Роль перекисного окисления липидов в прорастании зерновок пшеницы Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 633.111:631.811.98

Т.В. Рогожина, В.В. Рогожин

РОЛЬ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ПРОРАСТАНИИ ЗЕРНОВОК ПШЕНИЦЫ

Ключевые слова: зерновки пшеницы, покой семян, прорастание, проростки пшеницы, антиоксиданты, перекисное окисление липидов.

Введение

Зерновки злаковых растений при отсутствии воды и низкой температуре находятся в состоянии вынужденного покоя. Однако с возрастанием оводненности в семенах активируются основные метаболические процессы и повышается дыхание до максимального уровня, характеризующие их рост и развитие [1]. Период прорастания зерновок делится на три этапа [2, 3]: 1) этап физического набухания (20-24 ч), когда происходит активация метаболизма и насыщение зерновок водой до 45-50%; 2) этап наклевывание семян, за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша и подготовка их к началу роста растяжением (20-24 ч); 3) этап собственного роста органов проростка (3-7 сут.), в результате которого происходит формирование корней и зеленых семядолей (надземная часть).

Известно, что для нормального прорастания в воздушно-сухих семенах должны присутствовать все компоненты белок синтезирующей системы: рибосомы, тРНК,

факторы инициации и элонгации, аминокислоты и аминоацил-тРНК-синтетазы, все ферменты метаболизма, белки теплового шока и их мРНК [4]. Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, сопровождаемое возрастанием процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые могут вызывать окислительное повреждение тканей.

RH /=—^ R• ^ ► RO2• у—ROOH

НО/ Н2О2 О2 АН А

В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода (АФК): О2-, Н2О2, НО-, НОС1 и др. [5]. Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран [6]. Активные формы кислорода модифицируют белки, нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие функционально активные вещества [7]. Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей.

В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран, и ряда биосинтетических процессов [8, 9]. Контроль за содержанием АФК в семенах осуществляют антиоксиданты (АО). Компонентами антиоксидантной системы живых организмов являются низко-и высокомолекулярные антиоксиданты. В состав низкомолекулярных антиоксидантов входят стероиды, убихиноны, некоторые аминокислоты, полиамины, мочевина, мочевая кислота, глутатион, аскорбат, билирубин, токоферолы и др. К группе высокомолекулярных антиоксидантов относятся ферменты (супероксиддисмутаза (СОД), пе-роксидаза (ПО), каталаза (КАТ) и др.), а также белки (альбумин, трансферрин, ферритин и т.д.). СОД, каталаза и перокси-даза формируют единый ферментативный комплекс живых организмов, действие которого показано на следующей схеме:

Fe2+ Fe3+ СОД КАТ

О

■>Н,О,

2Н+

Л

2Н2О

ПО

Н2О

В целом пероксидаза способна катализировать реакции оксидазного (1), перокси-дазного (2) и оксигеназного (3) окисления. Субстратами фермента могут быть неорганические и органические соединения, окисляющиеся кислородом и перекисью водорода.

Н2О2 ------

0 ^ И

■> Н202

РН2

■2

л

о

!~І

[з] Н2О

DOOH

Однако роль фермента в процессах прорастания семян практически не изучена. Набухание и прорастание семян всегда сопровождаются активированием оксидазных процессов. УФ-облучение семян может инициировать возрастание ПОЛ, регулируемое в живых организмах компонентами ан-тиоксидантной системы [10]. Однако взаимодействие их основных метаболитов, принимающих участие в формировании гипо-биотических состояний у живых организмов,

обитающих в экстремальных условиях, мало исследовано.

Цель нашей работы состояла в изучении изменений, происходящих в перекисном окислении липидов, содержании антиоксидантов и активности пероксидазы в зерновках и проростках пшеницы на различных этапах прорастания семян.

Объекты и методы исследования

Исследования проводили на зерновках пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта При-ленская 19, которые замачивали в дистиллированной воде в течение 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 23оС на свету в течение 7 сут., смачивая их дистиллированной водой (10 мл на чашку Петри). Количество семян в одной чашке — 100 шт., повторность опыта 4-кратная.

