CC BY
95
УДК 639.3.034.001.26
Е. Н. Пономарева, М. М. Богатырева, Н. В. Болонина, А. М. Тихомиров
ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ КРИОКОНСЕРВАЦИИ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК СЕВРЮГИ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИИ
Введение
К концу 80-х гг. XX в. стало ясно, что скорость вымирания видов к этому моменту в 100-1 000 раз превысила скорость вымирания видов во времена глобальных пермской и меловой катастроф. Это обстоятельство указывает на то, что на планете Земля развертывается не экологический кризис, а начальная стадия антропогенной катастрофы [1], и криоконсервация генетических ресурсов становится единственно возможным способом успеть сохранить генотипы ряда видов живых существ перед их исчезновением в природе [2, 3].
Сохранение генетического разнообразия рыб, многие из которых или уже утеряны, или находятся на грани исчезновения, является острейшей проблемой охраны природы, а также современного рыбоводства. По имеющимся данным, в Красную книгу Международного союза охраны природы и природных ресурсов занесено около 300 видов рыб и рыбообразных, а в Красную книгу России - более 50 видов, находящихся под угрозой исчезновения и требующих немедленного участия в их сохранении. Проблема сохранения рыб, находящихся под угрозой исчезновения, актуальна как для морских, так и для пресноводных объектов [4].
В последние годы в экосистемах водоемов произошли существенные изменения, в результате которых наблюдается снижение численности осетровых рыб. В связи с этим основным источником формирования и поддержания запасов осетровых стало их искусственное воспроизводство. Однако в настоящее время отмечается уменьшение масштабов заводского воспроизводства осетровых. Одной из причин этого является отсутствие возможности заготовки производителей с высокими рыбоводно-продуктивными показателями.
Криоконсервация остается одним из наиболее привлекательных и быстроразвивающихся направлений сохранения редких исчезающих видов. Наличие в криобанке генетически репрезентативных коллекций геномов рыб и маточных стад на осетровых рыбоводных заводах позволяет с максимальным эффектом сохранить генетическое разнообразие этих ценных промысловых объектов.
Двойной температурный шок, которому подвергаются клетки при замораживании и оттаивании, неминуемо сопровождается потерей энергии, поэтому нередко наблюдают целые неповрежденные клетки, которые после дефростации остаются неподвижными. По-видимому, причина кроется в том, что клеткам, потерявшим значительный запас энергии, не хватает последней, чтобы запустить процессы дыхания и метаболизма - основные характеристики их жизни.
Питательные вещества, которыми снабжены криопротекторы, предназначенные для компенсации потерянной энергии, по-видимому, не достигают цели из-за отсутствия энергии, необходимой для увеличения проницаемости мембран органелл, а именно митохондрий. Как известно из основ физиологии, проницаемость последних увеличивается после запуска натрий-калиевого насоса, а его работа связана с потреблением энергии с помощью выделенной АТФ. Таким образом, чтобы запустить работу клеток после двойного температурного шока, необходимо инициировать проницаемость мембран органелл клеток без дополнительных затрат энергии. Это возможно при использовании различного рода стимуляций (механических, химических, электрических и т. д.). Наиболее перспективной является электрическая стимуляция, т. к. эти электрические поля являются естественным стимулятором жизни.
Материал и методы исследований
Исследования влияния электростимуляции на проницаемость протекторов в половые клетки осетровых рыб и их сохранение в процессе криоконсервации проводили в лаборатории «Аквакультура и биологические ресурсы» Южного научного центра Российской академии наук совместно с кафедрой «Аквакультура и водные биоресурсы» Астраханского государственного технического университета в 2008 г.
Целью исследований являлось повышение выживаемости дефростированных сперматозоидов для сохранения генофонда осетровых рыб. Основной задачей было выявление влияния электростимуляции на проницаемость мембран половых клеток для улучшения проникновения криопротекторов, предохраняющих биологический материал от повреждений в процессе криоконсервации.
Материалом для исследований служила сперма севрюги, полученная на осетровых рыбоводных заводах Нижней Волги. Получение спермы осуществляли методом гипофизарных инъекций. Микроскопированием определяли активность половых клеток по 5-балльной шкале Г. М. Персова [5], отмечая процентное соотношение спермиев с поступательным и колебательным движением от общего количества живых сперматозоидов. В работе использовали сперму только высокого качества.
Перед началом работы всю необходимую посуду, сперму, криозащитные среды охладили до температуры 10-15 °С. К охлажденной сперме добавили криозащитные среды, провели электростимуляцию и выдержали при температуре 10-15 °С в течение 40 минут. Соотношение спермы и криозащитной среды составило 1:1. Криоконсервацию проводили по методике Л. И. Цветковой с соавторами [6].
На рис. 1 приведена схема установки для электростимуляции сперматозоидов осетровых рыб.
Рис. 1. Схема экспериментальной установки для электростимуляции половых продуктов рыб:
1 - емкость со спермой, 2 - электроды, 3 - ЭСЛ-50-1, 4 - фальаппарат, 5 - С1-65А
Для стимуляции спермы рыб была изготовлена емкость 1 с плотно закрывающейся крышкой. Электрический разряд определенной формы, частоты и амплитуды осуществляли с помощью стальных электродов 2. Характеристики разрядов формировали с помощью фаль-аппарата 4 и электростимулятора ЭСЛ-50-1 3. Параметры сигнала регистрировали на осциллографе С1-65 А 5. Время экспозиции разрядов регистрировали с помощью секундомера. Аппаратуру перед началом эксперимента калибровали с использованием стандартных методик. Целью эксперимента было установить характеристики электрического разряда, оказывающего стимулирующее действие на сперму осетровых рыб. Последний был разбит на ряд серий, в которых исследовали поэтапно влияние различных характеристик разряда.
