CC BY
69
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-3-71-76
УДК 576
ЦИТОМОРФОЛОГИЯ БУККАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ У ЛИЦ С ВРОЖДЕННЫМИ ПАТОЛОГИЯМИ РЕЧИ БЕЗ ОТЯГЧАЮЩИХ ПСИХОНЕВРОЛОГИЧЕСКИХ
ДИАГНОЗОВ
Молоканова Ю.П.
ГОУ ВО МО Московский государственный областной университет, г. Москва, Российская Федерация
Аннотация. Исследована цитоморфология буккальных эпителиоцитову лиц юношеского возраста с врожденными патологиями речи без отягчающих психоневрологических диагнозов, стоматологических проблем и вредных привычек. Выявлено достоверное снижение доли клеток нормы и увеличение доли клеток с разными цитогенетическими нарушениями в соотношении 1х10 (1Х1=0,1%, Р<0,001). В 1,5раза чаще регистрируются клетки с цитогенетическими нарушениями (^=5%, Р<0,05); почти в три раза чаще - клетки с начальными признаками деструкции ядра (^=0,1%, Р=0,001). Нарушение процессов пролиферации достоверно чаще выражается в двуядерности (^=5%, Р<0,05). Из признаков завершения деструкции ядра достоверно чаще регистрируется кариорексис (^=0,1%, Р<0,001). Индекс накопления цитогенетических нарушений отражает высокий риск цитогенетических патологий клеток буккального эпителия (^=1%, Р<0,01).
Ключевые слова: буккальный эпителий, цитоморфология, микроядерный тест, индекс накопления цитогенетических нарушений.
Введение. Эпителий слизистой оболочки полости рта служит естественным барьером между внешней и внутренней средой, препятствуя проникновению в организм различных чужеродных и патогенетических веществ. Эпителий слизистой оболочки ротовой полости подвержен механическому травмированию, воздействию широкого спектра температур и значений рН, раздражающих и повреждающих веществ [1]. Нарушение барьерных и регенеративных процессов проявляется цитоморфологическими отклонениями эпителиальных клеток от нормы (рис.1), отражая те или иные нарушения гомеостаза внутренней среды организма [2]. Исследование клеток поверхностного слоя слизистой оболочки ротовой полости на предмет выявления различных цитогенетических патологий считается перспективным методом клинико-лабораторной диагностики [3;4;5].
При исследовании цитогенетических патологий в клетках нередко применяют микроядерный тест [6;7;8]. Являясь малоинвазивным, быстрым, низкотру-дозатратным и экономически целесообразным, метод микроядерного теста позволяет получить достоверные результаты оценки воздействия на организм различных экзо- и энодогенных факторов [2]. В настоящее время выявлена зависимость стабильности соматического генетического аппарата человека от состояния его нервной системы [9;10;11]. Тем не менее, нет све-
дений о генетической стабильности в регенерирующихся эпителиальных тканях у лиц с врожденными речевыми патологиями без отягчающих психоневрологических диагнозов.
Материалы и методы. Для изучения данного вопроса проведено цитоморфологическое исследование клеток поверхностного слоя буккального эпителия у 20 16-18-летних воспитанников специальной (коррек-ционной) общеобразовательной школы-интерната V вида, одного из районов Московской области. Все волонтеры имели нормальный слух, зрение и интеллект на фоне врожденных речевых патологий: алалия, афазия, дизартрия, ринолалия, общее недоразвитие речи. Других психоневрологических диагнозов у волонтеров не было. В качестве контроля использован биологический материал от 20 добровольцев того же возраста без хронических заболеваний и патологий. Все доноры не имели вредных привычек, стоматологических проблем и были здоровы на момент забора материала. От всех участников исследования или их опекунов получено письменное согласие на предоставление биоматериала.