Для анализа продуктов тиобарбитуровой кислоты 1 г сырой массы семян или проростков семян гомогенизировали в фарфоровой ступке с 3 мл 50%-ного раствора этанола, гомогенат центрифугировали 10 мин. при 7000 д. Содержание малонового диальдегида исследовали по реакции с тиобарбитуро-вой кислотой при 532 нм, 8=155 мМ-1 см-1 [6] с нашими модификациями. К 0,5 мл супернатанта последовательно добавляли 0,5 мл 1%-ного раствора тритона Х-100; 0,2 мл 0,6 М НС1 и 0,8 мл 0,06 М ТБК. Смесь нагревали на кипящей водяной бане 10 мин. Охлаждение проводили при 15°С 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ трилона Б и 5-10 мл 96%-ного этанола. Контролем служила проба, в которую добавляли те же растворы, кроме ТБК. Содержание МДА в проростках выражали в нмоль/г сухой массы.

Анализ антиоксидантов проводили по методике [11]. К 0,2 мл супернатанта последовательно добавляли 0,2 мл 0,5%-ного о-фенантролина в 96%-ном этаноле и 0,2 мл 0,2%-ного FeClз в 96%-ном этаноле.

Затем объем доводили до 3 мл 96%-ным этанола и выдерживали 10 мин. в темноте. Определение антиоксидантов проводили по калибровочному графику, построенному для кверцетина. Количество антиоксидантов рассчитывали в мг/г сухой массы.

Супернатант для определения активности пероксидазы и других ферментов, получали путем гомогенизирования в фарфоровой ступке навески семян (1 г) или сырой массы проростков в 3 мл 0,1 М натрий-фос-фатного буфера (рН 7,0), а затем гомогенат центрифугировали в течение 10 мин. при 7000 g. Активность пероксидазы выявляли при 22оС по начальной скорости окисления о-дианизидина перекисью водорода [12]. Для этого к 2,1 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,0) добавляли 0,2 мл раствора супернатанта и 0,1 мл 0,43 мМ раствора о-дианизидина в 96%-ном этаноле. Реакцию инициировали введением

0,1 мл 16 мМ перекиси водорода. Увеличение поглощения раствора для продукта окисления о-дианизидина регистрировали после быстрого перемешивания реагентов на спектрофотометре при А=460 нм (8 = 30 мМ—1 см—1) [12]. За единицу активности фермента принимали количество о-дианизидина (мкмоль), окисленного за 1 мин. в 1 г сухой массы.

Спектрофотометрические исследования проводили на двухлучевом спектрофотометре DМS 100 S (<^апап», США). В работе использовали этанол, очищенный перегонкой, о-дианизидин марки «ч.», очищенный возгонкой в вакууме, перекись водорода (30%-ный водный раствор) и антиоксиданты марки «о.ч.». Статистическую обработку данных проводили по Лакину [13].

Результаты и обсуждение

Изучена динамика содержания МДА, АО и активность пероксидазы в зародыше зерновок пшеницы в процессе их набухания и проклевывания (табл. 1).

Таблица 1

Содержание антиоксидантов, МДА и активность пероксидазы в зародыше со щитком зерновок пшеницы в процессе набухания и проклевывания

Время набухания зерновок, ч МДА,^ нмоль/г сухой массы А°'„ мкг/г сухой массы Активность ПО, мкмоль/мин. г сухой массы