Установление параметров прямоугольного электрического раздражителя осуществляли в несколько этапов. В частотном диапазоне апробировали сигналы в низкочастотной (20-80 Гц), в среднечастотной (120-600 Гц) и в высокочастотной (1 000-15 000 Гц) областях. В каждой серии опытов выделяли сигнал, вызывающий наибольшую проницаемость мембран клеток спермиев. На завершающем этапе сравнивали три сигнала, показавшие наибольшие значения в каждой из трех областей. Эта серия опытов спланирована по типу однофакторного блочного эксперимента, реализованного в три повторности [7]. За факторы принимали следующие частоты раздражителя: 20, 120 и 6 000 Гц, за блоки - образцы спермы от трех самцов севрюги.
Результаты статистической обработки выявили достоверные различия как между блоками, так и между факторами. По значениям коэффициентов регрессии построен ранжированный ряд (рис. 2) стимулирующего действия электрического раздражителя на сперму севрюги.
■ Контроль И20 Гц Ш100 Гц ®6 000 Гц
Рис. 2. Действие электрического раздражителя на сперму севрюги:
1 - коэффициент регрессии; 2 - время жизни, с
Из рис. 2 видно, что оптимальной частотой для спермы севрюги является электрический раздражитель частотой 20 Гц.
Были проведены также исследования по определению выживаемости дефростированных сперматозоидов по традиционной и усовершенствованной схемам криоконсервации половых продуктов (рис. 3).
Традиционная схема криоконсервации спермы осетровых рыб
Усовершенствованная схема криоконсервации спермы осетровых рыб
Рис. 3. Схемы криоконсервации спермы осетровых рыб
В результате экспериментов установлено, что электростимуляция оказывает положительное воздействие на сохранность половых клеток в процессе криоконсервации и долгосрочного хранения в жидком азоте. Выживаемость дефростированных сперматозоидов увеличивается в 1,5 раза, время их подвижности - в 2,5 раза.
Заключение
В ходе исследований по влиянию электростимуляции на проницаемость мембран половых клеток осетровых рыб установлено, что действие частот в разных областях на сперматозоиды неодинаково. Наибольшее положительное воздействие оказал низкочастотный диапазон (20-80 Гц), среднечастотный диапазон (120-600 Гц) оказал незначительное положительное воздействие, а высокочастотный диапазон (1 000-15 000 Гц) показал результаты ниже контрольных значений, что отражается на времени подвижности дефростированных образцов спермы. Электростимуляция способствует повышению выживаемости сперматозоидов после замораживания-оттаивания на 30 %, что влияет на оплодотворяющую способность половых клеток и позволяет использовать их в рыбоводных целях.
Таким образом, для совершенствования методики криоконсервации половых продуктов севрюги рекомендуется применять электростимуляцию биоматериала перед этапом эквилибрации с частотой сигнала 20 Гц.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Розанов С. И. Место генетических криобанков в решении проблемы сохранения биоразнообразия // Биофизика живой клетки. - 1994. - Т. 6. - С. 8-13.
2. Карнаухов А. В. К вопросу об устойчивости химического состава атмосферы и теплового баланса Земли // Биофизика. - 1994. - Т. 39, № 1. - С. 148-152.
3. Карнаухов В. Н. Консервация генетических ресурсов на пороге исчезновения // Биофизика живой клетки. - 2003. - Т. 7. - С. 9-10.
4. Криоконсервация спермы рыб: состояние, развитие, перспективы / Л. И. Цветкова, О. Б. Докина, Н. Д. Пронина, В. А. Миленко // Избранные тр. ВНИИПРХ. Кн. 1. Т. 1-11. - Дмитров, 2002. - С. 358-365.
5. Персов Г. М. Дозирование спермиев как способ управления оплодотворением яйцеклеток осетровых // Докл. АН СССР. - 1953. - Т. 90, № 6. - С. 1183-1185.
6. Методическое пособие по криоконсервации спермы карпа, лососевых и осетровых рыб / Л. И. Цветкова, С. И. Савушкина, Л. Н. Титарева и др. - М., 1997. - 10 с.
7. Адлер А. П. Планирование эксперимента. - М.: Металлургия, 1969. - 271 с.
Статья поступила в редакцию 30.04.2009
INCREASE OF EFFICIENCY OF STELLATE STURGEON’S SEXUAL CELLS CRYOPRESERVATION USING ELECTROSTIMULATION
E. N. Ponomareva, M. M. Bogatyreva, N. V. Bolonina, A. M. Tikhomirov
Different kinds of stimulation promote the penetration of protectors into cells and the increasing of their survival rate. The most available one is electric stimulation, as electric field is a natural stimulant of life. The investigations have shown that electric stimulation provides the positive effect on sex cells safety during the cryopreservation and long-term storage in liquid nitrogen. The survival rate of spermatozoids after freezing and defrosting increases by 30 %, that influences the fertilizer of sex cells and allows to use them with fishery purposes.
Key words: cryopreservation, stellate sturgeon, electric stimulation, cryo-protector, frequency of electric signal, survivability.
