CC BY
104
1
БИОТЕРАПИЯ 61
>- УДК 616-006.04-033.2:615.2/.3.015 S. M. Kiselev, E. V. Laburdova, A. M. Kozlov EFFECT OF GALAVIT ON INVASION ACTIVITY OF TUMOR CELLS N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT We studied the ability of galavit to inhibit invasion activity of tumor cells in vitro. In the present work we have used matrigel invasion assay which is based on the cell ability to penetrate through the artificial basal membrane of connective tissue proteins. It was shown that galavit used in non-cytotoxic concentrations inhibits invasive activity of examined tumor cell lines to about 45-50%. Also we have demonstrated that galavit shows similar anti-invasive activity against mouse (B16F10 melanoma, LLC0604 Lewis Lung carcinoma) and human (Mel-03 melanoma, HT1080 fibrosaroma) tumor cell lines. The obtained results designated galavit as potential inhibitor of metastasis with pathogenetic function. Key words: Galavit, metastasis, artificial basement membrane, matrigel, invasive activity. С. М. Киселев, E. В. Лабурдова, А. М. Козлов ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА ГАЛАВИТ НА ИНВАЗИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ Изучена способность отечественного иммуномодулятора галавит ингибировать инвазивную активность опухолевых клеток Исследование выполнено на модели искусственной базальной мембраны: полимерной матрице, покрытой матригелем. Показано, что галавит при концентрациях, не оказывающих цитотоксического действия на опухолевые клетки, на 45-50 % ингибирует их способность проходить через искусственную базальную мембрану. Препарат проявил равную активность в отношении как клеток экспериментальных опухолей мыши (меланома B16F10 и карцинома LLC), так и опухолей человека (меланомы Mel-03 и фибросаркомы HT-1080). Выявленная активность характеризует галавит как потенциальный ингибитор метастазирования с патогенетической направленностью действия. Ключевые слова: Еалавит, метастазирование, искусственная базальная мембрана, матригель, инвазивная активность. ный рост - один из признаков метастатического фено-ВВЕДЕНИЕ типа опухолевых клеток. Инвазия опухолевыми клет- Способность опухолей к метастазированию - один ками тканевых структур микроокружения представля-из основных признаков их злокачественности. В про- ет собой начальный этап каскада метастатической цессе метастазирования опухолевые клетки преодоле- диссеминации злокачественного новообразования. вают тканевые барьеры, проникают в лимфатическую По своей сути опухолевая инвазия есть результат и кровеносную системы и транспортируются током аберрантной регуляции и активации сигнальных пу-биологических жидкостей в дренируемые лимфатиче- тей, модулирующих многие признаки клеточного фе-ские узлы и отдаленные внутренние органы. В основе нотипа, в частности, адгезивные свойства и особенно-способности опухолевых клеток к метастазированию сти межклеточных коммуникаций, продукцию и акти-лежат их адгезивные свойства, способность к актив- вацию протеолитических ферментов и их рецепторов ной миграции и продукции протеолитических фер- на клеточной поверхности, и т. д. [1; 10; 11; 14]. ментов, деградирующих компоненты базальных мем- В реализации опухолевой инвазии участвует це-бран и экстрацеллюлярного матрикса [11]. Инвазив- лый ряд протеолитических ферментов: цистеиновые ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1
1 1
62 БИОТЕРАПИЯ
