CC BY
33
УДК 544.47:543.94
ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ ГИДРОФИЛЬНОЙ ИОННОЙ ЖИДКОСТИ НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗ ХРЕНА И СОИ
Д.А. Мясникова, А.Е. Поляков, О.Е. Вашкинская, С.В. Мугинова, Т.Н. Шеховцова
(кафедра аналитической химии химического факультета МГУ; e-mail: dihimik@gmail.com)
Изучена и сопоставлена кинетика катализируемого пероксидазами хрена и сои окисления гваякола пероксидом водорода и шреш-бутилгидропероксидом в присутствии ацетата 1-бутил-3-метилимидазолия, тетрафторборатов 1-бутил-3-метилимидазолия и К-бутил-4-метилпиридиния. Установлено ингибирующее действие ацетатной ионной жидкости на обе пероксидазы, реализуемое по неконкурентному типу; рассчитаны константы Михаэ-лиса и константы ингибирования. Обсуждены причины разной степени ингибирования каталитической активности растительных пероксидаз ионными жидкостями. Показаны преимущества их использования по сравнению с полярными молекулярными органическими растворителями.
Ключевые слова: гидрофильные ионные жидкости, пероксидазы хрена и сои, каталитическая активность, кинетика.
С каждым годом ионные жидкости (ИЖ), органические соли нового поколения, так называемые «дизайнерские растворители», все шире применяют в реакциях и системах с участием ферментов. ИЖ выгодно отличаются от молекулярных органических растворителей (МОР) негорючестью, пренебрежимо малым давлением паров, термической устойчивостью, высокой электропроводностью, уникальными растворяющими свойствами и, что особенно важно, возможностью управления их физико-химическими свойствами (вязкостью, плотностью, полярностью, гидрофильностью/ гидрофобностью и др.) комбинированием природы катиона и аниона ИЖ [1, 2]. В отличие от МОР, которые в жидком виде существуют в молекулярной форме, ИЖ могут присутствовать в растворе в виде упорядоченных структур (доменов, цепочек, ионных пар, квазимолекулярных упаковок и ассоциатов), образованных за счет водородных связей, или диссоциированных ионов [3]. Гидрофильные и гидрофобные ИЖ используют в качестве реакционной среды для проведения биохимических процессов [1, 4, 5], как компоненты чувствительного слоя электрохимических биосенсоров [5, 6], как экстрагенты и соэкстрагенты для разделения и выделения белков [7].
Повышенный интерес исследователей к изучению кинетики реакций, катализируемых нативными растительными пероксидазами и белками с пероксидазной активностью (гемином, гемоглобином, микроперок-сидазой-11, цитохромом с), в присутствии гидрофильных ИЖ обусловлен, с одной стороны, низкой катали-
тической активностью указанных биокатализаторов в присутствии МОР, с другой стороны, потребностью в управлении эффективностью, стерео- и региоселек-тивностью биокатализа путем варьирования природы растворителя [5, 8]. Пока на основании имеющихся литературных данных не удается предсказать «дружелюбность» той или иной гидрофильной ИЖ по отношению к этим ферментам, поскольку катализ в гидрофильных ИЖ с участием растительных пероксидаз (ЕС 1.11.1.7) изучен в разных индикаторных реакциях при разных условиях (соотношение ИЖ и буферного раствора, значение рН и др.) [8-11].
Несмотря на повышенное внимание к вопросам пе-роксидазного катализа в водно-органических и органических средах [1, 8], место гидрофильных ИЖ в ряду полярных МОР все еще не определено. В связи с этим целесообразными и перспективными представляются систематические исследования влияния на каталитическую активность растительных пероксидаз коммерческих гидрофильных ИЖ и близких к ним по полярности МОР в одних и тех же индикаторных реакциях. Такие исследования позволят, на наш взгляд, глубже понять зависимость каталитической активности растительных пероксидаз от катионного и анионного состава гидрофильных ИЖ, их физико-химических свойств, а также оценить возможность и целесообразность замены полярных МОР на гидрофильные ИЖ в реакциях с участием растительных пероксидаз.
Для изучения характера и степени влияния гидрофильных ИЖ на каталитическую активность расти-
тельных пероксидаз в качестве индикаторной мы использовали реакцию окисления гваякола пероксидом водорода и трет-бутилгидропероксидом. Биокатализаторами служили катионная пероксидаза хрена (ПХ) и анионная пероксидаза сои (ПС), которые широко применяют в биотехнологии, биоремедиации и химическом анализе. Из большого ассортимента коммерческих гидрофильных ИЖ мы выбрали ацетат 1-бутил-3-метилимидазолия ([BMIm][AcO]), тетраф-торбораты 1-бутил-3-метилимидазолия и К-бутил-4-метилпиридиния ([BMIm][BF4] и [BMPy][BF4] соответственно). Согласно литературным данным [1, 2, 4, 5, 8-11], имидазолиевые ИЖ применяют в ферментативном катализе наиболее часто, второе место по распространенности занимают ИЖ на основе катиона пиридиния. Ацетатную ИЖ ранее не использовали в пероксидазных реакциях, хотя она зарекомендовала себя как прекрасный растворитель целлюлозы [12] и может быть использована в будущем для создания на основе целлюлозы новых сенсорных материалов с включенными в них пероксидазами. Выбранные для исследования ИЖ содержат в своем составе катионы и анионы, которые различаются по способности «структурировать» воду и могут по-разному влиять на активность и стабильность ферментов в водных растворах [13-15]. Для сравнения действия ИЖ и МОР на каталитическую активность растительных пероксидаз выбрали диметилсульфоксид (ДМСО), ацетонитрил и этанол. Эти органические растворители близки по полярности к выбранным ИЖ и широко используются в практике химического анализа.
