CC BY
223
УДК 615.322:577.16:577.152.1 Т.В. Рогожина,
В.В. Рогожин
РОЛЬ КОМПОНЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ В МЕХАНИЗМАХ ПРОРАСТАНИЯ ЗЕРЕН ПШЕНИЦЫ
Ключевые слова: зерна пшеницы, ан-тиоксиданты, перекисное окисление ли-пидов, аскорбиновая кислота.
Введение
В живых организмах постоянно протекают окислительно-восстановительные реакции с участием кислорода, при избытке которого в клетках образуются активные формы кислорода (АФК): О2-, Н2О2, НО-, НОС1 и др. [1]. Содержание АФК контролируется компонентами антиокси-дантной системы (АОС), в составе которой — низко- и высокомолекулярные ак-тиоксиданты (АО) [2]. Особое значение имеет АОС для организмов, находящихся в состоянии вынужденного покоя. Так, семена злаковых культурных растений в отсутствие воды и при низкой температуре находятся в состоянии гипобиоза, но сохраняют высокую жизнеспособность. В состоянии покоя в зерновках понижается содержание воды до 5-8%, ослабляется дыхательная активность митохондрий, но сохраняется высокая активность оксидо-редуктаз, в особенности пероксидазы (ПО) [3]. Фермент входит в состав анти-оксидантной системы и совместно с низкомолекулярными антиоксидантами, обеспечивает высокую резистентность клеток к действию АФК, регулируя уровень пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) в живых организмах [4]. Однако с возрастанием оводненности в зерновках активируются основные метаболические процессы и повышается дыхание до максимального уровня, характеризующие их рост и развитие [5]. Набухание и прорастание семян всегда сопровождается активированием оксидазных процессов. Период прорастания делится на три этапа: 1) активация метаболизма (этап физического набухания); 2) подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша); 3) собственно рост органов проростка [6].
В зерновках пшеницы существует физиологически нормальный уровень сво-
боднорадикальных процессов и перекис-ного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран и ряда биосинтетических процессов. Контроль за содержанием АФК в семенах осуществляют антиок-сиданты, среди которых важное значение имеет аскорбиновая кислота (АК), обладающая высокой антиокислительной активностью в клетках живых организмов [7]. В генерировании свободных радикалов может принимать участие и перокси-даза. Однако инициирующая роль фермента в процессах прорастания семян практически не изучена.
Аскорбиновая кислота является одним из низкомолекулярных антиоксидантов живых организмов. Специализированным ферментом окисляющим аскорбиновую кислоту служит аскорбатоксидаза (КФ 1.10.3.3). Однако участие аскорбиновой кислоты в оксидазных и пероксидазных реакциях, протекающих в присутствии пе-роксидазы, практически не изучены. Хотя известно, что пероксидаза способна катализировать реакции оксидазного и перок-сидазного окисления субстратов неорганической и органической природы. Наличие у фермента двух различных функций (оксидазной и пероксидазной) позволяет предположить, что в каталитическом действии фермента могут принимать участие два независимых активных центра, пространственно разделенных, хотя и близко расположенных друг от друга на поверхности белковой глобулы [8]. Такая полифункциональность пероксидазы модулируется ионами металлов и состоянием микросреды вблизи молекулы фермента [9]. При этом идентификация пероксидаз-ного и оксидазного участков фермента затруднена из-за недостаточности количественных данных о деталях структуры пе-роксидазы и ее молекулярной неоднородности [3].
Широкое распространение пероксида-зы в растительных и животных тканях позволяет говорить, что этот фермент выполняет многогранную работу в биоген-
ных системах. Исследование структуры и механизма действия пероксидазы представляет не только теоретический интерес для понимания физиологической роли и принципов функционирования фермента в растительных тканях, но и позволяет установить взаимосвязь в действии пероксида-зы и низкомолекулярных антиоксидантов, которые могут быть субстратами фермента. Кроме того, в литературе активно изучается роль антиоксидантов в функционировании антиоксидантной системы растительных клеток, с возможностью выявить регуляторные механизмы [10-12].