Биоматериал (клетки поверхностного слоя буккаль-ного эпителия) был собран осенью 2017 года стандартным способом [12]. Забор материала проводился стерильным шпателем с внутренней поверхности щеки 3-4-мя поскабливающими движениями сверху вниз и на себя с заходом в щечно-десневой карман. Собранный
биоматериал наносился на предметные стекла с последующим приготовлением мазков-препаратов, окрашенных по методу Романовского-Гимзе. Мазки-препараты исследовали при увеличении в 400 раз, оценивая отдельно лежащие неповрежденные клетки, с последующим перерасчетом на 1000 клеток, учтенных в препарате [12].
Результаты и обсуждение. При интерпретации результатов учитывались нормальные клетки, а также клетки с разными цитоморфологическими параметрами (рис.1).
Как видно из таблицы 1, в биоматериале экспериментальной группы клетки нормы (рис.1.1) регистрировались в два раза реже, чем в контрольной группе.
Рис. 1. Буккальные эпителиоциты:
1 - норма; цитогенетические показатели: 2 - клетка с микроядрами; 3 - клетка с протрузией ядра; 4 - клетка с ядром атипичной формы; показатели пролиферации: 5 - клетка с двумя ядрами; 6 - клетка с круговой насечкой ядра; деструкции ядра (апоптоз или некроз): 7 - клетка с перинуклеарной вакуолью; 8 - клетка с вакуолизацией ядра; 9 - клетки с конденсацией хроматина; завершение деструкции ядра: 10 - клетка с кариорексисом; 11 - клетка с кариопикнозом; 12 - клетка с карио-лизисом. (окраска по Романовскому-Гимзе, увеличенные микрофотографии)
Цитогенетические аномалии эпителиоцитов отме- окруженное единой ядерной мембраной [2], в 1,5 раз чены достоверно чаще у экспериментальной группы, чаще встречалась в препаратах экспериментальной чем в контроле. Так, протрузия ядра (рис.1.3), визуали- группы. Подобная аномалия считается следствием зирующаяся как образование типа микроядра, связан- нарушений в интерфазе митоза [13]. ное с основным ядром хроматиновым мостиком и
Таблица 1
Выявленные особенности цитоморфологии клеток буккального эпителия у 16-18-летних лиц экспериментальной и контрольной группы (среднее число клеток, %о)
Цитоморфологические показатели Экспериментальная группа Контрольная группа
норма 207,94 ± 14,59* 504,12 ± 56,28*
Цитогенетические показатели
микроядерность 83,11 ± 8,91 75,95 ± 9,73
протрузия ядра 101,24 ± 11,37** 60,76 ± 8,64**
атипичная форма ядра 75,52 ± 5,28* 32,84 ± 6,51*
Разница достоверна: * при 0,1% уровне значимости с вероятностью Р<0,001; * * при 1 % уровне значимости с вероятностью Р<0,01; *** при 5%уровне значимости с вероятностью Р<0,05.
Показатели пролиферации
двуядерность 65,04 ± 7,35*** 40,42 ± 6,60***
круговая насечка 33,09 ± 4,10 20,77 ± 7,54
Показатели деструкции ядра
перинуклеарная вакуоль 54,06 ± 4,46** 28,94 ± 6,38**
вакуолизация ядра 66,69 ± 5,32* 15,25 ± 4,42*
конденсация хроматина 59,92 ± 5,50* 20,51 ± 5,62*
Показатели завершения деструкции ядра
кариорексис 68,30 ± 7,58* 26,83 ± 6,24*
кариопикноз 74,47 ± 5,18 88,28 ± 14,24
кариолизис 110,62 ± 12,53 85,36 ± 8,87
Клетки с атипичной формой ядра (рис.1.4) - признак хромосомных мутаций [5] - отмечены в биоматериале экспериментальной группы более чем в два раза чаще, чем в контроле. Достоверных различий в частоте встречаемости буккальных эпителиоцитов с микроядрами не выявлено. Микроядра (рис.1.2) представляют собой ацентрические хромосомные фрагменты или целые хромосомы, не вошедшие в ядро из-за нарушения процессов митоза [4]. В совокупности цитогенетиче-ские патологии в буккальных эпителиоцитах с высокой долей достоверности преобладали в биоматериале экспериментальной группы (^=5%, Р<0,05).
