CC BY
131
УДК 577.152.1
АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА - ОКСИДАЗНЫЙ СУБСТРАТ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА В.В. Рогожин, Д.В. Перетолчин, Т.В. Рогожина
Якутская государственная сельскохозяйственная академия, 677018, Якутск, ул. Красильникова, 15, vrogozhin@mail.ru.
Изучена стационарная кинетика реакции оксидазного окисления аскорбиновой кислоты, катализируемая пероксидазой хрена. Показано, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым окси-дазным субстратом пероксидазы с низкими константами связывания субстратов инициирующих концентраций. В интервале рН 3,5-8,0 определены величины kcat и Km. В высоких концентрациях (80240 мкМ) аскорбиновая кислота активирует фермент при всех изученных рН. Предложен механизм действия пероксидазы в реакциях оксидазного окисления аскорбиновой кислоты. Ил. 4. Библиогр. 25 назв.
Ключевые слова: ферменты; стационарная кинетика; пероксидаза хрена; аскорбиновая кислота; ан-тиоксидант; ферментативный катализ.
ASCORBIC ACID IS THE OXIDASE SUBSTRATE OF HORSERADISH PEROXIDASE V.V. Rogozhin, D.V Peretolchin, T.V. Rogozhina
Yakutsk State Agricultural Academy,
15, Krasilnikova, Yakutsk, 677007 Russia, vrogozhin@mail.ru.
The steady-state kinetics of ascorbic acid oxidation catalyzed by horseradish peroxidase was studied. Ascorbic acid is the slowly oxidized substrate of peroxidase. The kcat and Km values of this substrate were determined at pH from 3,5 to 8. At high concentrations (80-240 ¿uM), ascorbic acid activates the enzyme at all pH values. Activation mechanism by ascorbic acid of peroxidase oxidation reactions was suggested. 4 figures. 25 sources.
Keywords: enzyme; steady-state kinetics; horseradish peroxidase; ascorbic acid; antioxidants; oxidation.
ВВЕДЕНИЕ
Аскорбиновая кислота (АК) является одним из низкомолекулярных антиоксидантов живых организмов. Специализированным ферментом, окисляющим аскорбиновую кислоту, служит ас-корбатоксидаза (КФ 1.10.3.3). Кроме того, аскорбиновая кислота может окисляться в реакциях пероксидазного окисления, катализируемых пе-роксидазой (КФ 1.11.1.7) [1]. Однако участие аскорбиновой кислоты в оксидазных реакциях, протекающих в присутствии пероксидазы (ПО), практически не изучено. Хотя известно, что пе-роксидаза способна катализировать реакции ок-сидазного и пероксидазного окисления субстратов неорганической и органической природы. Наличие у фермента двух различных функций (оксидазной и пероксидазной) позволяет предположить, что в каталитическом действии фермента могут принимать участие два независимых активных центра, пространственно разделенных, хотя и близко расположенных друг от друга на поверхности белковой глобулы [2]. Такая полифункциональность пероксидазы модулируется ионами металлов и состоянием микросреды вблизи молекулы фермента [3]. При этом идентификация пероксидазного и оксидазного участков фермента затруднена из-за недостаточности количественных данных о деталях структуры пероксидазы и ее молекулярной неоднородности [4].
Приоритет в открытии оксидазной функции пероксидазы принадлежит Теореллю [5], который обнаружил в растениях фермент, окисляющий дигидроксифумаровую кислоту (ДФК) с поглощением кислорода и доказал, что этот фермент - пероксидаза. Оксидазными субстратами пероксидазы могут быть гидро-, нафтохиноны, индолилуксусная кислота, НАДН2, НАДФН2, фло-роглюцин, диоксифумаровая кислота, глутатион и др. [6-9].
Особенностью механизма действия перок-сидазы в оксидазных реакциях является способность фермента в процессе каталитической реакции генерировать свободные радикалы: О2-, НО2' и радикал органического субстрата. Типичным субстратом в оксидазных реакциях перокси-дазы является диоксифумаровая кислота [8,10]. Оксидазное окисление ДФК исследовал Чанс, используя метод остановленной струи при рН 4 [11]. Было показано, что для проведения реакции при 4 оС требовалось присутствие ионов марган-
ца, однако повышение температуры способствовало протеканию реакции и в отсутствие ионов марганца. Для пероксидазы, активированной ионами марганца, Чанс определил константу взаимодействия фермента с кислородом (106 М"1сек"1) и показал, что образующийся комплекс ПО-О2 реагирует с ДФК с константой, равной 4-105 М-1сек-1.