Поэтому целью наших исследований было изучить процессы перекисного окисления липидов и состояние компонентов АОС в период набухания и прорастания зерновок пшеницы, а также механизмы окисления аскорбиновой кислоты в присутствии пероксидазы в широком интервале рН и предложить возможный механизм действия фермента в этих реакциях.
Экспериментальная часть
Исследования проводили на зерновках пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта При-ленская 19, которые замачивали в дистиллированной воде в течение 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 23оС на свету в течение 7 сут., смачивая их дистиллированной водой (10 мл на чашку Петри). Количество семян в одной чашке — 100 шт., повтор-ность опыта — 4-кратная.
Для анализа продуктов тиобарбитуро-вой кислоты (ТБК) и антиоксидантов 1 г сырой массы проростков гомогенизировали в фарфоровой ступке с 3 мл 50%-ного этанола, гомогенат центрифугировали 10 мин. при 7000 g. Супернатант для исследования активности пероксидазы получали аналогично, используя 0,1 М №-фосфатный буфер, рН 7,0.
Содержание малонового диальдегида (МДА) исследовали по реакции с тиобар-битуровой кислотой при 532 нм (в=155 мМ-1см-1 [1]) с нашими модификациями [13]. К 0,5 мл супернатанта последовательно добавляли 0,5 мл 1%-ного раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М Н^ и 0,8 мл 0,06 М ТБК. Смесь нагревали на кипящей водяной бане 10 мин. Охлаждение проводили при температуре 15оС 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ трилона Б и 5-10 мл 96%-ного этанола. Контролем служила пробирка, в которую добавляли те же растворы, кроме ТБК. Содержание МДА
в проростках выражали в нмоль/г сухой массы.
Анализ антиоксидантов проводили по методике [14]. К 0,2 мл супернатанта последовательно добавляли 0,2 мл 0,5%-ного о-фенантролина в 96%-ном этаноле и 0,2 мл 0,2%-ного FeCl3 в 96%-ном этаноле. Затем объем доводили до 3 мл 96%-ным этанола и выдерживали 10 мин. в темноте. Определение антиоксидантов проводили по калибровочному графику, построенному для кверцетина. Количество антиоксидантов, содержащихся в проростках, рассчитывали в мг/100 г сухой массы [15].
Определение содержания аскорбиновой кислоты проводили по методике [16]. В опытную пробирку последовательно вносили 1 мл фильтрата, 2,8 мл 0,1 М цитратного буфера рН 3,69, 0,05 мл 0,03 М K3[Fe(CN)6], 0,05 мл 0,476 М NaF, 0,1 мл 0,074 М FeCI3. Смесь выдерживали в течение 5 мин, после чего спектрофо-тометрировали при 700 нм. В качестве контроля использовали растворы, которые исключали фоновое поглощение опытных растворов. Содержание аскорбиновой кислоты рассчитывали в мг на 1 г сухой массы.
Активность пероксидазы определяли при 22оС по начальной скорости окисления в их присутствии о-дианизидина перекисью водорода [17]. К 2,5 мл 0,1 М №-фосфатного буфера (рН 7,0), добавляли 0,2 мл раствора супернатанта и 0,1 мл 0,43 мМ раствора о-дианизидина в 96%-ном этаноле. Реакцию инициировали введением 0,1 мл 16 мМ перекиси водорода. Увеличение поглощения раствора регистрировали при 460 нм (в = 30 мМ-1см-1 [17]) для продукта окисления о-диа-низидина, после быстрого перемешивания реагентов. За единицу активности фермента принимали количество о-диани-зидина (мкмоль), окисленного за 1 мин. 1 г сухой массы.