к и сериновые протеиназы, матричные металлопро- Линии опухолевых клеток, использованные в рабо-теиназы (ММП) [4; 8; 9]. Одну из главных ролей те, и условия их культивирования в процессе опухолевой инвазии играет сериновая В работе использованы клетки линии Mel-03 протеиназа - урокиназа (уАП). Этот фермент пре- (меланома человека), HT1080 (фибросаркома чело-вращает плазминоген в плазмин, способный рас- века), B16 F10 (меланома мыши), LLC0604 (карци-щеплять многие белки плазматической мембраны нома легкого Льюис), 3T3 (эмбриональные фибро-и межклеточного матрикса, такие, как коллаген IV бласты мыши). типа, фибронектин и ламинин, активировать метал- Клетки меланомы Mel-03 получены из опухолево-лопротеиназы матрикса ММР-2, ММР-3, ММР-9. го материала больного после хирургической операции. Урокиназа проявляет также непротеолитическую ак- Клетки меланомы Mel-03 культивировали в среде тивность, взаимодействуя с рецептором (уАПР) RPMI 1640, содержащей 10 % телячьей эмбриона-и образуя комплексы с интегринами, которые конт- льной сыворотки (ТЭС), 2мМ L-глутамин, инсулин-се-ролируют клеточную адгезию и миграцию [3; 5; 16]. ленит-трансферрин (100мкг/мл), 1 % HEPES, пениВ регуляции клеточной инвазии принимают участие циллин (100 ед/мл), стрептомицин (100мкг/мл) и коми многие другие клеточные и молекулярные агенты, плекс аминокислот и витаминов (Eurobio). Клетки в частности, ядерный фактор транскрипции NF-kB фибросаркомы человека HT1080 (источник - амери-[7; 13; 15]. канская коллекция клеточных культур ATCC) культи-В целом процесс опухолевой инвазии - динамич- вировали в среде DMEM, содержащей 10 % ТЭС, ный многокомпонентный процесс, в основе которого 2мМ L-глутамина, ImM пирувата и комплекса амино-лежат клеточные и молекулярные биологические реак- кислот и витаминов (Eurobio). ции, регулируемые на уровне генома. Они находятся Клетки меланомы мыши линии B16F10 (источ-под влиянием активирующих и ингибирующих сигна- ник - американская коллекция клеточных культур лов и в каждом конкретном случае и на конкретном ATCC) культивировали в среде RPMI 1640, содержа-этапе опухолевой прогрессии зависят от преобладания щей 10 % ТЭС, 2мМ L-глутамин, пенициллин того или иного стимула. (100 ед/мл), стрептомицин (100мкг/мл) и комплекс Современные представления о механизмах онко- аминокислот и витаминов (Eurobio). патогенеза обосновывают целесообразность и реаль- Клеточная линия LLC0604 получена из первично-ность поиска ингибиторов опухолевой инвазии. Обна- го узла подкожно трансплантированной карциномы ружение таких агентов, способных подавлять инвазив- легкого Льюис (штамм для культивирования in vivo). ную активность опухолевых клеток, может внести Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержа-вклад на патогенетическом уровне и в подавление про- щей 10 % ТЭС, 2мМ L-глутамин, пенициллин цесса метастазирования злокачественной опухоли. (100 ед/мл), стрептомицин (100мкг/мл) и комплекс Такие агенты представляют безусловный интерес аминокислот и витаминов (Eurobio). в плане использования при лечении злокачественных Клетки фибробластов мыши 3T3 (источник - аме-новообразований, хотя их реальная способность рас- риканская коллекция клеточных культур ATCC) куль-ширить возможности традиционных средств противо- тивировали в среде DMEM, содержащей 10 % ТЭС, опухолевой терапии еще нуждается в подтверждении 2мМ L-глутамин, пенициллин (100 ед/мл), стрептоми-в исследованиях in vivo. цин (100мкг/мл). В последнее время появились данные, свидетельствующие о том, что биологические эффекты, прича- Инвазивный тест стные к реализации инвазии и метастазирования зло- Тест проводили в 24-луночных планшетах со качественных новообразований, могут модулировать вставочными ячейками, разделяющими лунку на 2 час-лекарственные средства разных фармакологических ти полупроницаемой полимерной мембраной с диаме-классов, находящиеся в сфере практического примене- тром пор 8 мкм. Для покрытия мембран использовали ния. [2; 6; 12; 17; 18]. матригель с пониженным содержанием ростовых фак-К этой группе лекарственных средств относится, торов в среде (Matrigel GFR, Becton Dickinson). Встав частности, и препарат галавит - производное фтал- вочные ячейки помещали в 24-луночный планшет, за-гидразида, обладающее противовоспалительным и им- полненный культуральной средой без сыворотки, и ва-муномодулирующим действием. куумировали в течение 10 мин для удаления воздуха из Целью настоящей работы явилось изучение анти- пор мембраны. Матригель (10мг/мл) разбавляли на инвазивной активности препарата галавит in vitro. холоду ТРИС - буфером