CC BY
107
УДК 581.143.6
ВЛИЯНИЕ ПРОДУКТОВ МЕХАНОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТОРФА И ДРЕВЕСНОГО СЫРЬЯ НА МОРФОГЕНЕЗ РАСТЕНИЙ IN VITRO И IN VIVO
© О.А. Рожанская1, Н.В. Юдина2, О.И. Ломовский3, К.Г. Королев3
1Сибирский научно-исследовательский институт кормов, п. Краснообск Новосибирской обл. 630501 (Россия) E-mail: [email protected]
2Институт химии нефти, пр. Академический 3, Томск (Россия) 3Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН, Кутателадзе, 18, Новосибирск, 630128 (Россия)
Изучена биологическая активность веществ, полученных из растительного сырья (торфа и хвои пихты) с целью определения характера воздействия и эффективных доз для регулирования роста и развития растений.
Показано усиление пролиферации каллусной ткани рапса и ускорение развития in vitro побегов и корней люцерны, активность цитокининового типа при регенерации побегов, стимулирование прорастания пшеницы. Определены эффективные концентрации для использования в качестве регуляторов роста растений в сельском хозяйстве и биотехнологии.
Работа выполнена при поддержке гранта CRDF (REC-008) Введение
Повышение продуктивности сельскохозяйственного производства является неотъемлемым условием устойчивого развития общества. Химизация растениеводства внесла и вносит определяющий вклад в повышение урожайности сельскохозяйственных культур. Перспективы дальнейшего роста в растениеводстве связывают с рядом новых факторов, в частности широким использованием регуляторов роста растений - фитогормонов.
Современные синтетические регуляторы роста, как правило, нельзя назвать экологически чистыми. Химическая опасность и высокая стоимость ограничивают их широкое применение.
Механохимические методы повышения биологической активности веществ растительного происхождения основаны на твердофазном превращении этих веществ в растворимые формы. Осуществлять такие превращения представляется возможным при механической обработке смесей порошков растительного сырья и специально подобранных реагентов.
Продукты механохимической обработки могут быть использованы для выделения биологически активных веществ. Выходы ряда активных компонентов растительного сырья увеличиваются в 1,5-2 раза, повышается селективность выделения. Однако наиболее экономически эффективными оказываются варианты, в которых возможно непосредственное использование продукта механохимического превращения в качестве готовой формы препарата-регулятора роста.
Обычно регуляторы роста извлекаются из растительного сырья путем экстракции органическими растворителями. Существенными преимуществами механохимического подхода являются исключение из технологии большого количества органических растворителей, снижение материальных и трудовых затрат на производство. Дополнительно появляется возможность использовать в качестве источника биологически активных веществ невостребованные ресурсы - отходы сельскохозяйственного
* Автор, с которым следует вести переписку.
производства и лесной промышленности, сырья с низким содержанием активных веществ. Таким образом, применение твердо-фазной механохимической переработки растительного сырья может сделать регуляторы роста растений доступными для массового использования.
Для успешной пролиферации растительных тканей in vitro в большинстве случаев необходимы экзогенные регуляторы роста (фитогормоны). При культивировании клеток растений чаще всего используются вещества, принадлежащие к двум типам фитогормонов: ауксины, способствующие увеличению размеров клеток, и цитокинины, вызывающие их деление. Типичная схема гормонального контроля органогенеза описана Скугом и Миллером [1] на примере каллуса табака: образование побегов стимулируется при условии преобладания концентрации цитокинина по отношению к ауксину, тогда как обратное соотношение способствует образованию корней. Эта модель приемлема для большинства видов растений; при этом концентрации гормонов широко варьируют и для каждого вида или сорта определяются эмпирически [2].
Известно, что гуминовые вещества торфа и тритерпеновые кислоты пихты обладают выраженной биологической активностью по отношению к растениям. В настоящее время применяются различные стимуляторы роста на основе торфа и запатентовано несколько способов использования тритерпеновых кислот для выращивания риса, томатов, картофеля и овощных культур [3-6].
Цель исследований - тестирование веществ, полученных из торфа и хвои пихты, на пригодность к использованию в качестве регуляторов роста растений in vitro и in vivo.