Цель настоящей работы - изучение кинетики реакции окисления гваякола пероксидом водорода и трет-бутилгидропероксидом, катализируемой катионной ПХ и анионной ПС, в присутствии [BMIm][AcO], [BMIm][BF4] и [BMPy][BF4]; расчет кинетических параметров указанных пероксидазных реакций и сопоставление их с таковыми в водно-органических средах с участием полярных МОР; выявление свойств ИЖ, которые являются определяющими при оценке их действия на каталитическую активность растительных пероксидаз.
Экспериментальная часть
Реагенты и аппаратура
Исходные растворы пероксидаз (1-30 мкМ) готовили растворением навесок лиофилизованных препаратов ПХ и ПС со значениями RZ, равными 2,7 и 0,5 и значениями каталитической активности по пурпурогаллину 266 и 90 ед.хмг-1 соответственно («Sigma», США) в 0,1 М фосфатном буферном растворе, ФБР (рН 7,0). Значения изоэлектрической точки ПХ и ПС состав-
ляют 8,8 и 4,1 соответственно. Точные концентрации растворов ферментов устанавливали спектрофотоме-трическим методом (е403 = 10,2 и 9,4*104 М х*см 1 для ПХ и ПС соответственно [16, 17], l = 1 см). Твердые препараты и растворы ферментов хранили в холодильнике при -18 и +4°С соответственно. Для приготовления фосфатного, имидазольного, коллидинового буферных растворов [18] использовали точные навески твердых препаратов дигидро- и гидрофосфата калия («Merck», Германия), имидазола, 2,4,6-коллидина (далее коллидин) (оба препарата фирмы «Sigma», США). Использовали препараты [BMIm][AcO] («Sigma», США) и [BMIm][BF4], [BMPy][BF4] («Merck», Германия), а также ДМСО, ацетонитрил, этанол («ч.д.а.», «Реахим», Россия) без дополнительной очистки. В работе применяли 70%-й (7,3 М) водный раствор трет-бутилгидропероксида, i-BuOOH и 36%-й (10,6 М) водный раствор Н2О2 (оба препарата фирмы «Sigma», США). Точную концентрацию последнего устанавливали перманганатометрическим методом [19]. Рабочий 1 М раствор Н2О2 готовили ежедневно разбавлением исходного раствора водой. Рабочий 4 мМ раствор гваякола (ГК) готовили ежедневно растворением точной навески его жидкого препарата («Sigma», США) в аце-тонитриле. Для приготовления всех водных растворов использовали деионизованную воду, очищенную на установке «Millipore» (Франция), с удельной электропроводностью не более 18,2 МО*см-1.
В работе использовали мерные колбы с притертыми пробками и градуированные стеклянные пробирки, которые предварительно очищали концентрированной HNO3 («ос. ч.»), тщательно промывали деиони-зованной водой, стерилизовали в течение 15 мин при температуре 105°С в сушильном шкафу («UTENOS Electrotechnika», Латвия); пластиковые пробирки емкостью 2, 5, 15 и 50 мл, эппендорфы емкостью 2 мл и 96-луночные полистирольные планшеты для иммуно-ферментного анализа («Хеликон», Россия).
Оптическую плотность реакционных растворов измеряли в кварцевой микрокювете (объем 600 мкл) на спектрофотометре «Shimadzu UV mini-1240A» (Япония) с точностью ±0,0003 опт. ед. и ячейках планшета на микропланшетном фотометре «Multiskan EX» («Thermo Labsystems», Финляндия) с точностью ±0,007 опт. ед. (l = 1 см). Измеряли рН буферных растворов на рН-метре «Mettler Toledo» (Швейцария) с точностью ±0,01 ед. рН. Вязкость водно-органических растворов измеряли на капиллярном стеклянном виз-козиметре ВПЖ-1 (диаметр капилляра 0,73 мм, Россия), погруженном в визкозиметрический термостат «LOIP LT-910» (Россия, точность ±0,1°С). Показатели преломления водно-органических растворов измеряли
на рефрактометре «ИРФ-454 Б2М» (Россия) (точность измерений ±1^10 4, диапазон измерений 1,2-1,7).
Методики эксперимента
Методика 1. При проведении реакции окисления ГК пероксидом водорода, катализируемой ПХ или ПС, в среде [БМ1ш][ЛсО] - ФБР (или вода) в эппен-дорф емкостью 1,0 мл последовательно вводили необходимый объем ФБР (рН 6,0) или воды, 0-400 мкл ИЖ, 30-60 мкл 18-72 мМ раствора ГК, 4,5-11,0 мкл 1,2-0,3 мкМ раствора фермента. Раствор перемешивали, выдерживали в течение 15 мин для установления равновесия в системе и в последнюю очередь вводили 60 мкл 1,2-2,2 М Н2О2. При этом общий объем реакционной смеси составлял 600 мкл. В момент добавления Н2О2 реакционную смесь тщательно перемешивали, переливали в микрокювету и регистрировали кинетику окисления ГК при 470 нм [20]. Полосы поглощения ИЖ и продуктов пероксидазного окисления ГК не пересекались.
