CC BY
8Влияние растворённых газов на процессы замораживания-оттаивания и выживаемость клеточных культур при
консервации
С.В. Уграицкая, Е.Е. Фесенко (мл.)
Институт биофизики клетки РАН — обособленное подразделение ФИЦ ПНЦБИ РАН, 142290, Россия, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3 ugraitskaya@mail. ги
Сохранение биологического материала в замороженном состоянии является актуальной проблемой в связи с бурным развитием медицины и необходимостью развития долговременных криобанков. Требуется как усовершенствовать существующие подходы, разработанные в основном для консервации клеток, повышая их эффективность, так и создать принципиально новые, чтобы решить проблему обратимого замораживания таких объектов как, фрагменты тканей, изолированные органы.
Это невозможно без понимания биологических и физико-химических процессов, сопутствующих охлаждению, замораживанию и последующему оттаиванию биоматериала, который, как известно, может подвергаться при криоконсервации механическому воздействию со стороны растущих кристаллов льда и осмотическому стрессу. В средах с биологическим материалом всегда присутствуют растворенные газы, которые оказывают влияние на физические и биологические процессы, сопутствующие охлаждению и замораживанию. Прежде всего, это растворенные газы воздуха: азот, кислород, углекислый газ и аргон. Молекулы этих газов вытесняются из растущих кристаллов льда. До сих пор остается открытым вопрос, какое влияние оказывают данные газы, а также их замена на другие газы (Не, №, N2, Кг, Лг, Хе, на процессы кристаллизации, сохранность и выживаемость биоматериала в процессе криоконсервации.
Затронута малоисследованная область криобиологии и биофизики, касающаяся влияния растворенных газов на процессы кристаллизации при низкотемпературной консервации биологического материала. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание механизмов влияния растворенных газов на процессы замораживания, выживаемость клеточных культур при криоконсервации. Впервые предложено рассматривать газы как потенциальные криозащитные агенты. Показано, что природа растворенного в жидкости газа оказывает влияние на сохранность клеточных линий HeLa и L929 при криоконсервации Выживаемость клеток HeLa и L929 уменьшается в ряду He<Ne<SF6<N2<Ar<Kr<Xe. Данный ряд совпадает с ростом растворимости газа в воде. В ряду инертных газов степень положительного воздействия на выживаемость клеток после криоконсервации снижается по мере роста молекулярной массы растворенного газа. Гелий и неон обладают выраженными криозащитными свойствами, в 1.5-2 раза повышая выживаемость клеточных линий по сравнению с воздухом. Предложен и экспериментально обоснован способ снижения рабочей концентрации криопротектора (а, следовательно, и связанного с ним токсического действия протектора на биообъекты) за счет применения данных газов. Раскрыт механизм криозащитного действия гелия, основанный на замещении газов воздуха (дегазация) и уменьшении образования газовых микропузырьков во время кристаллизации за счет снижения газовой составляющей раствора, а также способности легких инертных газов растворяться во льду. Для формируемого при этом массива льда характерна тенденция к снижению вероятности растрескивания при охлаждении до минус 50°С, что положительно сказывается на сохранности замораживаемого биоматериала.
Показано, что для некоторых клеточных объектов гелий может быть использован для разработки протоколов криоконсервации с полным отказом от применения традиционных криопротекторов. Последнее может быть востребовано для криоконсервации биологического материала медицинского назначения. Понимание закономерностей поведения газов в растворе и их влияния на биологические объекты при замораживании в перспективе может привести к появлению дополнительного инструмента разработки и оптимизации эффективных протоколов криоконсервации широкого спектра биоматериалов.