Экспериментальная часть
Изучали эффективность продуктов механохимической активации и водорастворимых препаратов двух видов торфа: В - верхового сфагнового из месторождения Темное со степенью разложения 5% мас., зольностью 3,7% мас.(В2, В3) и Т - низинного древесного торфа месторождения Таганское со степенью разложения 30% мас., зольностью 25,5% мас.(Т2,Т3, ТП). Механохимическая активация торфа проводилась в виброцентробежной мельнице-активаторе ВЦМ 10 [7]. Препарат из хвои пихты (СП) представлял собой сумму тритерпеновых кислот, которая была выделена из кислой части древесной зелени пихты (Abies sibirica Ledeb.) по известной методике [8]. В качестве тест-объектов использовали важные сельскохозяйственные культуры: рапс (Brassica napus L.), люцерну (Medicago varia Mart.), пшеницу (Triticum aestivum L. ).
Навески механоактивированного торфа ТП3, ТП5, ТП12 в виде порошка добавляли в готовую горячую питательную среду и тщательно размешивали. Навески водорастворимых препаратов из торфа В и Т растворяли в горячей дистиллированной воде и добавляли в готовую среду. Препарат из пихты растворяли в горячей воде с добавлением 0,1 н NaOH. Среды разливали по пробиркам или колбам и автоклавировали при 1,25 атм в течение 30 мин.
Проведена серия экспериментов in vitro, где в опытных вариантах в состав питательных сред вводили изучаемое вещество в разных концентрациях, а в качестве контроля использовали базовые методики. Образование каллуса на эксплантах из листовых тканей рапса происходит при добавлении в агаризованную среду MS [9] ауксина 2,4-Д; регенерация побегов начинается после переноса каллусной ткани на среду MS с добавлением цитокинина 6-бензиламинопурина (БАП). У люцерны рост побегов и корней при микроклональном размножении происходит на агаризованной среде Гамборга В5 [10] половинной концентрации в присутствии кинетина. Условия культивирования тканей in vitro: температура 18-24° С, фотопериод 16 ч, дополнительная освещенность 3 тыс. люкс, длительность 4-6 недель. Определяли частоту образования каллуса, корней, побегов; объем каллуса; высоту побегов, количество листьев и корней; длину корней.
Вегетационные опыты in vivo представляли собой проращивание семян пшеницы в растворах изучаемых веществ и регулярное измерение проростков в первые 10 дней развития. Ранние стадии онтогенеза, как правило, коррелируют с более поздними параметрами развития и продуктивности растений, что позволяет использовать проростки в качестве биотестов [11]. Семена сорта Новосибирская S9 раскладывали на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой, на подложке из плотной бумаги, закатывали в рулоны и помещали в стаканчики с растворами изучаемых веществ; учитывали энергию прорастания и всхожесть семян, высоту побегов и максимальную длину корней, массу проростков.
Количество эксплантов или семян в опытах было не менее 30 на вариант, повторность во времени 3-кратная, результаты опытов обработаны методами дисперсионного анализа и с помощью непараметрических критериев статистики [12].
Обсуждение результатов
1. Влияние продуктов механоактивации торфа на образование каллуса из листьев рапса in vitro.
Изолированная листовая ткань рапса в контрольном варианте приступала к недифференцированному росту (каллусообразованию) в течение первой недели культивирования. Каллус желтого цвета зернистой структуры и плотной консистенции формировался вдоль надрезов и постепенно покрывал всю площадь экспланта. Процесс первичного каллусообразования из листовой ткани рапса является ауксинзависимым и невозможен без экзогенного ауксина в питательной среде (2,4-Д) (табл. 1).
В конце первой недели культивирования определяли частоту образования каллусной ткани по надрезам листовых пластинок. Во всех вариантах наблюдали образование каллуса на 100% эксплантов. Через 2 недели при оценке морфогенеза вариант с добавкой ТП3 превосходил контроль по доле эксплантов с более развитыми каллусами. Через 4 недели инкубации объем каллусов на средах с ТП3 и ТП5 превосходил уровень контроля на 12-14% (статистически недостоверно).
Экспланты каллусной ткани объемом около 100 мм3 были пассированы на свежие среды, содержащие цитокинин БАП 1 мг/л (контроль) или изучаемые регуляторы роста в количестве 50 мг/л (см. табл. 1). За месяц культивирования объем каллусной ткани в контрольном варианте увеличился в 14 раз, а в вариантах с торфяными продуктами в 22-27 раз.
Двухфакторный дисперсионный анализ данных (табл. 2) показал не только достоверное влияние регуляторов роста в пассаже №2, но и последействие торфяных препаратов, особенно ТП12, применявшихся в пассаже №1. Действие указанных факторов носило аддитивный характер.