Из показателей нарушения процесса пролиферации достоверны различия встречаемости двуядерных клеток (табл.1). Такие эпителиоциты более, чем в 1,5 раза чаще регистрировались в биоматериале экспериментальной группы. Клетки с двумя и более ядрами (рис.1.5) свидетельствуют о нарушении процесса пролиферации клеток базального и нижних отделов шиповатого слоев, являясь результатом полиплоидизирую-щего ацитокинетического митоза [14].
Все показатели деструкции ядра достоверно чаще 0^=0,1%, Р<0,001) визуализировались в биоматериале экспериментальной группы (табл.1). Вакуализация ядра - более светлый участок внутри ядра (рис.1.8) -как одна из начальных форм ранней гибели клетки по пути некроза [4;13] регистрировалась в экспериментальной группе в 4,4 раза чаще, чем в контроле. Пери-нуклеарная вакуоль - более светлый участок цитоплазмы вокруг ядра (рис. 1.7) - регистрировалась почти в два раза чаще. Конденсация хроматина - образование неоднородно окрашенных хроматиновых глыбок в кариоплазме (рис.1.9), считающаяся начальным этапом апоптоза клетки путем кариорексиса [2], - почти в три раза чаще регистрировалась в биоматериале экспериментальной группы.
Из показателей завершения деструкции ядра достоверная разница выявлена в отношении кариорексиса (табл.1), при котором визуализируются отдельные
скопления хроматина, не окруженные кариолеммой. Деструкция ядра буккальных эпителиоцитов путем ка-риорексиса (рис.1.10) в 2,5 раза чаще регистрировалась у лиц экспериментальной группы. В отношении карио-пикноза (рис.1.11) - естественной формы деструкции ядра путем апоптоза, которая сопровождается значительным уменьшением относительного размера ядра, и в отношении кариолизиса (рис.1.12) - некротической формы ядерной деструкции, которая визуализируется как бледно окрашенный, лишенный кариолеммы рассредоточенный в цитоплазме хроматин [2;5], не выявлено статистически достоверных отличий. Тем не менее, статистически значимая разница в показателях ранних признаков деструкции ядра в биоматериале экспериментальной и контрольной группы может косвенно свидетельствовать о повышенной скорости клеточной гибели и обновления буккального эпителия у лиц экспериментальной группы. Совокупные показатели клеточной деструкции по пути некроза (пери-нуклеарная вакуоль, вакуолизация ядра, кариолизис) у лиц экспериментальной группы регистрировались достоверно чаще (в 1,8 раз), чем в контрольной группе (^=0,1%, Р<0,001).
Сравнивая совокупное соотношение доли клеток нормы и клеток с разными формами цитоморфологи-ческих патологий, выяснили: в биоматериале, полученном от лиц контрольной группы, доля клеток нормы относится к доле клеток с патологиями как 8 х 1. В биоматериале от лиц экспериментальной группы это соотношение принимает обратный вид -клетки нормы относятся к клеткам с патологиями как 1 х 10.
Увеличение доли клеток с признаками нарушения процесса пролиферации и с признаками некротической деструкции повышает риск патологического перерождения эпителиальных клеток, т.к. известно, что до 92% всех злокачественных новообразований человека возникает в эпителиальных тканях [15].