В работе [8] показано, что автокаталитический характер оксидазного окисления ДФК обусловлен образованием в ходе реакции Н2О2 и других соединений типа гидроперекисей. Активной промежуточной формой пероксидазы, которая накапливается в достаточно большой концентрации, является соединение III. Предложена следующая схема реакций:
Е + О2 + ДН2 ^ Е-О2-+ ДН-+ Н+ Е-О2- + ДН2 + Н+ ^ Е + ДН-+ Н2О2 ДН- + О2 ^ НДОО-Е-О2- + ДН- + Н+ ^ Е + Д + Н2О2
Кислород может участвовать не только в ферментативной реакции, но и в реакции с радикалами субстрата, которая приводит к образованию гидроперекисного радикала. Он, в свою очередь, превращается в молекулу гидроперекиси при отрыве водорода от молекулы субстрата. Образующаяся в реакции перекись водорода и гидроперекиси являются субстратами перокси-дазы. Реакция их с ферментом приводит к образованию соединения I, которое далее взаимодействует с субстратом ДФК, инициирует образование дополнительных количеств радикалов ДН- в системе и способствует увеличению скорости окисления ДФК. При высоких концентрациях пероксидазы отмечается значительное возрастание скорости инициирования свободных радикалов. При этом увеличивается вероятность взаимодействия промежуточного соединения III со свободными радикалами. Эта реакция может быть причиной отклонения от линейной зависимости между скоростью реакции окисления ДФК и концентрацией пероксидазы, что отмечалось при высоких концентрациях фермента [8].
Механизм оксидазного окисления ИУК впервые предложили Рикард и Джоб [12], которые указали на специфичность реакции и предложили механизм превращения ИУК в индол-3-альдегид, происходящего непосредственно в
активном центре пероксидазы. Ими было установлено, что радикал ИУК может удерживаться молекулой белка и реагировать с кислородом с образованием соединения II (Е2)
E-IAA-+ O2 ^ E2 + Ind-CH2O + CO2
где Ind-CH2O - гипотетический интермедиат, ин-дол-3-эпоксид.
Подробное исследование этой реакции позволило установить, что пероксидазы растений являются высокоспецифичными оксигеназами ИУК и реакционный цикл начинается с образования тройного комплекса фермент-ИУК-кислород, приводящего к катион-радикалу ИУК [13]
Е3+ + IAA о [E-IAA] + O2 о [E-IAA-O2] [E-IAA-O2] о E + IAA"+ + O2---
где IAA"+ - катион-радикал ИУК, а О2- - супероксид анион-радикал.
В кислой среде катион-радикал ИУК декар-боксилируется и превращается в радикал скатола [13]. Радикалы скатола реагируют с молекулярным кислородом, образуя перокси-радикалы [14] и далее перекись скатола по реакции [15]:
IAA + ^ InCH2- + CO2 InCH2-+ O2 ^ InCH2O2-InCH2O2-+ IAA ^ InCH2OOH + IAA-
где IAA- - индолил-радикал; InCH2-, InCH2O2-, InCH2OOH - радикал, перокси-радикал, перекись скатола соответственно.
Исследуя реакцию оксидазного окисления ИУК, катализируемого пероксидазой хрена, было высказано предположение, что фермент способен одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК. Таким образом, в активном центре пероксидазы существует участок специфического связывания ИУК, отличающийся от области активного центра, где способна связываться и расщепляться перекись водорода или органическая гидроперекись [13,14]. При этом перокси-радикал превращается в активном центре фермента, не повреждая его, тогда как перокси-радикалы, образующиеся при окислении фенолов в аэробных условиях, инактивируют фермент [16].
Оксидазные реакции, катализируемые пероксидазой, могут ускоряться другими соединениями. Такой эффект был выявлен при изучении индивидуального и совместного оксидазного окисления ИУК [17,18]. При этом отмечено, что скорость оксидазного окисления ИУК пероксидазой резко возрастала в присутствии 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты. Однако механизм реакции авторами не исследовался.
Широкое распространение пероксидазы в
растительных и животных тканях позволяет говорить, что этот фермент выполняет многогранную работу в биогенных системах. Именно поэтому исследование структуры и механизма действия пероксидазы представляет не только теоретический интерес для понимания физиологической роли и принципов функционирования фермента, но и имеет важное практическое значение, поскольку пероксидаза широко используется в аналитических исследованиях [19].