Результаты опыта свидетельствуют о стимулирующем влиянии продуктов механоактивации торфа ТП на рост изолированных тканей. Препараты из механоактивированного торфа в концентрации 50 мг/л могут применяться в биотехнологии для ускорения образования и роста каллуса.
2. Влияние препарата из хвои СП на каллусообразование рапса in vitro. Экспланты из листовых пластинок рапса площадью около 25 мм2 помещали на различные варианты питательных сред. Опыт проводился в 5 повторностях во времени, длительность культивирования - 3 недели.
В конце первой недели культивирования определяли объем каллусной ткани, образовавшейся по надрезам листовых пластинок (табл. 3).В контрольном варианте наблюдали образование каллуса на 100% эксплантов. В варианте без ауксина с добавкой СП каллусобразование не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии ауксиновой активности у регулятора роста СП. Как уже упоминалось, процесс каллусообразования из листовой ткани рапса является ауксинзависимым и невозможен без экзогенного ауксина в питательной среде. В варианте с 2,4-Д и СП отмечено увеличение активности каллусообразования, прибавка объема каллуса составила от 16 до 97% в разных повторностях опыта.
Таблица 1. Влияние продуктов механоактивации торфа на образование каллуса из листьев рапса in vitro
Параметр Состав питательной среды
Контроль ТП3 ТП5 ТП12
1-й пассаж: Частота каллусообразования, % 100 100 100 100
Объем каллуса, балл (через 2 недели инкубации) 2,9 3,0 2,7 2,6
Объем каллуса, мм3 (через 4 недели инкубации) 730 830 820 720
2-й пассаж: (через 4 недели инкубации) 1360 2197* 2664* 2720*
Объем каллуса, мм3
* Разница с контролем достоверна на уровне 5%. Состав питательной среды: 1-й пассаж - МБ + 2,4-Д 1 мг/л (контроль) + ТП 50 мг/л; 2-й пассаж - МБ + БАП1 мг/л (контроль) или ТП 50 мг/л.
Таблица 2. Воздействие регуляторов роста, применяемых последовательно в двух пассажах, на объем (мм3) каллуса рапса при культивировании in vitro на среде MS
Регуляторы роста (второй пассаж) Регуляторы роста (первый пассаж)
2,4-Д 1 мг/л (контроль) 2,4-Д 1 мг/л + ТП3 50 мг/л 2,4-Д 1 мг/л + ТП5 50 мг/л 2,4-Д 1 мг/л + ТП12 50 мг/л Среднее
БАП 1 мг/л 1490 1476 1094 1446 1377
(контроль)
ТП3 50 мг/л 2364* 1820 2434* 2486* 2276*
ТП5 50 мг/л 1866 2496* 3126* 2462* 2488*
ТП12 50 мг/л 2734* 2432* 2228* 2370* 2441*
Среднее 2114 2056 2221 2241* -
* Разница с контролем достоверна на уровне 5%.
При дальнейшем культивировании конфигурация каллусной ткани усложнялась, что затруднило определение ее объема, поэтому оценка развития каллуса проводилась по 4-балльной системе (0 -отсутствие каллуса, 1 - мало по краям, 2 - каллус покрывает около 1/3 экспланта, 3 - каллус покрывает около 2/3 экспланта, 4 - эксплант сплошь покрыт каллусом). На рисунке 1 представлено распределение эксплантов по степени каллусообразования в процентах от общего количества эксплантов для двух вариантов. Если в контрольном варианте большинство эксплантов имели каллус менее чем на 1/2 поверхности, то в варианте с добавкой СП 74% эксплантов почти сплошь были покрыты каллусом.
Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что препарат из хвои пихты СП не обладает ауксиновой активностью в отношении каллуообразования, но в сочетании с ауксином стимулирует рост каллусной ткани в среднем на 47% от объема и примерно вдвое увеличивает площадь покрытия экспланта каллусом.
3. Влияние СП на морфогенез каллусной ткани из листьев рапса in vitro. Экспланты каллусной ткани объемом около 100 мм3 пассировали на различные варианты питательных сред для регенерации побегов и культивировали 4 недели. Результаты опыта представлены в таблице 4.