По полученным экспериментальным данным рассчитывали величину тангенса угла ^а) наклона восходящего линейного участка кинетической кривой, построенной в координатах оптическая плотность (А) - время (?, с), и скорость индикаторной реакции (К0):
V = ЛС / Л? = (ЛА / Л?) х(1/в/) = ^а/в/,
где £ - молярный коэффициент поглощения продуктов окисления ГК (2,66х104 М-1-см-1, 470 нм [20]); / - длина кюветы, см; АС - прирост концентрации окрашенного продукта, АА - приращение оптической плотности в единицу времени А?, tgа - наклон начального участка кинетической кривой, построенной в координатах оптическая плотность (А) - время (?, мин).
Относительные активности растительных перок-сидаз в среде ИЖ-буферный раствор по отношению к активности в водной среде (а./а0) рассчитывали по формуле:
а. /а0=tgаг / tgа0 где tgаг. и tgа0 - тангенсы угла наклона кинетических кривых, построенных в координатах оптическая плотность (А) - время (?, мин), в присутствии и в отсутствие ИЖ соответственно.
Методика 2. Для проведения реакции окисления ГК трет-бутилгидропероксидом, катализируемой ПХ или ПС, в присутствии [БМ1ш][БР4] или [БМРу] [ББ4] в ячейку планшета вводили последовательно 0-290 мкл ИЖ, 5-9 мкл 7,3 М раствора ?-БиООН, 0-290 мкл буферного раствора (разной природы [21]), 5 мкл 60-180 мМ раствора ГК. Полученный раствор
перемешивали тонкой стеклянной палочкой и вводили 5-15 мкл 0,1-5 мкМ раствора фермента. Суммарный объем реакционной смеси составлял 300 мкл. Кинетику реакции окисления ГК регистрировали при 470 нм. Далее поступали согласно методике 1. Контрольным опытом служило проведение реакции окисления ГК в ИЖ в отсутствие ферментов.
Методика 3. Для проведения катализируемой ПХ или ПС реакции окисления ГК трет-бутилгидропероксидом в присутствии МОР в градуированную стеклянную пробирку с притертой пробкой вводили последовательно необходимый объем ФБР (рН 6,0), 0,10-2,20 мл органического растворителя, 0,02-0,25 мл раствора фермента (0,45-6,2 мкМ), 0,010,2 мл раствора ГК (0,045-0,9 мМ). Раствор перемешивали и в последнюю очередь вводили 0,005-0,15 мл 7,3 М раствора ?-БиООН, при этом объем реакционного раствора составлял 5 мл. Далее поступали согласно методике 1.
Результаты и их обсуждение
Кинетика пероксидазного окисления ГК в присутствии [БМ1ш] [АсО]
В настоящем исследовании основное внимание сосредоточено на изучении кинетики пероксидазного окисления ГК в присутствии [БМ1ш][ЛсО], сведения о влиянии которой на каталитическую активность ПХ и ПС в литературе отсутствуют. Оптимальные условия катализируемого ПХ и ПС окисления ГК трет-бутилгидропероксидом в присутствии [БМ1ш][БР4] и [БМРу][ББ4] установлены и описаны нами ранее [21]. Полученные результаты были использованы для расчета кинетических параметров индикаторной реакции в этих средах и их сопоставления с таковыми для смесей ФБР с ацетатной ИЖ и МОР.
Эксперимент в присутствии [БМ1ш][ЛсО] проводили по методике 1 в условиях, оптимальных для реакции в водной среде [22]. Содержание ацетатной ИЖ в индикаторной системе варьировали от 0 до 75 об.%, при этом реакционный раствор оставался оптически прозрачным, что позволяло использовать в качестве сорастворителя ИЖ оптимальный для водной среды 0,05 М ФБР с рН 6,0. В качестве окислителя мы выбрали Н2О2, применение которого вместо трет-бутилгидропероксида обеспечивает высокую воспроизводимость результатов эксперимента в присутствии указанных выше величинах содержания ацетатной ИЖ не превышало 0,1; п = 3).
Введение в реакционный раствор даже 10 об.% [БМ1ш][ЛсО] (0,5 М) приводит к резкому уменьше-
Т а б л и ц а 1
Значения относительной активности ПХ и ПС (а/а0, %) в реакции окисления ГК пероксидом водорода в присутствии [БМ1ш][АсО] (сорастворитель ИЖ - 0,05 М ФБР, рН 6,0)
нию скорости реакции пероксидазного окисления ГК по сравнению с таковой в отсутствие ИЖ, при этом остаточная каталитическая активность ПХ была в 1,7 раза выше, чем соевого фермента (табл. 1). С повышением содержания [БМ1ш][ЛсО] в реакционном растворе остаточная каталитическая активность ПС убывала в меньшей степени, чем ПХ. Например, при увеличении содержания ацетатной ИЖ от 10 до 25 об.% величина аг/а0 для ПХ понижалась более, чем в 30 раз, а для ПС - всего в 1,5 раза. При замене ФБР на воду с таким же значением рН обнаружено, что в незабуференном реакционном растворе в присутствии изученных содержаний [БМ1ш][ЛсО] соевый фермент еще проявляет 10% активности от ее величины в водной среде, в то время как ПХ инакти-
вирована практически полностью уже при 25 об.% ИЖ (табл. 1).