Спектрофотометрические исследования проводили на двулучевом спектрофотометре DМS 100 S («Varian», США). В работе использовали этанол, очищенный перегонкой, о-дианизидин марки «ч.», очищенный возгонкой в вакууме, перекись водорода (30 % водный раствор) и анти-оксиданты марки «о.ч.». Статистическую обработку данных проводили по Лакину [18].
Результаты и их обсуждение
Нами изучены показатели уровня ПОЛ, содержание антиоксидантов и активность
пероксидазы в различных частях зерновок после их замачивания в течение 24 ч в дистиллированной воде (табл. 1). Видно, что активность пероксидазы в различных частях зерновок резко различается. Наибольшая активность фермента отмечается в зародыше, а затем в щитке, эндосперме и пе-рикарпе. Причем активность пероксидазы в зародыше была в 2,14, 5,5 и 6,16 раза выше, чем в щитке, эндосперме и пери-карпе соответственно. Содержание МДА в щитке и зародыше практически не отличалось, но было выше в 1,4-1,8 раза по сравнению с эндоспермом и перикарпом. Однако наибольшие отличия наблюдались в содержании антиоксидантов. При этом в зародыше содержание антиоксидантов было в 3,12 раза больше, чем в щитке и в 10,3 и 12,1 раза выше, чем, соответственно, в эндосперме и перикарпе.
Таким образом, в зародыше и щитке проявляется самая высокая активность компонентов АОС, контролирующих уровень ПОЛ в этих частях зерновок. Поэтому мы в дальнейшем изучили динамику активности пероксидазы, а также содержание антиоксидантов и МДА в зародыше и щитке в процессе набухания зерновок пшеницы (табл. 2). Из таблицы 2 следует, что между компонентами АОС зародыша в течение 24 ч набухания зерновок наблюдается взаимная зависимость, проявляемая в том, что в ответ на возрастание уровня ПОЛ отмечается рост содержания антиоксидантов (г = 0,86) и активность пероксидазы (г = 0,79).
При этом в щитке уровень ПОЛ и содержание антиоксидантов находились в обратной зависимости (г = -0,87), а активность пероксидазы коррелировала с ростом содержания МДА (г = 0,62). По-видимому, в клетках щитка в период набухания процессы перекисного окисления липидов уже активно регулируются анти-оксидантами, возрастание содержания которых является условием подавления протекания свободно-радикальных процессов в этой части зерновок (г = -0,49).
Возможно, в этом проявляется регуля-торный механизм, обеспечивающий нарушение избирательного транспорта функционально активных веществ через щиток. При этом из эндосперма в зародыш начинают активно поступать регуляторы роста, обеспечивающие прорастание зерновок пшеницы.
Процесс набухания зерновок завершается при достижении 45-55% влажности и после проклевывания зерновки приобретают хорошо развитую корневую систему и надземную часть (зеленые семядоли). Поэтому нами было исследованы динамика содержания МДА и антиоксидантов, а также активность пероксидазы в корнях и зеленых семядолях проростков пшеницы (табл. 3). Видно, что в процессе прорастания содержание антиоксидантов в корнях и зеленых семядолях снижается соответственно в 10,4 и 1,7 раз. При этом активность пероксидазы в корнях возрастает в 1,95 раза, а в надземной части — в 1,5 раза. Полученные данные свидетельствуют о том, что в корневой системе регулятором уровня ПОЛ преимущественно служит пероксидаза, а надземной части — низкомолекулярные антиоксиданты. Последних в надземной части проростков пшеницы больше, чем в корнях в 1,55,4 раза. Причем в корнях между антиок-сидантами, уровнем ПОЛ и активностью пероксидазы наблюдается обратная зависимость (г = -0,88 и г = -0,89), а между содержанием МДА и активностью пероксидазы прямая зависимость (г = 0,95). В надземной части проростков пшеницы содержание МДА находится в обратной зависимости от содержания антиоксидантов (г = -0,69) и активности пероксидазы (г = -0,91). При этом устанавливается корреляция между активностью пероксидазы и уровнем ПОЛ (г = 0,44). Эти данные свидетельствуют о том, что в зеленых семядолях процесс ПОЛ регулируется преимущественно за счет антиоксидантов, высокая концентрация которых может регулировать активность пероксидазы.