Для оценки риска возникновения цитогенетических нарушений в буккальном эпителии лиц экспериментальной и контрольной групп, рассчитан индекс накопления цитогенетических нарушений (Index of accumulation of cytogenetic damage (Iac)) по формуле
[4]:
Iac = (1с • Ip/Iapop) ^100, где
Iac (Index of accumulation of cytogenetic damage) -индекс накопления цитогенетических нарушений; k -(cytogenetic index) - интегральный показатель цитоге-нетических нарушений (сумма клеток с микроядрами, ядерными протрузиями и межъядерными мостами в промилле); Ip - (index of proliferation) - интегральный
показателя пролиферации (сумма клеток с двумя и более ядрами в промилле); Iapop - (apoptotic index) -апоптический индекс (сумма клеток в апоптозе, включая конденсацию хроматина и начало кариолизиса, учтенного как вакуализация ядра, в промилле).
Выделяют три группы риска цитогенетических повреждений: низкий (Iac<2), умеренный (2 <Iac <4) и высокий (Iac>4).
Из таблицы 2 видно: лица экспериментальной группы находятся в группе высокого риска накопления цитогенетических нарушений в буккальном эпителии. У лиц контрольной группы индекс накопления цитоге-нетических нарушений приближается к верхней границе умеренного риска.
Таблица 2
Индекс накопления цитогенетических нарушений в клетках буккального эпителия у 16-18-летних
лиц экспериментальной и контрольной группы
Дифференциальные критерии Л - cytogenetic index Ip - index of proliferation Iapop -apoptotic index Iac= (Ic*Ip)/Iapop
Экспериментальная группа 25,986 9,813 43,407 5,875**
Контрольная группа 16,952 6,119 26,517 3,912**
**разница достоверна при 1%уровне значимости с вероятностью Р<0,01.
Выводы. Таким образом, у лиц с врожденной речевой патологией без отягчающих психоневрологических диагнозов, вредных привычек и стоматологических проблем, обучающихся в школе-интернате V вида, выявлены статистически достоверные особенности цитоморфологии буккальных эпителиоцитов по сравнению со сверстниками без хронических заболеваний и патологий.
Выявленные цитоморфологические особенности выражаются в значительном снижении доли клеток нормы и повышением доли клеток с разными формами цитогенетических аномалий в 10 раз.
У лиц с врожденными патологиями речи процесс деструкции клеток буккального эпителия в 3 раза чаще развивается путем некроза, чем апоптоза (^=1%, Р<0,01). В их биоматериале, в 1,5 раза чаще встречаются клетки с признаками нарушения процессов регенерации и пролиферации (к=5%, Р<0,05).
В совокупности, выявленные аномалии у лиц с врожденными патологиями речи, обучающихся в школе-интернате V вида, повышают уровень риска развития в буккальном эпителии цитогенетических нарушений онкогенного характера (к=1%, Р<0,01).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Быков В.Л. Функциональная морфология эпителиального барьера слизистой оболочки полости рта // Стоматология, 1997. № 3. С. 12-17.
[2] Юрченко B.B. Mикроядерный тест на буккальных эпи-телиоцитах. Полиорганный микроядерный тест в эко-лого-гигиенических исследованиях / под. ред. Рахма-нина Ю.А., Сычевой Л.П. M.: Гениус, 2007. 320 с.
[3] Абаджиди M.A., Maхровa Т^., Maянскaя KB., Заславская M.K, Строгова Ю.Ю., Maянский А.Н., Буккаль-ные эпителиоциты как инструмент клинико-лаборатор-ных исследований // Нижегородский медицинский журнал. 2003. № 3-4. С. 105-110. [Электронный ресурс]. URL: http://www.medicum.nnov.ru/nmj/2003/3-4/23.php.
[4] Сычева Л.П. Биологическое значение, критерии определения и пределы варьирования полного спектра ка-риологических показателей при оценке цитогенетиче-ского статуса человека // Mедицинскaя генетика. 2007. Т. 6 (11). С. 3-11.
[5] Tolbert P.E., Shy C.M., AllenJ.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: methods development // Mut. Res. 1992. 271. P. 69-77.