Для оценки кинетических параметров индикаторной реакции в присутствии 10 об.% ацетатной ИЖ использовали координаты Лайнуивера-Берка (рис. 1), из которых графическим методом [23] рассчитаны величины 7макс и Кт соответственно (табл. 2) при трех разных значениях концентрации каждого фермента. Предварительно показано, что в стационарных условиях начальная скорость пероксидаз-ного окисления ГК подчиняется уравнению Миха-элиса-Ментен. Дополнительно в табл. 2 приведены рассчитанные значения константы скорости выделения продукта индикаторной реакции к2 (7макс/[Е0]) и каталитической константы ккат (рис. 2, уравнение 2), которая отражает реакционную способность перок-сидаз в присутствии ацетатной ИЖ. Сопоставление величин Кт для растительных пероксидаз показало, что в присутствии 10 об.% ацетатной ИЖ сродство ПХ к основному субстрату (Н2О2) в 3 раза выше, чем сродство ПС. Максимальная скорость реакции, а также ккат практически не зависят от природы фермента (табл. 2). Тот факт, что константы скорости выделения продукта индикаторной реакции к2 для ПХ и ПС близки по величине, косвенно свидетельствует об участии ацетатной ИЖ на второй необратимой стадии ферментативной реакции
к2
Е + Б ^ЕБ —Е + Р.
Для оценки величины константы ингибирования растительных пероксидаз ацетатной ИЖ в реакции
Т а б л и ц а 2
Кинетические параметры катализируемой ПХ и ПС реакции окисления ГК пероксидом водорода в присутствии 10 об.% [БМ1ш][АсО]
Концентрация фермента, нМ Константа Михаэли-са-Ментен Кт, мкМ Максимальная скорость мкМ мин Константа скорости стадии выделения продукта к2*10-3, мин-1 kкат, С-1
ПХ
5,0 1,17±0,03 1,79±0,03 0,36±0,03 1,13
9,0 1,13±0,01 2,26±0,02 0,25±0,02 0,98
14,0 1,19±0,05 2,89±0,06 0,19±0,06 0,97
ПС
5,5 4,10±0,01 1,65±0,02 0,30±0,02 0,38
10,5 3,96±0,09 3,44±0,06 0,33±0,06 0,78
15,25 4,22±0,03 5,63±0,04 0,37±0,04 1,43
Среда Состав среды (об.%) /а0, %
ПХ ПС
[БМ1ш][ЛсО]: ФБР 10:90 23,90 14,24
25:75 0,79 9,65
50:50 0,19 8,29
75:25 0,18 5,95
[БМ1ш][ЛсО]:Н2О 10:90 4,02 38,13
25:75 0,45 12,36
50:50 0,22 10,32
75:25 0,19 9,42
П р и м е ч а н и е. Концентрация ГК составляет 0,9 и 5,4 мМ в реакциях, катализируемых ПХ и ПС соответственно; концентрация Н2О2 составляет 100-200 и 200-300 мМ в реакциях, катализируемых ПХ и ПС соответственно; сорастворитель ИЖ - 0,05 М ФБР, рН 6,0; п = 3, Р = 0,95.
Рис. 1. Зависимости начальных скоростей окисления ГК пероксидом водорода, катализируемого ПХ (а) и ПС (б), в координатах Лайнуивера-Берка в присутствии 10 об.% [БМ1ш][АсО] при концентрации: ПХ - 5 (1), 9 (2), 14 нМ (3), ГК - 0,9 мМ, Н2О2 - 100-200 мМ; ПС - 5,5 (1), 10,5 (2), 15,25 нМ (3), ГК - 3,6 мМ, Н2О2 - 200-300 мМ (сорас-
творитель ИЖ - 0,05 М ФБР, рН 6,0)
окисления ГК пероксидом водорода использовали кинетическую схему (рис. 2), приведенную в работе [10] для расчета константы ингибирования ПХ другой гидрофильной ИЖ, [БМ1ш][БР4]. Предложенная схема является адаптированной схемой неконкурентного ингибирования ПХ в присутствии [БМ1ш][БР4], ионы которой, как и ионы ацетатной ИЖ не являются структурными аналогами субстратов. Константы ингиби-рования (К.) ПХ и ПС в присутствии 10 об.% [БМ1ш] [ЛсО] рассчитывали по приведенным ниже формулам:
Величины К ПХ в системах [БМ1ш][ЛсО] : ФБР и [БМ1ш][ЛсО] : Н2О (10 : 90 об.%) составили соответственно (159 ± 6) и (21,2 ± 0,8) мМ; а ПС - (80 ± 3) и (295 ± 10) мМ (п = 3, Р = 0,95). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при использовании ФБР в качестве сорастворителя ИЖ чувствительность соевого фермента к действию ИЖ выше, чем ПХ, поскольку величина константы ингибирования ПС в 7,5 раз меньше таковой для ПХ. Напротив, если сорастворителем
Рис. 2. Кинетическая схема неконкурентного ингибиро-вания растительных пероксидаз в реакции окисления ГК пероксидом водорода в присутствии [БМ1ш][АсО] (ИЖ обозначена как ингибитор, I)
ИЖ является вода, то более «уязвимым» к действию ацетатной ИЖ становится ПХ. Представленные данные указывают на целесообразность учета природы сорастворителя ИЖ при проведении индикаторных реакций в присутствии ацетатной ИЖ и позволяют отдать предпочтение ПХ в системе [БМ1ш][ЛсО]:ФБР (10:90 об.%).