ТРИС (0,04М), сахароза (4 %), хлорид натрия (0,03М), pH 8,0) до концентрации МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 0,75мг/мл и наносили на мембрану в объеме 40 мкл. Галавит в виде лиофилизированного порошка Вставочные ячейки с нанесенным слоем матригеля ин-в стерильных условиях растворяли в культуральной кубировали в термостате при 37 оС в течение 2 ч при среде до концентрации 100 мг\мл и путем последова- 40-60 % влажности (для аггрегации соединительно-тельных разбавлений в той же среде готовили раство- тканных белков на мембране) с последующим высуши-ры заданных концентраций для проведения исследо- ванием мембран в течение суток при 30 оС и 50 % ваний в культуре клеток. влажности. Непосредственно перед проведением тес- Ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
та нижнюю камеру заполняли культуральной средой с хемоаттрактантом (кондиционная среда 3Т3-фибро-бластов). Клетки высевали на мембрану с матригелем, добавляли тестируемое соединение и инкубировали в С02-инкубаторе (5 % С02, 37оС) в течение времени, подобранного экспериментально. Опыт проводили в 3 параллелях, количественную интерпретацию результатов - по методике, описанной ниже.
Количественная интерпретация результатов инвазивного теста
По окончании инкубационного периода клетки, не прошедшие через барьер, снимали с внешней поверхности мембраны с помощью ватной палочки, смоченной культуральной средой. Операцию проводили дважды для эффективного удаления клеток.
Вставочные ячейки поочередно помещали в лунки с раствором Лейшмана на 2-3 мин для фиксации клеток с дистиллированной водой для отмывки фиксирующего раствора и раствором Азур-Эозина для окрашивания клеток по Романовскому. Окраску проводили в течение 30 мин. Клетки считали в 5 рандомизированных полях площадью 1мм2 в каждой из 3 параллельных лунок.
Оценка антиинвазивного эффекта тестируемых соединений
Эффективность тестируемого соединения оценивали по степени ингибирования инвазии опухолевых клеток по сравнению с контролем, которым являются клетки без добавления препарата. Количественную оценку ингибирования инвазии тестируемыми соединениями проводили по формуле:
мкМ
Ч
Ки = ((Л-Б)/Л)х100 %, где
мкМ
Ки - коэффициент ингибирования инвазии;
А - количество опухолевых клеток, прошедших через барьер без добавления тестируемого соединения;
В - количество опухолевых клеток, прошедших через барьер с добавлением тестируемого соединения.
МТТ-тест
Опухолевые клетки рассевали в 96-луночные планшеты по 8 тысяч клеток/лунку, добавляя исследуемые препараты в различных концентрациях, и инкубировали в течение 72 ч в стандартных условиях. За 2 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора (0,5 мг/мл) МТТ в среде для культивирования клеток. После появления окраски
Рис. 1. Кривые выживаемости опухолевых клеток меланомы человека Ме1-03, фибросаркомы человека НТ1080, меланомы мыши В16И0, карциномы легкого Льюис ЬЬС0604 при инкубации с галавитом, МТТ-тест, 72 ч
среду удаляли, растворяли кристаллы формазана в 150 мкл диметилсульфоксида и спектрофотометрически измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм. Выживаемость клеток, подвергшихся воздействию исследуемых соединений, оценивали в процентах, принимая за 100 % выживаемость контрольной культуры.
Сводные данные по цитотоксической активности препарата галавит
Лекарственный препарат ІС50 (мкМ)
МеЮЗ НТ1080 В16Р10 1ХС0604
Галавит 6000 5500 2900 3670
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение цитотоксической активности галавита in vitro
Цитотоксическую активность препаратов оценивали с использованием МТТ-теста. Критерием выраженности цитотоксического эффекта является показатель IC50, обозначающий концентрацию препарата, при которой гибнет 50 % клеточной популяции. Результаты изучения цитотоксической активности галавита приведены на рис. 1.
Цитотоксическая активность препарата галавит в отношении клеток исследуемых линий выявлена лишь при больших концентрациях - 10-2 - 10-3 М (см. таблицу).