Процесс регенерации растений из листовых каллусов рапса является цитокининзависимым и происходит в присутствии БАП. В первые недели культивирования наблюдался рост каллусной ткани и образование тонких корневых волосков, похожих на белый пух, во всех вариантах опыта. Объем ткани в варианте без БАП уступал уровню контроля, а в комплексном варианте значительно превосходил его. К концу месяца на четырех эксплантах в этом варианте сформировались пять растений-регенерантов, в варианте без БАП - один, в контрольном варианте регенерация отсутствовала. Очевидно, СП в концентрации 1 мг/л в сочетании с БАП стимулирует не только рост каллусной ткани рапса, но и регенерацию растений.
4. Влияние препарата из торфа В3 на рост и укоренение побегов из стеблевых почек люцерны in vitro. В опыте с микроклональным размножением люцерны исследовали влияние водорастворимого препарата В3, добавленного в концентрации 10 мг/л в агаризованную среду Гамборга У В5 для культивирования стеблевых узлов (табл. 5).
Если в контрольном варианте (среда У В5 + кинетин 0,5 мг/л) образование корней начиналось через 3-4 недели культивирования, то на среде с добавкой В3 на фоне кинетина уже через 2 недели 42% побегов имели корни. В варианте с добавкой В3 без кинетина отсутствовали достоверные различия с контролем, что говорит о функциональном подобии изучаемого препарата и цитокининов.
5. Влияние регуляторов роста на прорастание семян и развитие проростков пшеницы in vivo в вегетационном опыте. Семена пшеницы в рулонах с фильтровальной бумагой проращивали в стаканчиках с растворами изучаемых веществ, измеряя высоту побегов и длину корней на 2-й, 6-й и 9-й день проращивания. В конце опыта проростки были взвешены. Результаты представлены на рисунке 2 и в таблице 6.
Таблица 3. Влияние регуляторов роста на объем каллусной ткани (мм3) из листовых эксплантов рапса in
vitro (время культивирования 1 неделя)
Среда MS + добавки, мг/л
Дата посадки 2,4-Д 1 СП 1 2,4-Д 1 +
(контроль) СП 1
16.0S.02 5S,5 0,0 6S,0
19.0S.02 41,7 0,0 S2,0*
20.0S.02 52,0 0,0 71,0*
21.0S.02 3S,3 0,0 53,4*
22.0S.02 41,5 0,0 б5,0*
Среднее 46,3 0,0 67,9*
* Разница достоверна на 5% уровне
Таблица 4. Влияние СП на морфогенез в каллусной ткани рапса in vitro
Показатели среда MS+добавки, мг/л
БАП 1 (контроль) СП 1 СП 1+ БАП 1
Объем каллуса:
2 недели 40S 306* 491*
4 недели 955 711* 12S2*
Частота регенерации, % 0 2,5 10,3
* Разница достоверна на 5% уровне
70 т 60 --
Рис. 1. Влияние регулятора роста СП на распределение эксплантов с разной степенью развития каллусной ткани через 3 недели культивирования in vitro
Таблица 5. Влияние В3 на рост побегов и корней люцерны в культуре стеблевых узлов in vitro
Среда Гамборга % В 5 + добавки, мг/л
Показатель кинетин 0,5 (контроль) кинетин 0,5 + В3 10 В3 10
2 недели 4 недели 2 недели 4 недели 2 недели 4 недели
Количество эксплантов 50 50 50 48 50 50
Число побегов на эксплант 1,02 1,04 1,04 1,04 1,06 1,10
Частота ризогенеза, % 0 58 42 71 42 60
Высота побега, см 1,7 2,9 1,8 3,4 1,8 2,6
Количество листьев 1,8 3,0 2,0 3,2 1,9 2,7
Количество корней 0 2,0 2,1 2,3 1,0 1,9
Длина корня, см 0 3,6 1,3 3,9 0,9 3,0
Таблица 6. Влияние регуляторов роста на прорастание семян пшеницы
Варианты добавок, мг/л Энергия прорастания, % Всхожесть, % Сырая масса 9-дневного проростка
мг % к контролю
Без добавок 80 90 126 100
(контроль)
В2, 10 72 86 126 100
В3, 10 83 87 151 120
Т2, 10 87 97 138 110
Т3, 10 97 97 138 110
СП, 1 97 100 174 138
I MS+2,4-Д 1 □ MS+2,4-Д 1+СП 1
4
баллы
50
40
30
20
10
0
3
Рис. 2. Влияние регуляторов роста на развитие побегов пшеницы (1 - контроль, 2 - В2 10 мг/л, 3 - В3 10 мг/л, 4 - Т2 - 10 мг/л, 5 - Т3 - 10 мг/л, 6 - СП - 1 мг/л)
12 дняИ 6 дней □ 9 дней ■ 2 дня ■ 6 дней □ 9 дней
Прорастание начиналось с появления корешка, вслед за ним приступал к росту стебель. Всхожесть и энергия прорастания семян повысились в вариантах с добавками Т2, Т3 (из низинного торфа) и особенно СП (из хвои пихты). Средняя длина побега 2-дневных проростков достоверно увеличилась в вариантах с В3 и СП, длина корешка - во всех вариантах с добавками, кроме В2. У 6-дневных проростков зарегистрировано статистически достоверное (на уровне 1%) увеличение высоты побегов в присутствии В3, Т2 и СП. Корни в варианте с В3 замедлили свой рост, а в вариантах с Т2 и СП значительно опережали контроль.