Таблица 1
Содержание АО, МДА и активность ПО в различных частях зерновок пшеницы после 24 часов замачивания в дистиллированной воде
Части зерновок ПО, мкмоль/г сухой массы МДА, нмоль/ г сухой массы АО, мкг/г сухой массы
Сухое зерно 3,60±0,25 2,8±0,1 18,3±0,8
Перикарп 25±2 25,5±1,6 276,2±13,4
Эндосперм 28±3 20,7±1,3 324,3±11,3
Щиток 63±5 36,5±1,8 1070±50,8
Зародыш 154±12 33,2±1,4 3340±223,5
Таблица 2
Содержание антиоксидантов (мг/г сухой массы), МДА (нмоль/г сухой массы) и активность пероксидазы (мкмоль/мин. г сухой массы) в зародыше и щитке зерновок пшеницы в процессе набухания
Время набухания зерновок, ч Зародыш Щиток
АО МДА ПО АО МДА ПО
2 1,23±0,06 10,03±0,56 82±5,4 2,56±0,16 5,23±0,32 27±1,3
4 1,35±0,08 11,12±0,64 100±6,2 3,84±0,25 7,42±0,56 42±2,1
6 1,46±0,09 12,64±0,74 110±7,5 3,01±0,19 6,54±0,48 57±2,7
8 1,56±0,06 15,95±0,86 126±8,3 2,94±0,1 5 9,42±0,78 68±3,6
10 2,41±0,12 18,47±0,93 130±9,6 2,62±0,13 9,85±0,86 82±4,3
12 1,46±0,08 21,02±0,96 133±9,8 2,45±0,12 16,43±1,12 75±3,8
14 2,23±0,11 21,04±0,95 106±7,1 2,27±0,11 27,76±1,25 89±4,6
16 3,34±0,18 22,28±0,92 126±9,6 2,08±0,09 27,43±1,22 86±4,4
18 3,37±0,21 22,67±1,08 135±11,8 1,81±0,08 29,48±1,34 100±6,2
20 3,48±0,24 27,63±1,12 140±12,5 1,84±0,08 31,44±1,42 73±5,3
22 3,43±0,19 29,74±1,32 122±7,9 1,65±0,06 32,73±1,56 84±4,5
24 3,34±0,22 33,25±1,42 154±12,2 1,07±0,05 36,52±1,87 63±3,3
Таблица 3
Содержание МДА (нмоль/г сухой массы), антиоксиданов (мкг/г сухой массы) и активность пероксидазы (мкмоль/мин. г сухой массы) в корнях и надземной части проростков пшеницы
Время про- Корни Надземная часть
растания, сут. МДА АО ПО МДА АО ПО
2 128±5,6 546±32 140±9 215±16 824±76 38±0,3
3 108±4,8 956±84 130±8 226±18 764±56 32±0,2
4 158±6,8 395±28 160±11 343±26 533±48 56±0,4
5 144±6,1 137±7 165±12 318±21 510±37 63±0,5
6 164±7,8 116±6 180±15 284±24 554±51 68±0,5
7 178±9,7 92±3 200±19 236±20 498±35 74±0,6
Таблица 4
Содержание аскорбиновой кислоты (мг/100 г сухой массы, (%) в зерновках и проростках пшеницы во время прорастания
Время прорастания, сут. Зерновки Проростки
непроросшие проклюнувшиеся корни надземная часть
Контроль (сухие) 15,2±0,5 (100) - - -
1 24,8±0,8 (163) - - -
2 26,4±0,9 (174) 22,4±0,8 (147) - -
3 26,8±0,9 (176) 19,2±0,6 (126) 3,8±0,2 (25) 7,2±0,3 (47)
4 23,6±0,6 (155) 8,0±0,3 (53) 3,6±0,2 (24) 4,0±0,2 (26)
Таким образом, установлено взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов при прорастании зерновок пшеницы. В процессе метаболиза-
ции антиоксидантов изменяется их концентрация, что проявляется в регулировании активности пероксидазы и осуществлении общего контроля над деятельностью
АОС. Взаимное влияние низко- и высокомолекулярных антиоксидантов обусловлено особенностью механизма действия пероксидазы, способностью фермента катализировать реакции окисления различных биогенных соединений, среди которых может быть аскорбиновая кислота.