В настоящей работе нами была изучена кинетика реакций оксидазного окисления аскорбиновой кислоты в широком интервале рН и предложен возможный механизм действия фермента в этой реакции.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали пероксидазу хрена производства «Reanal» (Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ = 1,0. Концентрацию фермента определяли спектрофотометри-
1 1
чески при 403 нм (е403 = 100 мМ- см- [20]) и пири-дингемохромогену [21]. В качестве субстрата применяли аскорбиновую кислоту от фирмы «Serva» (Германия), концентрацию которой определяли при 265 нм, пользуясь молярным коэффициентом поглощения, равным 7000 М-1см-1 [22]. Концентрацию растворенного кислорода определяли полярографическим методом [23].
Реакцию оксидазного окисления АК (9,0240,0 мкМ) кислородом (2,8 10-4 М) проводили при 25 ° в среде 0,1 М Na-ацетатного (рН 3,56,0) или Na-фосфатного (рН 6,0-8,0) буфера, объемом 2,5 мл с участием пероксидазы хрена в концентрации 8,0-24,0 нМ. Кинетические кривые окисления АК регистрировали на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы Varian (США) по уменьшению поглощения на 265 нм. За единицу активности фермента принимали количество мкмоль аскорбиновой кислоты, окисленной за 1 мин. Кажущиеся константы скорости окисления аскорбиновой кислоты определяли из данных по стационарной кинетике. Расчет каталитических констант производили, используя прикладные программы ферментативной кинетики.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Нами установлено, что в стационарных условиях начальная скорость оксидазного окисления аскорбиновой кислоты подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. На рис. 1 показана зависимость начальной скорости оксидазного окисления АК от ее концентрации в двойных обратных координатах при рН 3,5, 6,0 и 7,0. Аналогичные зависимости были получены и для других значений рН. При этом на кинетической кривой наблюдается излом, который сохраняется и при
t/v in* unu M"'
2 0 2 4 6 8 10 12
1/AK 10"4, M"1
Рис. 1. Зависимости начальных скоростей оксидазного окисления аскорбиновой кислоты в координатахЛайнуивера-Берка при рН 3,5 (1), 6,0 (2), 7,0 (3) в присутствии пероксидазы. Концентрации: пероксидаза - 16 нМ; аскорбиновая кислота - 9-240 мкМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер,
рН 7,0, 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 3,5 и 6,0
варьировании концентрации фермента (рис. 2). Сложный характер кинетических кривых свидетельствует о том, что в реакциях оксидазного окисления могут участвовать несколько молекул АК. При этом каталитический процесс инициируется при связывании в активном центре фермента одной молекулы АК с Km1 равной 24-333 мкМ, что соизмеримо с величиной констант связывания быстро окисляемых субстратов фермента, участвующих в пероксидазных реакциях. По-
следние протекают с участием перекиси водорода. Так, например, Km по о-дианизидину при рН 3,7-7,0 составляла 11-20 мкМ [24]. Схожие зависимости были выявлены при исследовании реакций пероксидазного окисления АК [1], что позволяет говорить о возможности существования единого механизма в реакциях пероксидазного и оксидазного окисления аскорбиновой кислоты. При этом в обоих случаях, по-видимому, местом связывания субстрата является одна и та же об-
Рис. 2. Зависимости начальных скоростей оксидазного окисления аскорбиновой кислоты в координатах Лайнуивера-Берка при различных концентрациях пероксидазы, нМ: 8,0 (1), 16,0 (2), 24,0 (3). Концентрации: аскорбиновая кислота -15-240 мкМ; 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,5
pH
Рис. 3. рН-зависимости величин lgk^ для реакций индивидуального оксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии пероксидазы при связывании в активном центре фермента одной (1) и двух (2)
молекул субстрата
ласть активного центра фермента и в реакции участвует железо гема.
Из графиков рН-зависимости 1дккат (рис. 3) видно, что на реакции оксидазного окисления АК оказывают влияние две ионогенные группы, расположенные в области активного центра фермента с рК ~ 5,7 и 6,5, ионизация которых может понизить каталитический процесс в 1,5-33,0 раза. При этом наибольшая активность фермента наблюдается в кислой области рН.
Аналогичные две функциональные группы активного центра фермента, участвующие в связывании одной и двух молекул АК, проявляются на рН-зависимостях величин 1дКт реакций окисления АК (рис. 4).