Важно отметить, что при использовании ФБР в качестве сорастворителя ИЖ величина константы ингибирования ПХ в присутствии уже 10 об.% ацетатной ИЖ в 18 раз меньше таковой в присутствии 25 об.% [БМ1ш][БР4] (К1 = 2,9 М) [10]. Каталитическая константа скорости индикаторной реакции с участием ПХ в присутствии 10 об.% [БМ1ш][ЛсО] в 10 раз меньше константы в присутствии 10 об.% [БМ1ш] [БР4]. Эти факты свидетельствуют о том, что [БМ1ш] [ЛсО] является значительно более сильным ингибитором каталитической активности растительных перок-
Рис. 3. Зависимость относительной активности ПХ (1) и ПС (2) в реакциях окисления ГК трет-бутилгидропероксидом от содержания [БМ1ш][БР4] и [БМРу][ББ4] (0,05 М имида-зольный ([БМ1ш][БР4]) и 0,05 М коллидиновый ([БМРу] [ББ4]), буферные растворы, рН 7,0; ПС - 8 нМ, ПХ - 10 нМ; ГК - 0,9 мМ; Г-БиООН - 122 мМ; 470 нм). ПХ при содержании [БМРу][ББ4] >70 об.% неактивна
сидаз в рассматриваемой индикаторной реакции, чем [БМ1ш][БР4].
Сравнительный анализ кинетики реакций пероксидазного окисления гваякола в присутствии гидрофильных ИЖ и МОР
На рис. 3 представлена зависимость относительной каталитической активности ПХ и ПС в реакции окисления ГК трет-бутилгидропероксидом от объемного содержания [БМ1ш][БР4] и [БМРу][БР4]. Как видно из
диаграммы, с повышением содержания [БМ1ш][БР4] относительная активность обеих пероксидаз уменьшается, причем в случае ПС в значительно меньшей степени. Соевый биокатализатор оказывается более устойчивым к ингибирующему действию пиридиниевой ИЖ при ее содержаниях 60 об.% и выше, катализ с участием ПХ в таких системах не наблюдается. Значения остаточной активности ПС в оптимальных условиях реакций окисления ГК [21] при содержании [БМ1ш][БР4] и [БМРу][БР4], равном 80 и 60 об.% соответственно составляют не менее 20% от их исходных величин в воде.
Отличительная особенность пероксидазного катализа в присутствии [БМ1ш][БР4] и [БМРу][БР4] в реакции окисления ГК трет-бутилгидропероксидом заключается в возможности проведения процесса, катализируемого ПС, при значительно большем (60 об.% и выше) содержании ионного органического растворителя в системе, чем это допустимо в случае ацетатной ИЖ (рис. 3, табл. 3).
Для получения целостной картины характера и степени действия ИЖ и МОР на каталитическую активность ПХ и ПС в одной и той же индикаторной реакции мы изучили зависимости относительной активности обеих пероксидаз от содержания в системах ДМСО, ацетонитрила и этанола. Полученные зависимости представлены на рис. 4 в виде диаграмм. Концентрации компонентов индикаторной реакции соответствуют оптимальным для водной среды [22]. Из рис. 4 видно, что скорость окисления ГК при содержании органического растворителя 5 об.% практически не отличается от таковой в водном растворе в присут-
Т а б л и ц а 3
Эффективные константы скорости реакции пероксидазного окисления ГК в водной и смешанных средах, рассчитанные в рамках упрощенной (кэф) и полной (А+5) схемы механизма «пинг-понг»
Среда (об. %) кф.х10-4, М-1хс-1 эф '
ПХ ПС
ФБР 160 (окислитель Н2О2") 64 (окислитель Н2О2")
8 ± 1 (окислитель Г-БООН) 0,9 ± 0,2 (окислитель Г-БООН)
Ацетонитрил - ФБР (25:75) 0,11 ± 0,02 0,22 ± 0,03
ДМСО - ФБР (20:80) 0,13 ± 0,04 0,28 ± 0,02
[БМ1ш][ЛсО] - ФБР (10:90)® 0,47 ± 0,01 0,065 ± 0,002
[БМ1ш][БЕ4] - Имидазол:НС1 (80:20) е 0,26 ± 0,02 (0,17 ± 0,04г)
[БМРу][ББ4] - Коллидин:НС1 (60:40) - 0,22 ± 0,04 (0,20 ± 0,03г)
"Литературные данные [25]; окислителем в индикаторной реакции служит Н2О2, в остальных водно-органических средах - Г-БООН; "расчет невозможен вследствие очень низкой каталитической активности фермента при указанном содержании ИЖ; гк+5х 10-4, М-1хс-1, расчет проведен в соответствии со схемой, приведенной в работе [24].
Рис. 4. Зависимость относительной активности ПХ (1) и ПС (2) в реакции окисления ГК трет-бутилгидропероксидом от содержания ДМСО, ацетонитрила и этанола (концентрации: ПХ - 9 нМ; ГК - 0,9 мМ; /-БиООН - 120 мМ; ПС
- 2,7 нМ, ГК - 3,6 мМ, /-БиООН - 220 мМ; 0,05 М ФБР, рН 6,0; 470 нм)
ствии обоих ферментов. При увеличении содержания МОР относительная активность пероксидаз уменьшается в большей степени в присутствии ДМСО и ацетонитрила, чем этанола. При содержании ДМСО 30 об.% ПС еще проявляет остаточную каталитическую активность на уровне 40% от ее величины в водной среде, в то время как ПХ ингибирована почти на 90%.