[6] Нерсесян А.К. Mикроядерный тест в эксфолиативных клетках человека как метод изучения действия мутагенов/канцерогенов // Цитология и генетика, 1996. Т. 30. № 5. С. 91-96.
[7] Сычева Л.П. Цитогенетический мониторинг для оценки безопасности среды обитания человека // Гигиена и санитария. 2012. № 6. С. 68-72.
[8] Schmid W. The micronucleus test // Mutat. Res. 1975. № 1 (31). Р. 9-15.
[9] Калаев B.H., Нечаева M.C, Попова И.Е. Bлияние агрессивности спортсменов на их кариологический статус // Mедико-биологические и педагогические основы адаптации, спортивной деятельности и здорового образа
жизни: сб. науч. статей 2 Всерос. заочн. науч.-практ. Конференции с международ. участием. Воронеж: Научная книга, 2013. С. 7-62.
[10] Калаев В.Н., Скамрова Г.Б., Игнатова И.В. Оценка стабильности генетического материала мужчин, больных параноидальной шизофренией, на разных стадиях лечения с использованием микроядерного теста в буккаль-ном эпителии // Экологическая генетика человека. 2015. Т. XIII. № 3. С. 3-14.
[11] Соболь М.В., Афанасьева Е.С., Безруков В.Ф. Частота микроядер и уровень тревожности у школьников // Вюн. Укр. Тов-ва генетикш и селекцюнерш. 2008. Т. 6 (1). С. 131-136.
[12] Использование микроядерного теста для оценки эффективности лечения аллергии у детей: метод. рекомендации / сост.: Т.С. Колмакова, С.Н. Белик, Е.В. Моргуль, А.В. Севрюков. Ростов н/Д: Изд-во РостГМУ, 2013. 31 с.
[13] Мейер А.В., Дружинин В.Г., Ларионов А.В., Толочко Т.А. Генотоксические и цитотоксические эффекты в буккальных эпителиоцитах детей, проживающих в экологически различающихся районах Кузбаса // Цитология. 2010. Т. 52. № 4. С. 305-310.
[14] Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. М.: Наука, 1981. 237 с.
[15] Cairns J. Mutational selection and natural history of cancer // Nature (London). 1975. V. 255. Р. 197-200.
CYTOMORPHOLOGY OF BUCHAL EPITHELIAL CELLS OF YOUNG PEOPLE WITH CONGENITAL PATHOLOGY OF SPEECH WITHOUT PSYCHONEUROLOGICAL
DIAGNOSES
Molokanova Yu.P.
Moscow Region State University, Moscow, Russian Federation
Annotation. Researched cytomorphology of buccal epithelial cells of young people with congenital speech pathology without psycho-neurological diagnoses, dental problems and bad habits. A significant decrease in the proportion of normal cells and an increase in the proportion of cells with different cytogenetic disorders in a ratio 1x10 (tst=0,1%, P=0,001). Cells with cytogenetic disorders are registered in 1,5 times more likely (tst=0,1%, P=0,001); cells with initial signs of degradation of the cell nucleus recorded almost three times more often (tst=0,1%, P=0,001). Disorders of proliferation processes is more often expressed in doubling the nucleus (tst=5%, P=0,05). Completion of the destruction of the nucleus is significantly more often recorded as karyorexis (tst=0,1%, P=0,001). The accumulation index of cytogenetic disorders reflects a high risk of cytogenetic pathologies of cells of the buccal epithelium (tst=1%, P=0,01).
Key words: buccal epithelial cells, cytomorphology, micronucleus test, Index of accumulation of cytogenetic damage.
REFERENCES
[1] Bykov V.L. Funktsional'naya morfologiya epitelial'nogo bar'era slizistoi obolochki polosti rta // Stomatologiya, 1997. № 3. p. 12-17.
[2] Yurchenko V.V. Mikroyadernyi test na bukkal'nykh epiteli-otsitakh. Poliorgannyi mikroyadernyi test v ekologo-gi-gienicheskikh issledovaniyakh / pod. red. Rakhmanina Yu.A., Sychevoi L.P. M.: Genius, 2007. 320 p.
