разных режимах введения. Также отмечено повышение про-лиферативных процессов в этом органе, определенных по показателям «сумма клеток с двумя и более ядрами» и «доля интерфолликулярной ткани». Увеличение пролиферации сопровождалось повышением
функциональной активности ЩЖ, оцениваемой по увеличению доли коллоида с резорбцией. Полученные данные позволяют предположить, что АА вызывая цитогенетические нарушения и изменение пролиферации клеток ЩЖ, приводит к развитию новообразований в этом органе.
О СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Павлов А.В., Гансбургский М.А., Ган-сбургский А.Н., Шашкина М.В., Миро Т.Л. Использование микроядерного теста для выявления генотоксических повреждений щитовидной железы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2006.- Т. 141.- №1.- С. 99102.
2. Сычева Л.П. Биологическое значение, критерии определения и пределы варьирования полного спектра кари-ологических показателей при оценке цитогенетического статуса человека // Медицинская генетика.- 2007.-Т. 6.-№ 11(65).- С. 3-12.
3. Bowyer J.F., Latendresse J.R., Delongchamp R.R., Muskhelishvili L., Warbritton A.R., Thomas M., Tareke E., McDaniel L.P., Doerge D.R.. The effects of subchronic acrylamide exposure on gene expression, neurochemistry, hormones, and histopathology in the hypothalamus-pituitary-thyroid axis of male Fischer 344 rats //Toxicol Appl Pharmacol. 2008 Jul 15;230(2):208-15. Epub 2008 Mar 18.
4. European Commission. Council Directive 88/379/EEC of 7 June 1988 on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions of the Member States relating to the classification, packaging and labelling or dangerous preparations. Official Journal of the European Commission 1988;L187:14-30.
5. Friedman,M. Chemistry, biochemistry, and safety of acrylamide. A review // J. Agr. Food Chem., 2003, 51, 4504-4526.
Altayeva A.A.
Influence of different regimes of the acrylamide administration on сytogenetic and structural and functional indicators in rats endocrine glands
A.N.Sysin Research Institute for Human Ecology and Environmental Health, Ministry of Health and Social Development
Acryimide mutagenic action in a 0.1LD-like dose on endocrine glands cells was revealed at different time regimes. It was also noted an increase of proliferous processes in that organ which were determined basing on indicators of "a sum of cells with two or more nuclei" and "fraction of interfollicular tissue". An in creased profileration was accompanied by a growing functional activity of endocrine glands which was evaluated by increasing fraction of colloid with absorption. Results produced allow to suppose that acrylamide inducing cytogenetic disturbances and changes in the proliferataion of endocrine glands cells leads to the development of neoplasms in that organ.
Материал поступил в редакцию 16.06.2010