Для сопоставления эффективности пероксидазного катализа в присутствии гидрофильных ИЖ и МОР мы рассчитали величины эффективной константы скорости в каждой из сред при выбранных значениях содержания растворителей ионной и молекулярной природы (табл. 3). Расчет проводили по упрощенной схеме, а для реакций в среде [БМ1ш][БР4] и [БМРу][БР4] дополнительно по полной схеме механизма «пинг-понг» [24, 25]. Сопоставление рассчитанных кинетических параметров реакции окисления ГК в водной среде и смешанных средах разного состава показало, что эффективность катализа в присутствии 80 об.% [БМ1ш] [БР4] и 60 об.% [БМРу][БР4] сопоставима с таковой
в присутствии 20-25 об.% апротонных органических растворителей. В то же время введение в реакционную смесь полярных органических растворителей (ДМСО, ацетонитрила) и ИЖ приводило к изменению специфичности ПХ и ПС по отношению к ГК. Так, если в водной среде использование ПХ для превращения ГК предпочтительнее ПС, что согласуется с литературными данными [25, 26], то в системах с [БМ1ш][БР4] и [БМРу][БР4] полезнее применять соевый фермент. Для проведения индикаторной реакции в присутствии ацетатной ИЖ целесообразнее использовать ПХ, которая обеспечивает в 7 раз более эффективный катализ, чем ПС.
Зависимости каталитической активности растительных пероксидаз от природы гидрофильных ИЖ и МОР
В литературе [2, 13-15] характер и степень влияния ИЖ на каталитическую активность и стабильность ферментов объясняют их физико-химическими свойствами, такими как вязкость, полярность, гидро-фобность и др., а также специфическими эффектами ионов, которые подчиняются теории космотропии. Перечисленные физико-химические свойства характерны и для ИЖ, и для МОР, в то время как теория космотропии применима только к состоящим из ионов ИЖ.
Космотропность - мера структурирующего действия ионов на воду [13]. Количественно степень «космотропности» иона характеризуют разными термодинамическими параметрами, чаще всего величинами 5-коэффициентов вязкости, значения которых для ионов-космотропов выше, чем для ионов-хаотро-пов [14, 15]. Промежуточное положение занимают пограничные ионы [13]. В соответствии с теорией космотропии в водных растворах анионы-космотро-пы и катионы-хаотропы стабилизируют ферменты; напротив, анионы-хаотропы и катионы-космотропы их дестабилизируют. На рис. 5 приведены ряды анионов и катионов,
Рис. 5. Значения ^-коэффициентов вязкости для катионов и анионов исследуемых сред (дм3 моль 1). ^ля расчета ^-коэффициентов катионов и анионов использованы уравнения: 5(катион) = 0,307г - 0,00205 г2
= 0,747 - 0,00617(г/^|) -1,172*10-5 (гф|)2 , где г и г - радиус и заряд ионов соответственно [13]. К - ион-космотроп, Х -
ион-хаотроп, К/Х - пограничный ион
присутствующих в изученных нами средах, в соответствии с величинами их 5-коэффициентов вязкости. По положению ацетат-иона в ряду анионов можно было бы ожидать, что ацетатная ИЖ будет значительно более слабым ингибитором пероксидаз, чем тетрафторборат-ион. Однако экспериментальные данные показали обратное. Относительная каталитическая активность ПС сохраняется на уровне 20% при содержании ацетатной ИЖ в 6 раз меньшем, чем [БМ1ш][БР4]. ПХ в присутствии >70 об.% [БМ1ш] [БР4] и [БМРу][БР4] неактивна, хотя ее остаточная активность в [БМ1ш][АсО] близка к таковой для ПС. С позиций теории космотропии не удается объяснить и тот факт, что [БМРу][БР4] является более сильным ингибитором, чем [БМ1ш][БР4] (рис. 5). По результатам нашего эксперимента можно сказать, что анионный эффект ИЖ оказывается более существенным, чем катионный, поскольку при замене катиона ИЖ близкие величины остаточной каталитической активности ПС наблюдаются при 80 об.% [БМ1ш][БР4] и 60 об.% [БМРу][БР4], а при замене аниона - при 60 об.% [БМ1ш][БР4] и 10 об.% [БМ1ш][АсО]. Дополнительным подтверждением высказанного тезиса может служить повышение остаточной каталитической активности ПС в присутствии 10-25 об.% [БМ1ш][АсО] при замене ФБР на воду с тем же значением рН. Относительная активность соевого фермента возрастает, поскольку в системе отсутствует хаотропичный анион Н2РО4 , молярная доля которого при рН 6,0 составляет 0,918. Согласно литературным данным [2, 15], на каталитическую активность и стабильность ферментов также влияет нуклеофильность аниона ИЖ, которая сильно выражена у ацетат-иона, что может объяснять необычное поведение [БМ1ш][АсО]. Отмечено инак-тивирующее действие примесей галогенидов в препаратах ИЖ на активность некоторых ферментов [2].