Пе риод набухания

6 30,3±1,9 295,9±18,3 83,5±5,6

12 26,8±1,6 275,9±17,5 104,0±8,9

18 37,4±2,1 336,4±19,8 117,5±7,4

24 29,5±1,8 277,5±17,4 108,5±7,5

Период проклевывания

30 36,4±2,2 348,2±18,6 120,4±8,2

36 33,2±1,7 343,2±18,0 150,8±9,4

42 28,3±1,6 400,0±24,5 134,7±8,8

48 20,3±1,2 417,9±21,3 182,6±16,2

Из данных таблицы 1 следует, что между компонентами АОС зерновок в течение 24 ч набухания зерновок наблюдается взаимная зависимость, проявляемая в том, что в ответ на возрастание содержания АО отмечается понижение содержания МДА (r = -0,29), коррелирующее с повышением активности пероксидазы (г = 0,В2), тогда как показатели содержания МДА и перок-сидазной активности находятся в обратной зависимости (г = -0,49). Показатели содержания МДА, АО и активности пероксидазы в течение 4В ч периода набухания и прокле-вывания зерновок имели выраженную колебательную динамику. При этом уровень ПОЛ понизился в 1,5 раза, содержание АО и активность пероксидазы возросли, соответственно, в 1,4-1,5 и 1,75-2,1В раз (табл. 1).

Возрастание пероксидазной активности свидетельствует о том, что антиоксиданты способны индуцировать синтез фермента, который регулирует на этом этапе прорастания зерновок как содержание перекиси водорода, так и антиоксидантов. Причем установленные зависимости характеризуют специфичность механизмов начальных этапов набухания и проклевывания зерновок пшеницы, обусловленные взаимным влиянием пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов. По-видимому, в процессе метаболизации антиоксидантов изменяется их концентрация в клетках зерновок, что проявляется в регулировании активности пе-роксидазы и осуществлении общего контроля над деятельностью АОС. Взаимное влияние низко- и высокомолекулярных антиоксидантов обусловлено особенностью механизма действия пероксидазы, способностью фермента катализировать реакции окисления различных биогенных соединений,

среди которых могут быть различные антиоксиданты.

Низкие величины корреляции компонентов АОС, по-видимому, обусловлены тем, что при исследовании процессов набухания и проклевывания зерновки представляли гетерогенную группу, в которой присутствуют зерна с разной степенью готовности к прорастанию. Причем часть из них могут быть погибшими или слабыми зерновками.

Для того, чтобы это выяснить, мы изучили содержание МДА, АО и пероксидазную активность только у проклюнувшихся зерновок пшеницы (табл. 2), откуда следует, что характер зависимостей между компонентами АОС несколько отличается от предыдущих значений. Так, показатели содержания МДА и АО в проклюнувшихся зерновках приобретают более выраженную обратную коррелятивную зависимость (г = -0,52), тогда как повышение активности пероксидазы преимущественно сопровождается повышением уровня ПОЛ (г = 0,В0). В случае увеличения содержания АО отмечается понижение активности пероксидазы (г = -0,51). При этом у проклюнувшихся зерновок уровень ПОЛ и активность пероксидазы возрастали, соответственно, в 1,3-1,б и 3,9-5,б раз, тогда как содержание АО понижалось в 1,4-1,7 раза (табл. 2).

Более значительные показатели корреляции между компонентами АОС были выявлены при исследовании корневой и надземной части проростков пшеницы (табл. 3).

Таким образом, что в процессе прорастания содержание антиоксидантов в корнях и зеленых семядолях снижается, соответственно, в 5,4 и 1,7 раз. При этом активность пероксидазы в корнях возрастает в

1,95 раза, а в надземной части — в 1,5 раза.

Таблица 2

Содержание антиоксидантов, МДА и активность пероксидазы в проклюнувшихся зерновках пшеницы (измерения проводились после 24 ч набухания зерновок в дистиллированной воде)

Время проклевывания зерновок, ч МДА,^ нмоль/г сухой массы АО,_ мкг/г сухой массы Активность ПО, мкмоль/мин. г сухой массы

0 19±0,В 193+19 3,4+0,12

3 1В±0,В 12В+1З 2,б+0,09

б 21±0,9 213+21 З,9+0,1В

12 14±0,б 211+21 4,5+0,22

15 20±1,0 197+19 4,3+0,20

1В 14±0,5 197+19 5,З+0,2б

21 25±1,2 1б5+14 10,3+0,54

24 19±0,В 1бб+15 7,0+0,35

4В 29±1,В 135+12 19,2+1,23

Таблица З

Содержание МДА (нмоль/г сухой массы), антиоксидантов (мкг/г сухой массы) и активность пероксидазы (мкмоль/мин. г сухой массы) в корнях и надземной части проростков пшеницы