К низкомолекулярным антиоксидантам биогенных систем относятся аскорбиновая кислота, гидрохинон, токоферолы, квер-цетин, дигидрокверцетин и др. Выраженным антиокислительным действием в живых организмах обладает аскорбиновая кислота [7]. Поэтому мы изучили содержание АК в процессе прорастания зерновок пшеницы (табл. 4). Высокое содержание АК отмечается в покоящихся зерновках, тогда как в проклюнувшихся и проросших зерновках содержание АК понижается, что, по-видимому, обусловлено расходованием антиоксиданта в окислительных реакциях, некоторые из них катализируют аскорбатоксидаза и пероксида-за. Последняя катализирует реакции окси-дазного и пероксидазного окисления различных органических соединений, среди которых может быть и АК. Инициатором оксидазных реакций пероксидазы является кислород, а пероксидазных — перекись водорода. Последовательное протекание этих реакций позволяет снижать избыточные концентрации кислорода в клетках, восстанавливая его до воды:
АН2 + О2 ^ А + Н2О2; АН2 + Н2О2 ^ А + 2Н2О.
Аскорбиновая кислота является одним из наиболее широко распространенных в живых организмах антиоксидантом. Окисление АК катализируют различные окси-дазы растительных клеток, в том числе и пероксидаза. Продуктом этих реакций служит дегидроаскорбиновая кислота.
Сродство АК к активному центру пе-роксидазы может характеризоваться величинами констант Михаэлиса-Ментен (Km) и каталитическими константами (kcat). В случае использования в исследованиях неочищенного фермента, характеристической величиной может быть величина максимальной скорости (Vm), рассчитанная на грамм сухой массы.
Участие АК в оксидазных и пероксидазных реакциях были изучены нами, используя очищенную форму фермента (RZ = 1,0). Показано, что окисление АК в оксидазных и пероксидазных реакциях протекает по схожим механизмам.
В стационарных условиях начальная скорость оксидазного окисления аскорби-
новой кислоты подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Зависимости начальных скоростей оксидазного и пероксидаз-ного окисления АК от ее концентрации в двойных обратных координатах были изучены при рН 3,5-8,0. При этом на зависимостях начальных скоростей от концентрации АК наблюдался излом, который сохраняется и при варьировании концентрации фермента (рис. 1, 2). Наличие таких зависимостей начальных скоростей может свидетельствовать о том, что в активном центре фермента могут связываться несколько молекул АК. При этом как оксидазное, так и пероксидазное окисление АК зависит от числа молекул субстрата, взаимодействующих с окисленными формами фермента (Е, и Е2) и при связывании двух молекул АК наблюдается активирование фермента, обусловленное высокими концентрациями субстрата.