[3] Abadzhidi M.A., Makhrova T.V., Mayanskaya I.V., Zaslavskaya M.I., Strogova Yu.Yu., Mayanskii A.N., Buk-kal'nye epiteliotsity kak instrument kliniko-laboratornykh issledovanii // Nizhegorodskii meditsinskii zhurnal. 2003. № 3-4. p. 105-110. [Elektronnyi resurs]. URL: http://www.medicum.nnov.ru/nmj/2003/3-4/23.php.
[4] Sycheva L.P. Biologicheskoe znachenie, kriterii oprede-leniya i predely var'irovaniya polnogo spektra kariolo-gicheskikh pokazatelei pri otsenke tsitogeneticheskogo sta-tusa cheloveka // Meditsinskaya genetika. 2007. T. 6 (11). p. 3-11.
[5] Tolbert P.E., Shy C.M., Allen J.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: methods development // Mut. Res. 1992. 271. P. 69-77.
[6] Nersesyan A.K. Mikroyadernyi test v eksfoliativnykh kletkakh cheloveka kak metod izucheniya deistviya muta-genov/kantserogenov // Tsitologiya i genetika, 1996. T. 30. № 5. p. 91-96.
[7] Sycheva L.P. Tsitogeneticheskii monitoring dlya otsenki bezopasnosti sredy obitaniya cheloveka // Gigiena i sani-tariya. 2012. № 6. p. 68-72.
[8] Schmid W. The micronucleus test // Mutat. Res. 1975. № 1 (31). P. 9-15.
[9] Kalaev V.N., Nechaeva M.S., Popova I.E. Vliyanie agres-sivnosti sportsmenov na ikh kariologicheskii status // Med-iko-biologicheskie i pedagogicheskie osnovy adaptatsii, sportivnoi deyatel'nosti i zdorovogo obraza zhizni: sb. nauch. statei 2 Vseros. zaochn. nauch.-prakt. Konferentsii s mezhdunarod. uchastiem. Voronezh: Nauchnaya kniga, 2013. p. 7-62.
[10] Kalaev V.N., Skamrova G.B., Ignatova I.V. Otsenka sta-bil'nosti geneticheskogo materiala muzhchin, bol'nykh par-anoidal'noi shizofreniei, na raznykh stadiyakh lecheniya s ispol'zovaniem mikroyadernogo testa v bukkal'nom epitelii // Ekologicheskaya genetika cheloveka. 2015. T. XIII. № 3. p. 3-14.
[11] Sobol' M.V., Afanas'eva E.S., Bezrukov V.F. Chastota mikroyader i uroven' trevozhnosti u shkol'nikov // Bisn. Ukr. Tov-va genetikiv i selektsioneriv. 2008. T. 6 (1). p. 131-136.
[12] Ispol'zovanie mikroyadernogo testa dlya otsenki effek-tivnosti lecheniya allergii u detei: metod. rekomendatsii / sost.: T.S. Kolmakova, S.N. Belik, E.V. Morgul', A.V. Sevryukov. Rostov n/D: Izd-vo RostGMU, 2013. 31 p.
[13] Meier A.V., Druzhinin V.G., Larionov A.V., Tolochko T.A. Genotoksicheskie i tsitotoksicheskie effekty v buk-kal'nykh epiteliotsitakh detei, prozhivayushchikh v ekologicheski razlichayushchikhsya raionakh Kuzbasa // Tsitologiya. 2010. T. 52. № 4. p. 305-310.
[14] Brodskii V.Ya., Uryvaeva I.V. Kletochnaya poliploidiya. Proliferatsiya i differentsirovka. M.: Nauka, 1981. 237 p.
[15] Cairns J. Mutational selection and natural history of cancer // Nature (London). 1975. V. 255. P. 197-200.