Исходя из данных, полученных в настоящем исследовании, галавит следует отнести к агентам, не обладающим цитотоксической активностью.
Изучение антиинвазивной активности препарата галавит
Антиинвазивная активность препарата галавит изучена в экспериментах с использованием 2 линий опухолевых клеток человека: меланомы человека Mel-03 и фибросаркомы человека HT-1080 и 2 линий опухолевых клеток мыши: меланомы B16F10 и карциномы легкого Льюис LLC0604.
Для адекватной оценки специфического антиин-вазивного эффекта тестируемого соединения важен корректный выбор диапазона рабочих концентраций. Изучение антиинвазивной активности при концентрациях, оказывающих выраженное цитотоксическое действие, может привести к заведомо завышенным результатам по ингибированию специфической (антиинвазивной) активности. В связи с этим в настоящем исследовании активность галавита изучали в диапазоне концентраций, не обладающих значимым цитотоксическим действием. Диапазон используемых концентраций выбирали на основе данных,
50
45
40
35
30
5 25
* 20
15
10
5
0
п.
50 80 120
концентрация, мкМ
150
полученных при изучении цитотоксической активности препарата галавит. Центральной (реперной) точкой диапазона концентраций была выбрана концентрация, при которой выживаемость клеток составляла 85 % (1С15).
Учитывая тот факт, что антиинвазивная активность тестируемых соединений может быть обусловлена различными механизмами, требующими для реализации ожидаемого эффекта определенного времени инкубации, действие препарата оценивали в 2 временных режимах инкубации. В первом случае опухолевые клетки предварительно инкубировали в среде, содержащей галавит, в течение суток, во втором препарат добавляли к инкубируемым опухолевым клеткам непосредственно перед проведением теста.
Данные, свидетельствующие о способности препарата галавит ингибировать инвазивную активность клеток меланомы и фибросаркомы человека (линии те1-3 и НТ-1080), представлены на рис. 2 и 3.
Показано, что в дозе 150мкМ галавит ингибирует инвазивную активность опухолевых клеток линии Ме1-03 на 50 % и на 45 % клеток линии НТ-1080 (рис. 2, 3).
Данные по ингибированию инвазивной активности опухолевых клеток мыши представлены на рис. 4. Наибольший антиинвазивный эффект галавита отмечен при концентрациях препарата 100 мкМ (для клеток меланомы В16 И0, Ки = 29% ) и 150 мкМ (для клеток ЬЬС0604 , Ки = 46 %) (рис. 4).
Существенных различий в антиинвазивном эффекте галавита при двух схемах инкубации опухолевых клеток выявлено не было.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате настоящего исследования выявлена способность галавита ингибировать инвазивную активность опухолевых клеток разного гистогенеза. Эф-
Рис. 2. Ингибирование препаратом галавит инвазивной активности опухолевых клеток линий Ме1-03 (светлые столбики) и НТ-1080 (темные столбики)
Рис. 3. Микрофотографии клеток Ме1-03(А) и НТ-1080(Б), прошедших через матригель. С правой стороны клетки с добавлением галавита в максимально эффективной дозе 150 мкМ, с левой стороны клетки исследуемых линий без добавления препарата
: I ш
о I I
О 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120
Рис. 4. Ингибирование инвазивной активности клеток карциномы легкого Льюис (ЬЬС0604) и меланомы В16-И0 галавитом. Инвазивный тест, 72 ч
фект галавита выражен в отношении как клеток экспериментальных опухолей, так и опухолей человека, что повышает достоверность и значимость полученных данных. Эффект препарата реализуется при уровне концентраций, не вызывающих цитотоксического действия на опухолевые клетки. Способность опухолевых клеток деградировать белки экстрацеллюлярного матрикса и базальной мембраны путем инициации реакций локального протеолиза играет чрезвычайно важную роль в проявлении их метастатического фенотипа. Полученные данные характеризуют галавит как потенциальный ингибитор метастазирования с патогенетической направленностью действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Allgayer Y., Wang H., Wang Y. et al. Transactivation of the urokinase type plasminogen activator receptor gene through a novel promoter motif bound with an activator protein-2a-related factor // J.Biol.Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 4702-4714.