Рис. 1. Зависимости начальных скоростей оксидазного окисления аскорбиновой кислоты в координатах Лайнуивера-Берка при рН 3,5 (1), 6,0 (2), 7,0 (3) в присутствии пероксидазы. Концентрации: пероксидаза — 16 нМ; аскорбиновой кислоты — 9-240 мкМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,0, 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 3,5 и 6,0
В обеих реакциях АК проявляет себя как медленно окисляемый субстрат пе-роксидазы (табл. 5, 6). Связывание одной молекулы АК с Е, достаточно прочное, поскольку величины Km1 составляли для оксидазной реакции 24-333 мкМ, а пе-роксидазной — 6,1-11,5 мкМ. Эти значения констант Михаэлиса соизмеримы с величинами констант связывания быстро-
окисляемого субстрата пероксидазы о-дианизидина, у которого Кт при рН 3,97,0 составляет 11-20 мкМ [17]. Дополнительное связывание двух молекул АК хуже в оксидазном процессе в 2,817,7 раза, а в пероксидазном — в 40-50 раз. Причем Кт связывания субстрата с окисленными формами фермента мало зависело от рН в пероксидазных реакциях (табл. 6). Высокие концентрации АК (264-352 мкМ) ингибировапи фермент.
1Л> ю"4, мин М"1
Е + Н2О2 Е, + АН2
-еган2-
ка
- Е-АН -?|АН2
1 - к'с
Е + А
Е2-2АН2-
Е + 2А
пАН2
П'
Е2-(П+2)АН2
50 -
40 -
А
30 - 4 /
/
20
//•/
10 - ]щ//*
»111
где Е, Е1
схема
Е2 — исходный фермент и его промежуточные соединения 1 и 2; АН2 — аскорбиновая кислота; Е1-АН2, Е2-АН-, Е2-2АН2, Е2-(П+2)АН2 — комплексы одной, двух и (п + 2) молекул аскорбиновой кислоты с промежуточными соединениями Е! и Е2, ки к2, к3, кса) и к'са) = в • кса) — каталитические константы.
Схема предполагает, что оксидазное и пероксидазное окисление АК осуществляется, если с окисленными формами фермента ^ и Е2) связывается одна или две молекулы АК. При связывании двух молекул субстрата наблюдается активирование фермента (в > 1).
Исследование каталитических свойств неочищенной пероксидазы зерновок и проростков пшеницы позволило установить, что величины Кт и кса) с возрастанием рН понижаются, характеризуя возрастание сродства активного центра фермента к субстрату, но понижение эффективности его превращения (табл. 7). По-видимому, в нейтральных рН АК лучше связывается с ферментом, но медленно превращается, тогда как в кислых рН связывание субстрата ухудшается, но ускоряется его превращение. Особенно это видно для пероксидазы надземной части проростков пшеницы.
Таблица 5
Величины каталитических констант реакций оксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии пероксидазы в присутствии пероксидазы хрена
-5
10
15 20 25 1/АК 10"4, М'1
Рис. 2. Зависимости начальных скоростей пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты от ее концентрации в координатах Лайнуивера-Берка. рН 5,0-1, 5,5-2, 6,0-3; пероксидаза — 0,1 мкМ; перекись водорода — 0,64 мМ; аскорбиновая кислота — 2,2-220,0 мкМ
Для объяснения активации пероксидазы в реакциях оксидазного и пероксидазного окисления АК была предложена следующая схема ферментативных реакций:
к
Е
к
к
2
3
к
рН Кт1, мкМ Кт2, мкМ к с-1 кса1, с к' с-1 к саН с в
3,5 333±18 1552±70 59,3±1,5 62,5±2,5 1,1
4,0 94±6 1667±86 28,5±0,9 36,0±2,23 1,3
4,5 200±10 714±35 8,0±0,3 16,7±1,22 2,1
5,0 60±3 417±20 3,6±0,2 10,4±1,1 3 2,9
5,5 26±2 360±15 2,0±0,1 8,6±0,5 4,3
6,0 24±2 147±6 1,8±0,1 3,2±0,16 1,8
6,5 36±3 270±12 2,4±0,2 4,9±0,26 2,0
7,0 20±1 250±11 1,8±0,2 5,2±0,28 2,9
7,5 71 ±3 182±9 2,2±0,2 4,3±0,22 1,9