В работе [8] при изучении реакций окси-дазного окисления диоксифумаровой кислоты выявлено, что в катализе пероксидазы участвуют две ионогенные группы, протонизация которых влияет на активность фермента в области кислых значений рН (2,5-6,0). Причем при рН~3,0 в структуре активного центра фермента создавалась конформация, обеспечивающая максимальные условия для окисления как диок-сифумаровой кислоты, так и индолилуксусной кислоты [8,14-16].
Наличие активации в реакциях оксидазного окисления АК можно объяснить за счет связывания двух и более молекул АК в активном центре фермента. Однако при этом Кт2 возрастает в 3,6-15,6 раз, что указывает на их меньшее сродство к участку связывания. При этом дополнительное связывание молекул АК ускоряет протекание каталитических реакций в 1,8-2,9 раз.
Для объяснения активации оксидазного
окисления АК мы предложили следующую схему ферментативной реакции:
ki
E + O2 ^ E3
Ksi k2 кз
E3 + AH2 ^ E3AH2 ^ E2AH-^ E + P Т| AH2 Ks2 k4 AH2E2AH ^ EAH2 + P,
где E, E1, E2 - исходный фермент и его промежуточные соединения; AH2 - аскорбиновая кислота; Ks1 Ks2 - константы диссоциации, соответствующих комплексов фермента с субстратом; к1, к2, к3, к4 - каталитические константы.
Схема предполагает, что оксидазное окисление АК осуществляется, если в области активного центра фермента связываются одна или две молекулы субстрата. При связывании двух молекул АК наблюдается активирование перок-сидазы.
В заключении следует отметить, что в действии пероксидазы заложен сложный регулятор-ный механизм, имеющий биологическое значение. В частности, в семенах растений, находящихся в состоянии вынужденного покоя активность пероксидазы коррелирует с их жизнеспособностью [25]. Однако объяснить эту закономерность ранее было невозможно. В свете настоящих данных эта связь просматривается как регуляторный механизм, в действии которого заложено участие пероксидазы как в оксидазных, так и пероксидазных реакциях. Последовательность этих реакций может обеспечивать покоящиеся семена водой, вследствие протекания
Рис. 4. рН-зависимости величин IgKm для реакций индивидуального оксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии пероксидазы при связывании в активном центре фермента одной (1) и двух (2)
молекул субстрата
на начальных этапах реакций оксидазного окисления, в результате которых образуется перекись водорода, которая в дальнейшем восстанавливается до воды в реакциях пероксидазного окисления различных неорганических и органических соединений.
ВЫВОДЫ
1. В стационарных условиях начальная скорость оксидазного окисления аскорбиновой кислоты подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен во всем изученном диапазоне рН (3,5-8,0).
2. Установлено, что в реакциях оксидазного окисления могут участвовать несколько молекул АК. Каталитический процесс инициируется при связывании в активном центре фермента одной молекулы АК с Km1 равной 24-333 мкМ, что соизмеримо с величиной констант связывания быстро окисляемых субстратов фермента,
БИБЛИОГРАФ
1. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота - медленно окисляемый субстрат пероксидазы // Биохимия. 1997. Т. 62, № 12. С. 1678-1682.
2. Gibson D.M., Lin E.H. The inhibition of peroxidase and indole-3-acetic acid oxidase activity by British antile-wisite // Arch. Biochem. Biophys. 1978. Vol. 186, N 3. P. 317-324.
3. Pang A., Catesson A.-M., Francesch C., Rolando C., Goldberg R. On substrate specificity of peroxidases involved in the lignification process // J. Plant Physiol. 1989. Vol. 135, N 2. P. 325-331.
4. Андреева В.А. Фермент пероксидаза. Участие в защитном механизме растений. М.: Наука, 1988. 129 с.
5. Swedin B., Theorell H. Dioximalec acid oxidase action of peroxidise // Nature. 1940. Vol. 145, N 3663. P. 71 -72.
участвующих в пероксидазных реакциях. При этом в обоих случаях местом связывания субстрата является одна и та же область активного центра фермента и в реакции участвует железо гема.
3. На реакции оксидазного окисления АК оказывают влияние две ионогенные группы, расположенные в области активного центра фермента с рК ~ 5,7 и 6,5, ионизация которых может понизить каталитический процесс в 1,5-33,0 раза. При этом наибольшая активность фермента наблюдается в кислой области рН.