2. Ashikawa K., Shishodia S., Fokt I. et al. Evidence that activation of Nuclear Factor-kappa B is essential for doxorubicin-induced cell death in myeloid and lymphoid cells // Biochemical Pharmacology. - 2003. - Vol. 24. - P. 123-148.
3. Blasi F. uPA, uPAR,PAI-1: key intersection of proteolytic, adhesive and cyemotactic highways? // Immunol. Today. - 1997. - Vol. 18. - P. 415-417.
4. Dano R., AndreasenP. A., Grindal-Yansen J. et al. Plasminogen activators, tissue degradation and cancer // Adv. Cancer Res. - 1985. - Vol. 44. - P. 139-266.
5. Dano K., RomernJ., Nielsen B. S. et al. Cаncer invasion and tissue remodeling cooperation of protease systems and cell types // APMIS. - 1999. - Vol. 107. - P. 120-127.
6. Fife R. S., Sledge G. W. J., Sissons S., Zerler B. Effects of tetracyclines on angiogenesis in vitro // Cancer Lett. - 2000. - Vol. 153. - P. 75-78.
7. Futakuchi M., Ogawa K., Tamano S. et al. Suppression of metastasis by nuclear factor kappaB inhibitors in an in vivo lung metastasis model of chemically induced hepatocellular carcinoma // Cancer Sci. - 2004. - Vol. 95. - P. 18-24.
8. Lyons R. N., Gentru L. E., Purchio A. F. et al. Mechanism of activation of latent recombinant transforming growth factor-1 by plasmin // J.Cell.Biol. - 1990. -Vol. 110. - P. 1361-1367.
9. Mars W. M., Zarnegar R., Michalopoulos G. K. Activation of hepatocyte growth factor by the plasminogen activatirs uAP and tAP // Am. J.Pathol. - 1990. - Vol. 143. - P. 949-958.
10. Nguyen D. Y., Webb D. J., Catling A. D. et al.
Urokinase-Type plasminogen activator stimulates the Ras/Erk signaling pathway and MCF-7 cell migration by a mechanism that requires FAK, Src, and Shc: rapid dissociation of Grb2/Sos from Shc is associated with the transient phosphorylation 0f ERK in urokinase-treated cells // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. -
P. 19385-19388.
11. Poste G., Fidler I. J.The pathogenesis of cancer metastasis // Nature. - 1980. - Vol. 283. - P. 139-146.
12. Seftor R. E., Seftor E. A., De Larco J. E. et al. Chemically modified tetracyclines inhibit human melanoma cell invasion and metastasis // Clin.Exp.Metastasis. - 1998. - Vol. 16. - P. 217-225.
13. Shishodia S., Aggarval B. B. Nuclear factor (NF) -kB activation mediates cellular transformation, proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of cancer // Cancer. - 2003. - Vol. 21. - P. 235-263.
14. Sliva D. Signaling Pathways Responsible for Cancer Cell Invasion as Targets for cancer Therapy // Current Cancer Drug Targets. - 2004. - Vol. 4. - P. 325-333.
15. Umeda M., Ichiyama T., Hasegawa S. et al. Theophylline inhibits NF-kappaB activation in human peripheral blood mononuclear cells // Int Arch Allergy Immunol. - 2002. - Vol. 128(2). - P. 130-135.
16. Wang Y. The role and Regulation of Urokinase-Type Plasminogen Activator Receptor Gene Expression in Cancer Invasion and Metasyasid // 2001 Jhon Wiley & Sons, Inc.Med Res Rev. - 2001. - Vol. 21. - P. 146-170.
17. Yatsunami J., Fukuno Y., Nagata M., et al. Antiangiogenic and antitumor effects of 14-membered ring macrolides on mouse B16 melanoma cells // Clin Exp Metastasis. - 1999. - Vol. 17. - P. 361-367.
18. Yatsunami J., Tsuruta N., Fukuno Y. et al. Inhibitory effects of roxithromycin on tumor angiogenesis, growth and metastasis of mouse B16 melanoma cells // Clin Exp Metastasis. - 1999. - Vol. 17. - P. 119-124.
Поступила 21.09.2006.