8,0 100±8 222±10 2,6±0,2 4,6±0,23 1,8
Таблица 7
Величины Кт (мкМ), Ут (мкмоль/мин. г сухой массы) и ккат (с-1)
реакций пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, катализируемых пероксидазой зерен и 7-суточных проростков (надземная часть и корни) пшеницы
Таблица 6
Величины каталитических констант для пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии пероксидазы хрена
рН Кт1, мкМ Кт2, мкМ кса, , с-1 к' с-1 к са) , с в
4,0 - 420±34 - 24,7±2,1
4,5 - 380±28 - 20,2±2,0 -
5,0 9,7±0,4 340±31 2,1 ±0,12 17,6±1,5 8,4
5,5 10,8±0,5 170±12 1,9±0,11 6,8±0,3 3,5
6,0 6,1±0,3 190±10 1, 1 ±0,11 8,4±0,9 7,6
6,5 - 150±13 - 4,0±0,2 -
7,0 11,5±0,4 230±18 1,1 ±0,10 3,7±0,1 3,4
8,0 - 97±7 - 3,8±0,1 -
рН Сухое зерно Проростки пшеницы
надземная часть корни
Кт Vm Кт Vm Кт Vm
5,0 38±2 2,9±0,11 263±12 55±3,4 33±2 25±2,2
5,5 35±2 2,0±0,09 161 ±9 28±2,3 27±2 21 ± 1,7
6,0 30±2 1,7±0,35 33±2 8±0,4 11 ± 1 16±1,2
7,0 26±1 1,3±0,04 24±1 9±0,3 12±1 15±1,0
Таким образом, пероксидаза способна катализировать реакции оксидазного и пероксидазного окисления АК, которые протекают с участием, соответственно кислорода и перекиси водорода. Последовательность реакций позволяет восстанавливать кислород до воды. В этих реакциях аскорбиновая кислота проявляет себя как медленно окисляемый субстрат фермента. При этом низкие концентрации АК инициируют процесс окисления, а возрастание содержания АК активирует перок-сидазу, тогда как высокие концентрации субстрата способны ингибировать фермент.
Поэтому в действии пероксидазы заложен сложный регуляторный механизм, обеспечивающий контроль за высокими концентрациями как кислорода, так и перекиси водорода. В реализации этого механизма могут участвовать различные биогенные соединения, способные в результате реакций окисления донировать электроны и протоны на восстановление кислорода и перекиси водорода. В этом действии пероксидазы активную роль в зерновках пшеницы играет и АК, регулирующая активность фермента.
Заключение
Возрастание ПОЛ в процессе набухания и прорастания зерновок обусловлено повышением дыхательной активности митохондрий в связи с поступлением воды в зерновки. В ответ на это в клетках активизируется синтез компонентов антиокси-дантной системы, среди которых аскорбиновая кислота и пероксидаза. Между компонентами антиоксидантной системы устанавливается взаимосвязь и взаимозависимость, в основе которых контроль за уровнем перекисного окисления в клетках проростков пшеницы. При этом динамика ПОЛ регулируется синтезом низкомолекулярных антиоксидантов, среди которых важное значение имеет аскорбиновая кислота, окисляющаяся как в оксидазных, так и пероксидазных реакциях, катализируемых пероксидазой. Участие аскорбиновой кислоты в реакциях пероксидазы позволяет предположить, что АК может на начальных этапах прорастания зерновок пшеницы индуцировать процесс синтеза фермента как в клетках покоящихся, так и прорастающих зерновок. В покоящихся зерновках пероксидаза способна участвовать в генерации воды, катализируя реакции последовательного восстановления
кислорода и перекиси водорода до воды. Кроме того, высокая активность перокси-дазы в прорастающих зерновках свидетельствует о том, что фермент способен выполнять регуляторную функцию по контролю за накоплением активных форм кислорода, удаляя их избыток в активно делящихся клетках проростков пшеницы.