4. Выявлено, что оксидазное окисление АК осуществляется, если в области активного центра фермента связываются одна или две молекулы субстрата. При связывании двух молекул АК наблюдается активирование пероксидазы.
ЖИЙ СПИСОК
6. Klapper M.H., Hackett D.P. The oxidatic activity of horseradish peroxidase. I. Oxidation of hydro and naph-thohydroquinones // J. Biol. Chem. 1963. Vol. 238, N 11. P. 3736-3742.
7. Klapper M.H., Hackett D.P. Investigations on the multiple components of commercial horseradish peroxidise // Biochem. et biophys. acta. 1965. Vol. 96, N 2. P. 271 -282.
8. Березин И.В., Угарова Н.Н., Дмитриева-Гетлинг М.П., Кершенгольц Б.М. Кинетика и механизм действия пероксидазы из хрена в реакции окисления ди-оксифумаровой кислоты кислородом воздуха // Биохимия. 1975. Т. 40, № 3. C. 475-483.
9. Srivastava O.P., Huystee R.B. IAA oxidase and polyphenol oxidase activities of peanut peroxidase iso-zymes // Phytochemistry. 1977. Vol. 16, N 10. P. 15271530.
10. Saunders B., Holmes-Siedle A., Stark B. Peroxidase: The properties and uses of a versatile enzyme and some related catalysts. London:Butterworths, 1964. 271 p.
11. Chance B. The kinetics and stoichiometry of the transition from the primary to the secondary peroxidase peroxide complexes // Arch. Biochem. Biophys. 1952. Vol. 41, N 2. P. 416-424.
12. Ricard J., Job D. Reaction Mechanism of Indole-3-Acetate Degradation by Peroxidases. A Stopped-Flow and Low-Temperature Spectroscopic Study // Eur. J. Biochem. 1974. Vol. 44. P. 359-371.
13. Gazaryan I.G., Lagrimini L.M., Ashby G.A., Thorneley R.F. Mechanism of indole-3-acetic acid oxidation by plant peroxidases: Anaerobic stopped-flow spectrophotometry studies on horseradish and tobacco peroxidases // Biochem. J. 1996. Vol. 313. P. 841-847.
14. Gazarian I.G., Lagrimini L.M., Mellon F.A., Naldrett M.J., Ashby G.A., et al. Identification of skatolyl hydroperoxide and its role in the peroxidase-catalysed oxidation of indol-3-yl acetic acid // Biochem. J. 1998. Vol. 333. P. 223-232.
15. Gazarian I.G., Lagrimini L.M. Anaerobic stopped-flow studies of indole-3-acetic acid oxidation by dioxygen catalysed by horseradish C and anionic tobacco peroxidase at neutral pH: catalase effect // Biophys. Chem. 1998. Vol. 72, N 1. P. 231-237.
16. Ma X., Rokita S.: Role of Oxygen during Horseradish Peroxidase Turnover and Inactivation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. Vol. 157. P. 160-165.
17. Coldacre P.L., Galston A.W., Weintraub R.L. The
effect of substituted phenols on the activity of the indolea-cetic acid oxidase of peas // Arch. Biochem. Biophys. 1953. Vol. 43, N 2. P. 358-343.
18. Гуськов А.В., Земская В.А., Агаларзаде Г.Б., Калиберная З.В., Черникова Л.М. Изменения аукси-ноксидазной активности в укореняющихся черенках фасоли под действием ИУК и 2,4-Д // Физиол. растений. 1985. Т. 32, № 6. С. 1137-1144.
19. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение. М.: МГУ, 1981. 92 с.
20. Ogawa S., Shira Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme environmental structure // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. Vol. 90, N 2. P. 674-678.
21. Falk J.E. Porphyrins and Metalloporphyrins. Am-sterdam.-N.Y.-London etc.: Elsevier, 1964. 236 p.
22. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. С. 99.
23. Ляликов Ю.С. Физико-химические методы анализа. М.: Химия, 1974. С. 410-457.
24. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пе-роксидазы из хрена // Биохимия. 1977. Т. 42, № 8. C. 1372-1379.
25. Рогожин В.В., Егорова П.С. Влияние экзогенных этанола и ацетальдегида на жизнеспособность семян пшеницы // Этанол и его метаболизм в высших организмах: сб. научн. трудов. Якутск: Из-во. ЯНЦ СО АН СССР. 1991. С. 90-99.
Поступило в редакцию 21 июня 2013 г.