Мы проверили, коррелируют ли величины остаточной каталитической активности пероксидаз с величи-
25
нами показателя преломления среды п в и динамической вязкости (л) изученных реакционных растворов (табл. 4). Как видно из представленных данных, не-
25
смотря на существенные различия в величинах п в и Л, корреляции с остаточными активностями ферментов не наблюдаются.
Полярность изученных в работе ИЖ и МОР характеризовали величиной Е т по нормированной шкале полярности Димрота-Райхардта, а гидрофобность -величиной логарифма коэффициента распределения ИЖ (МОР) в системе н-октанол-вода, На рис. 6 в виде диаграмм представлены зависимости объемного содержания МОР и ИЖ, вызывающего 50%-е ингиби-рование ПХ и ПС (ю, об.%), от величин Еыт и 1о^. Как видно из рис. 6, а, величины ю строго не коррелируют с величинами Еыт ни для ИЖ, ни для МОР. Отметим лишь тенденцию роста величины ю с увеличением полярности ИЖ для ПС.
С уменьшением показателя гидрофобности (1о^Р) повышается, хотя и незначительно, объемное содержание МОР, вызывающее 50%-е ингибирование каталитической активности пероксидаз, это чуть более заметно в случае ПС (рис. 6, б). Напротив, для ИЖ величина ю убывает с уменьшением величины 1о^Р в ряду [БМ1ш][БР4]-[БМРу][БР4]-[БМ1ш][АсО]. Так, ацетатная ИЖ ингибирует обе пероксидазы на 50% при содержании менее 10 об.%. Исключение составляет [БМРу][БР4] в случае ПХ. Все перечисленные несоответствия между величинами ю и для [БМ1ш][БР4], [БМРу][БР4] и [БМ1ш][АсО] могут быть связаны как с разной природой буферных растворов (имидазольного, коллидинового и фосфатного соответственно), сорастворителей ИЖ, содержанием воды в реакционном растворе (20, 40 и 90 об.%), так и природой биокатализаторов (ПХ является катионным ферментом, а ПС - анионным). Тем не менее очевидно, что с ростом гидрофильности имидазолиевых ИЖ их ингибирующее действие на обе пероксидазы усиливается.
Принимая во внимание все сказанное выше, по нашему мнению, в качестве основного критерия для оценки степени ингибирующего действия ИЖ (по крайней мере на основе одного и того же катиона)
Т а б л и ц а 4
Величины динамической вязкости, коэффициентов преломления и относительной активности ферментов в
изученных водно-органических средах (п = 3, Р = 0,95)
Среда (об. %) 25 пв Л, мПахс (25°С) а1 /а0, %
ПХ ПС
Этанол-ФБР (15:85) 1,3429±0,0005 2,348±0,006 49,87 24,34
Ацетонитрил-ФБР (25:75) 1,3387±0,0004 0,879±0,006 21,15 13,32
ДМСО-ФБР (20:80) 1,3955±0,0003 2,465±0,004 22,78 63,72
[БМ1ш][БР4]-Имидазол-НС1 (80:20) 1,4021±0,0004 6,997±0,007 3,6 24,23
на растительные пероксидазы следует рассматривать величину 1ogP. Этот вывод согласуется с мнением авторов обзора [2], которые указали на гидрофобность
Рис. 6. Содержания (ю, об.%) МОР и ИЖ, при которых наблюдали 50% ингибирование ПХ (1) и ПС (2) в реакции окисления ГК пероксидом водорода (в случае [БМ1ш][ЛсО]) и трет-бутилгидропероксидом (в остальных случаях). Растворители расположены в порядке возрастания величины Еты (а) [27-29] и уменьшения величины 1ogP (б) [15, 29]
как на одно из наиболее важных физико-химических свойств ИЖ, влияющих на активность и стабильность других ферментов. Отдельно стоит подчеркнуть, что большую роль в степени влияния гидрофильных ИЖ на активность растительных пероксидаз играет природа сорастворителя ИЖ и природа фермента.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения гидрофильных ИЖ, главным образом [БМ1ш][БР4], как альтернативы полярным МОР в катализируемых ПХ и ПС реакциях окисления ГК. Эффективность катализа соевым биокатализатором в имидазолиевой и пиридиниевой ИЖ сопоставима с таковой в присутствии ацетонитрила и ДМСО, при том, что содержание ИЖ в 2-4 раза больше, чем МОР. Ацетатная ИЖ при содержании 10 об.% является сильным неконкурентным ингибитором каталитической активности обеих пероксидаз в реакции окисления ГК пероксидом водорода, причем ингиби-рующее действие этой ИЖ в большей степени выражено в случае ПС. Важным итогом исследования является выявленная «дружелюбность» ИЖ, содержащих тетраборат-анион, по отношению к ПС в изученной индикаторной реакции. Это открывает возможности дальнейшего использования гидрофильных ИЖ (пока еще относительно дорогих растворителей) вместо полярных и более токсичных МОР в катализируемых пероксидазами реакциях превращения других малорастворимых субстратов (например, серосодержащих органических соединений, фенилфенолов), в сенсорных технологиях при создании биочувствительных материалов как основы оптических и электрохимических биосенсоров. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования ПС вместо ПХ для проведения пероксидазных реакций в водно-органических средах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Moniruzzaman M., Nakashima K., Kamiya N., Goto M. // Biochem. Engineering J. 2010. 48. N 3. P. 295.