Библиографический список
1. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. — М.: Наука, 1972. — 252 с.
2. Зенков Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах. / Н.К. Зенков, Е.Б. Меньщикова // Успехи современной биологии. — 1993. — Т. 113. — № 3. — С. 286-296.
3. Андреева В.А. Фермент пероксида-за. Участие в защитном механизме растений. / В.А. Андреева. — М.: Наука, 1988. — 129 с.
4. Рогожин В.В. Изменение реакции ан-тиоксидантной системы проростков пшеницы после ультрафиолетового облучения семян / В.В. Рогожин, Т.Т. Курилюк, Н.П. Филиппова // Биофизика. — 2000. — Т. 45. — № 4. — С. 730-736.
5. Николаева М.Г. Справочник по проращиванию покоящихся семян / М.Г. Николаева, М.В. Разумова, В.Н. Гладкова. — Л.: Наука, 1985. — 347 с.
6. Обручева Н.В. Общность физиологических механизмов подготовки к прорастанию у семян с различным типом покоя / Н.В. Обручева, О.В. Антипова // Физиология растений. — 1999. — Т. 46. — № 3. — C. 426-431.
7. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте / Е.Б. Бурлакова, А.В. Алесенко, Е.М. Молочкина, Н.М. Пальмина, Н.Г. Храпова. — М.: Наука, 1975. — 241 с.
8. Gibson D.M. The inhibition of peroxidase and indole-3-acetic acid oxidase activity by British antilewisite / D.M. Gibson, E.H. Lin // Arch. Biochem. Biophys. — 1978. — V. 186. — № 3. — P. 317-324.
9. Pang A. On substrate specificity of peroxidases involved in the lignification process / A. Pang, A.-M. Catesson, C. Francesch, C. Rolando, R. Goldberg // J. Plant Physiol. — 1989. — V. 135. — № 2.
— P. 325-331.
10. Олениченко Н.А. Влияние экзогенных фенольных соединений на перекисное окисление липидов у растений пшеницы / Н.А. Олениченко, Е.С. Городкова, Н.В. Загоскина // Сельскохозяйственная биология. — 2008. — № 3. — С. 58-61.
11. Лубсандаржиева П.Б. Биологически активные вещества и антиоксидантная активность in vifro полиэкстракта Lomafogo-nium carinfhiacum (wulfen) A.BR / П.Б. Лубсандаржиева // Химия растительного сырья. — 2008. — № 1. — С. 101-105.
12. Сысоева М.А. Исследование золя водных извлечений чаги, XII. Осаждение дисперсной фазы водного извлечения чаги при изменении рН среды / М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, В.С. Гамаюро-ва, Н.К. Шаехова, Ф.Г. Халитов // Химия растительного сырья. — 2009. — № 1. — С. 131-135.
13. Рогожин В.В. Влияние ультрафиолетового облучения семян на процессы пе-рекисного окисления липидов в проростках пшеницы / В.В. Рогожин, Т.Т. Кури-люк // Биохимия. — 1996. — Т. 61. — № 8. — C. 1432-1439.
14. Методы биохимического исследования растений / под ред. А.И. Ермакова. — Л.: Агропромиздат, 1987. — 430 c.
15. Рогожин В.В. Практикум по биологической химии / В.В. Рогожин. — СПб.: ГИОРД, 2006. — 256 с.
16. Методы биохимического анализа растений / под ред. В.В. Полевого, Г.Б. Максимова. — Л.: ЛГУ, 1978. — С. 133-135.
17. Лебедева О.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии перок-сидазы из хрена / О.В. Лебедева, Н.Н. Угарова, И.В. Березин // Биохимия.
— 1977. — Т. 42. — № 8. — C. 1372-1379.
18. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Ла-кин. — М.: Высш. шк., 1990. — 352 с.
+ + +