Время прорастания, сут. Корни Надземная часть

МДА АО ПО МДА АО ПО

2 12В+5,б 54б+З2 140+9 215+1б В24+7б ЗВ+0,З

3 10В+4,В 95б+В4 130+В 22б+1В 7б4+5б 32+0,2

4 15В+б,В З95+2В 1б0+11 З4З+2б 5ЗЗ+4В 5б+0,4

5 144+б,1 137+7 1б5+12 З1В+21 510+37 бЗ+0,5

б 1б4+7,В 11б+б 1В0+15 2В4+24 554+51 бВ+0,5

7 17В+9,7 92+3 200+19 2Зб+20 49В+З5 74+0,б

Полученные данные свидетельствуют о том, что в корневой системе регулятором уровня ПОЛ преимущественно служит пе-роксидаза, а надземной части — низкомолекулярные антиоксиданты. Последних в надземной части проростков пшеницы больше, чем в корнях, в 1,5-5,4 раза. Причем в корнях между антиоксидантами, уровнем ПОЛ и активностью пероксидазы наблюдается обратная зависимость (г = -0,88 и r = -0,89), а между содержанием МДА и активностью пероксидазы — прямая зависимость (г = 0,95).

В надземной части проростков пшеницы содержание МДА находится в обратной зависимости от содержания антиоксидантов (г = -0,69) и активности пероксидазы

(г = -0,91). При этом устанавливается корреляция между активностью пероксидазы и уровнем ПОЛ (г = 0,44). Эти данные свидетельствуют о том, что в зеленых семядолях процесс ПОЛ регулируется преимущественно за счет антиоксидантов, высокая концентрация которых может регулировать активность пероксидазы.

Заключение

В результате проведенных исследований установлена взаимная зависимость компонентов АОС, регулирующих процессы ПОЛ в клетках растений. Причем активность пе-роксидазы на этапе набухания и прорастания зерновок находится под контролем низкомолекулярных антиоксидантов, которые могут быть субстратами фермента и поэтому окислятся в оксидазных и перокси-дазных реакциях. Взаимная регулируемость системы позволяет контролировать ПОЛ в зерновках пшеницы на начальных этапах прорастания и поддерживать его на определенном уровне. Подтверждением этому служат результаты содержания МДА, АО и активности пероксидазы в надземной части проростков. Высокое содержание в зеленых семядолях АО обусловливает проявление специфичности в корреляции компонентов АОС. Механизм действия АОС растений основан на том, что в реакциях, катализи-

руемых пероксидазой, могут образовываться свободные радикалы, содержание которых можно контролировать по показателям уровня ПОЛ. Низкомолекулярные АО способны регулировать содержание свободных радикалов и влиять на величину пе-роксидазной активности, являясь субстратами пероксидазы. Кроме того, высокие концентрации АО служат индукторами синтеза пероксидазы. Таким образом, устанавливаются взаимная связь и взаимное влияние компонентов АОС. При этом особая роль отводится пероксидазе, которая на начальных этапах прорастания может выступать в качестве инициатора дыхательной активности митохондрий, которые проявляли минимальную активность в покоящихся зерновках. Кроме того, пероксидаза способна утилизировать избыток кислорода и перекиси водорода в клетках на этапе набухания и проклевывания зерновок путем участия в катализе оксидазных и пероксидазных реакций окисления, субстратами которых могут быть АО. Содержание АО и активность пе-роксидазы в клетках находятся под взаимным контролем, регулируя ПОЛ в зерновках на разных этапах прорастания.

Библиографический список

1. Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян. — Л.: Наука, 1985. — 347 с.

2. Обручева Н.В., Антипина О.В. Физиология инициации прорастания семян. // Физиол. растений. — 1997. — Т. 44. — № 2.