Особенно сильным стимулирующим действием обладала смесь тритерпеновых кислот из хвои пихты (СП): прибавка по высоте б-дневных побегов составила 144%, по длине 9-дневных корней - 5S%, по массе 10-дневных проростков - 3S% от уровня контроля. Вещество Т3 из торфа обеспечило прибавку по высоте побегов 60%, по длине корней - 40%, по массе проростков - 20%. Стимулирующее влияние добавок В3 и Т3 было менее впечатляющим, но статистически достоверным.
Заключение
Проведенная работа позволила выявить направления и особенности регуляторного воздействия препаратов, приготовленных из торфа и хвои пихты механохимическим методом, на морфогенез рапса и люцерны in vitro и развитие проростков пшеницы in vivo.
Результаты опытов свидетельствуют о стимулирующем влиянии продуктов механоактивации торфа ТП на рост изолированных тканей рапса. В концентрации 50 мг/л они могут применяться в биотехнологии для ускорения образования и роста каллуса.
Препарат из хвои пихты СП не обладает ауксиновой активностью в отношении каллусообразования на листовых эксплантах рапса, но в сочетании с ауксином стимулирует рост первичной каллусной ткани и увеличивает площадь покрытия экспланта каллусом. СП в концентрации 1 мг/л в сочетании с БАП стимулирует рост каллусной ткани рапса и регенерацию растений.
Водорастворимый препарат из торфа В3 в концентрации 10 мг/л стимулирует рост побегов и корней при микроклональном размножении люцерны, в присутствии цитокинина способствует ускорению ризогенеза и увеличению его частоты.
Водорастворимые препараты из торфа В3, Т3 и особенно Т2, а также препарат из хвои пихты СП способны стимулировать рост побегов и корней пшеницы in vivo в вегетационном опыте. Семена пшеницы под действием Т2 , Т3 и СП увеличивают всхожесть и энергию прорастания.
Список литературы
1. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro // Simp. Soc. Exptl. Biol. 1957. №11. P. 11S-131.
2. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro / Биотехнология сельскохозяйственных растений. M., 19S7. С. 105-133.
3. Орлов Д.С. Свойства и функции гуминовых веществ / Гуминовые вещества в биосфере. М., 1993. С. 16-27.
4. Патент России 20S3111. Способ защиты картофеля и овощных культур от болезней / Чекуров В.М., Сычев И.П., Сычев А.И. 1997.
5. Патент России 20S3110. Способ стимулирования плодообразования у томатов / Чекуров В.М., Сычев И. П., Сычев А.И., Ралдугин В.А. 1997.
6. Патент России 210S707. Способ выращивания риса / Чекуров В.М., Вакуленко В.В., Шаповал O.A., Барчукова А.Я., Климов В.П. 199S.
7. Юдина Н.В., Иванов A.A., Ломовский О.И. Водорастворимые биологически активные вещества из торфа // Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений: Материалы междунар. науч.-практ. конф., Томск, 12-15 марта 2003 г. Томск, 2003. С. S7-S9.
S. Ралдугин В.А., Кукина Т.П., Ярошенко Н.И., Пентегова В.А. Тритерпеноиды из видов Abies. Сообщение III // Химия природных соединений. 19S7. №2. С. 306-307.
9. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.
10. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean root cell // Exp.Cell Res. 196S. V. 50. P. 151-15S.
11. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям (Методическое руководство). Л. 19SS. 22S с.
12. Зайцев Г.Н. Математика в экспериментальной ботанике. M., 1990. 295 с.
Поступило в редакцию 15 августа 2003 г.
После переработки 10 декабря 2003 г.