2. NaushadMu, ALOthman Z.A., Khan A.B., Ali M. // I. J. Biol. Macromol. 2012. 51. N 4. P. 555.
3. Dupont J. // J. Braz. Chem. Soc. 2004. 15. N 3. P. 341.
4. Plechkova N.V., Rogers K., Seddon K.R. Ionic liquids: from knowledge to application. ACS symposium series, 2010. V. 1030.
5. Мугинова С.В., Галимова А.З., Поляков А.Е., Шеховцова Т.Н. // ЖАХ. 2010. 65. № 4. C. 341. [Engl. Trans. Muginova S.V, Galimova A.Z., Polyakov A.E., Shekhovtsova T.N. // J. Anal. Chem. 2010. 65. N 4. P. 331].
6. Wei D., Ivaska A. // Anal. Chim. Acta. 2008. 607. N 2. P. 126.
7. Chen X., Liu J., Wang J. // Anal. Methods. 2010. 2. N 9. P. 1222.
8. Pinto P.C.A.G., Saraiva M.L.M.F.S., Lima J.L.F.C. // Anal. Sci. 2008. 24. N 10. P. 1231.
9. HongE.S., Park J.H., Yoo I.K., Ryu K.G. // J. Microbiol. Bio-technol. 2009. 19. N 7. P. 713.
10. Hong E. S., Kwon O.Y. Ryu K. // Biotechnol. Lett. 2008. 30. N 3. P. 529.
11. Cao Q., Quan L., He C, et al. // Talanta. 2008. 77. N 1. P. 160.
12. Kosan B, Michels C., Meister F. // Cellulose. 2008. 15. N 1. P. 59.
13. Zhao H. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2006. 81. N 6. P. 877.
14. Zhao H, Olubajo O., Song Z., et al. // Bioorg. Chem. 2006. 34. N 1. P. 15.
15. Zhao H. // SciTopics. 2011. Retrieved July 11, 2013, from http://www. scitopics.com/Biocatalysis_in_ionic_liquids.html.
16. Shannon L.M., Kay E, Lew J.Y. // J. Biol. Chem. 1966. 249. N 9. P. 2166.
17. Amisha K.J.K., Behere D.V. // J. Inorg. Biochem. 2003. 94. N 3. P. 236.
18. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., 1991.
19. Кольтгофф И.М., Сендел Е.Б. Количественный анализ. М., 1948. С. 822.
20. Laszlo J.A., Compton D.L. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2002. 18. N 1-3. P. 109.
21. Muginova S.V., Galimova A.Z., Poliakov A.E., Shekhovtso-va T.N. // Mend. Commun. 2011. 21. N 2. P. 97.
22. Поляков А.Е. Пероксидазы хрена и сои для определения фенольных и эндопероксидных соединений в водных,
водно-органических средах и гидрофильных ионных жидкостях. Дис... канд. хим. наук. М., 2011.
23. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М., 1990. С. 194.
24. Garcia-Moreno M., Moreno-Conesa M., Rodriguez-Lopez J.N., et al. // Biol. Chem. 1999. 380. N 6. P. 689.
25. Алпеева И.С. Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе. Дис. канд. хим. наук. М., 2007.
26. Geng Z., Rao K.J., Bassi A.S., et al. // Catalysis Today. 2001. 64. P. 233.
27. Tables for chemistry. Solvent polarity acc. Dimroth and Reichardt. http: // www.stenutz.eu/chem/solv20.php.
28. Боголицын К.Г., Скребец Т.Э., Махова Т.А. // Журн. общей химии. 2009. 79. № 1. С. 128.
29. http://ILThermo.boulder.nist.gov/ILThermo/.
Поступила в редакцию 11.11.13
THE INFLUENCE OF HYDROPHILIC IONIC LIQUID NATURE ON CATALYTIC ACTIVITY OF HORSERADISH AND SOYBEAN PEROXIDASES
D.A. Myasnikova, A.E. Poliakov, O.E. Vashkinskaya, S.V. Muginova, T.N. Shekhovtsova
(Division of Analytical Chemistry; e-mail: dihimik@gmail.com)
The kinetics of quaiacol oxidation with hydrogen peroxide and tert-butylhydroperoxide catalyzed by horseradish and soybean peroxidases in the presence of 1-butyl-3-methylimidazolium acetate, tetrafluoroborates of 1-butyl-3-methylimidazolium and N-butyl-4-methylpyridinium has been studied and compared. The noncompetitive inhibition of acetate ionic liquid on both peroxidases was found; the Michaelis and inhibition constants for reactions were calculated. The reasons for different degree of inhibition of catalytic activities of plant peroxidases by ionic liquids are discussed. The advantages of ionic liquids in comparison with polar molecular organic solvents are shown.
Keywords: hydrophilic ionic liquids, horseradish and soybean peroxidases, catalytic activity, kinetics.
Сведения об авторах: Мясникова Дина Андреевна - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ (dihimik@gmail.com); Поляков Алексей Евгеньевич - мл. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (a.e.polyakov@gmail.com); Вашкинская Ольга Евгеньевна - дипломник кафедры аналитической химии химического факультета МГУ (olga.vashkinskaya@ gmail.com); Мугинова Светлана Валентиновна - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, лаборатория кинетических методов анализа, канд. хим. наук (sveta_muginova@mail.ru); Шеховцова Татьяна Николаевна - профессор кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, лаборатория кинетических методов анализа, докт. хим. наук (tnshekh@yandex.ru).