— С. 287-302.

3. Обручева Н.В., Антипова О.В. Общность физиологических механизмов подготовки к прорастанию у семян с различным типом покоя // Физиология растений. — 1999. — Т. 46. — № 3. — C. 426-431.

4. Гумилевская Н.А., Чумикина Л.В., Шатилова В.Р. Синтез белка и РНК в прорастающих семенах // Биохимия. — 1995. — Т. 60. — № 1. — C. 35-45.

5. Половникова М.Г., Воскресенская О.Л. Активность компонентов антиок-сидантной защиты и полифенолоксидазы у

газонных растений в онтогенезе в условиях городской среды // Физиология растений.

— 2008. — Т. 55. — № 5. — С. 777-785.

6. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Пе-рекисное окисление липидов в биологических мембранах. — М.: Наука, 1972. — 252 с.

7. Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Мо-лочкина Е.М., Пальмина Н.М., Храпова Н.Г. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. — М.: Наука, 1975.

— 241 с.

8. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. — 1987. — Т. 32. — № 5. — С. 830-844.

9. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зен-ков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Про-

оксиданты и антиоксиданты. — М.: Фирма «Слова», 2006. — 556 с.

10. Рогожин В.В., Курилюк Т.Т., Филиппова Н.П. Изменение реакции антиокси-дантной системы проростков пшеницы после ультрафиолетового облучения семян // Биофизика. — 2000. — Т. 45. — № 4. — С. 730-736.

11. Методы биохимического исследования растений / под ред. А.И. Ермакова. — Л.: Агропромиздат, 1987. — 430 с.

12. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена // Биохимия. — 1977. — Т. 42. — № 8. — C. 1372-1379.

13. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высш. шк., 1990. — 352 с.

УДК 632.981.4 Ю.И. Захарьева,

A.Л. Верещагин,

B.В. Еремина, В.В. Овчаренко, В.Г. Рыбников, В.В. Теплов

ПОВЫШЕНИЕ ФИТОТОКСИЧНОСТИ РЯДА ГЕРБИЦИДОВ ПРИ СОВМЕСТНОМ ПРИМЕНЕНИИ СО СВЕРХМАЛЫМИ КОНЦЕНТРАЦИЯМИ НЕКОТОРЫХ ПРИРОДНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

Ключевые слова: сверхмалые концентрации органических кислот (СМК), гербицид, баковая смесь, Ы-(фосфоно-метил)-глицин, лабораторные опыты, микрополе-вые опыты, полевые испытания, фитотоксичность.

Введение

Глифосат — ^(фосфонометил)глицин — послевсходовый, неселективный гербицид системного действия, используемый для уничтожения однолетних и многолетних сорняков на посевах и посадке многих полевых сельскохозяйственных, плодовых и цитрусовых культур, на виноградниках, в лесном и городском хозяйстве, для уничтожения водных сорняков, а также для десикации листвы определенных сельскохозяйственных культур [1]. В РФ глифосат разрешен к применению в качестве гербицида в составе 38 формуляций на 23 сельскохозяйственных культурах и в качестве десиканта в составе 14 формуляций на 7 культурах [2].

Гербициды на основе глифосата широко применяются в посевах генно-модифицированных растений (ГМ). Эти растения могут аккумулировать гербициды, к которым они устойчивы, и вместе с растением человек или животные будут поглощать остаточные количества глифосата и его метаболитов. Имеются данные о негативном воздействии ГМ-культур в виде аллергических реакций и ряда заболеваний [3].

Цель работы — изучение возможности снижения норм внесения формуляций гербицидов на основе глифосата при их совместном использовании с препаратом № 3 на основе сверхмалых концентраций природных органических кислот [4].

В 2010 г. на полях «АКГУП Птицефабрика Смоленская» (Смоленский район, Алтайский край) было проведено исследование по совместному использованию препарата № 3 на основе природных органических кислот (СМК) с концентрацией 10'11 М с гербицидом «Триатлон». Опыт был заложен в пер-