CC BY
115
I I I I I I
■ I I I
Оригинальные исследования
Влияние пониженного содержания кислорода на дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека in vitro
АЛ. Жамбалова, ЮГ. Гершович, ЛБ. Буравкова, С.В. Гальчук, ЮА. Романов Государственный научный центр РФ - Институт медико-биологических проблем РАН, Москва
Effects of low oxygen levels on differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells of human bone marrow in vitro
A.P. Zambalova, Yu.G. Gershovich. L.B. Buravkova, S.V. Gal'chuk, Yu A. Romanov RF State Scientific Centei— the Institute of Medico-Biological Problems RAS, Moscow
Исследовали дифференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (мезенхимальных стволовых клеток, МСК) костного мозга человека и экспрессию транскрипционного фактора, индуцируемого при гипоксии (Hypoxia Inducible Factor — FIIF-1 а), при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода (1 и 5% Су. При индукции МСК в нормоксических (20% Су условиях и при пониженном содержании кислорода установлена, проявляющаяся в различной степени, способность МСК к дифференцировке в остеогенном, адипогенном, эндотелиальном направлениях. Методом проточной цитометрии выявлено, что уровень FIIF-1 а в цитоплазме монослойных культур МСК, инкубированных при 1 и 5% содержании кислорода в течение 24 ч и 7 сут., снижается по сравнению с нормоксическим контролем (20% 0J.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировочный потенциал, пониженное содержание кислорода, транскрипционный фактор, индуцируемый при гипоксии [HIF-1—).
We investigated differentiation potential and the expression of transcriptional factor stimulated by hypoxia (Flypoxia Inducible Factor — FIIF-1 — of mesenchymal stem cells (MSC) derived from adult bone marrow under low oxygen tension (1% 02 and 5% Cy. It was revealed modification in differentiation capacity (osteogenic and adipogénie) of MSC dependent to the level of oxygen tension. Flow cytometry analysis demonstrated reduced amount of FIIF-1 — in cytoplasm of MSC monolayers incubating under 1% and 5% of oxygen for 24 hours and 7 days in comparison with normoxic controls (20% O^.
Keywords: mesenchymal stem cells, differentiation potential, low oxygen tension, transcriptional factor stimulated by hypoxia [Hypoxia Inducible Factor — HIF-1—).
Введение
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (мезенхимальные стволовые клетки, МСК) в культуре обладают способностью к активной пролиферации, поддержанию кроветворного микроокружения в течение длительного времени и дифференцировке в различные типы клеток мезодермального ряда в ответ на действие соответствующих стимулов [1, 2]. Накоплен большой опыт индукции МСК к дифференцировке in vitro в самых различных направлениях, однако механизмы включения тех или иных дифференциро-вочных путей изучены недостаточно. Кроме того, известно, что условия культивирования — состав среды, индукторы дифференцировки, характер субстрата и состав газовой смеси играют существенную роль в реализации функциональных возможностей клеток. В условиях пониженного содержания кислорода активируются многие важные физиологические процессы, например, эритропоэз, ангиогенез, которые тесно связаны с транскрипционной экспрессией индуцируемых гипоксией генов [3—7]. Ключевая роль в инициации такого системного ответа клетки принадлежит специфическому белковому фактору, индуцируемому при гипоксии — HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1). HIF-1 представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух субъединиц: индуцибельно экспрессируемой кислородчувствительной субъединицы HIF-1 — и конститутивно экпрессируемой в ядре (независимо от на-
e-mail: [email protected]
пряжения кислорода в клетке) субъединицы HIF-lp. Этот транскрипционный фактор активирует ряд генов, экспрессия которых необходима для поддержания клеточного гомеостаза [7—9].
Многие исследователи напрямую связывают диффе-ренцировочные процессы с регуляцией, опосредованной HIF-1 — [10—12]. Так, в исследованиях S. Provot и соавт. отмечают замедление хондрогенеза при нокаутировании HIF-1 — у эмбрионов мышей [13]. HIF-1 активирует гены, кодирующие синтез таких ростовых факторов, как фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), ангио-поэтин 1 и 2 (ANGPT1, ANGPT2), которые регулируют ангиогенез [14—16].
Целью исследования явилось изучение экспрессии HIF-1 — и дифференцировочного потенциала МСК костного мозга человека при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода.
Материал и методы
Культивирование клеток в условиях гипоксии
Для культивирования в условиях пониженного содержания кислорода (5% 02, 5% С02, 90% N2) и низкого содержания кислорода (1% 02, 5% С02, 94% l\l2) использовали мультигазовый инкубатор МС0-175М (Sanyo, Япония) или герметичные инкубационные камеры (Stem Cell Technologies, Канада), в которых воздух замещали газовой смесью (94% N2 или 90% N2, 5% С02) и помещали в термостат ( + 37°С). Содержание
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009
А
J I
I ■ ■ тп
Оригинальные исследования
кислорода и давление в газовой среде камеры контролировали с помощью встроенных в камеру датчиков.
Оценка дифференцировочного
потенциала МСК
Для подтверждения возможности дифференцировки, демонстрирующей остеогенный потенциал МСК костного мозга человека, клетки инкубировали в среде, содержащей остеогенные дифференцировочные стимулы: 1СНМ дексаметазона, 10 мМ р-глицерол-2-фосфата натрия (Sigma, США) и 0,2 мМ 2-фосфо-1-аскорбино-вой кислоты (Fluka, Германия) и без добавления индукторов, при различном содержании кислорода (1,5 и 20% 02). Способность к дифференцировке МСК в остеогенном направлении оценивали гистохимически по степени минерализации внеклеточного матрикса после культивирования МСК в течение 21 сут. в остеогенной среде. Гистохимическое окрашивание Са2+ внеклеточного матрикса проводили ализариновым красным S (40 тМ, pH 4,2) (Sigma, США).
Для анализа способности МСК к адипогеннной дифференцировке клетки культивировали до достижения монослоя. Монослойные культуры клеток далее культивировали в индукционной среде (200 /jM индометацин, 0,5 тМ З-изобутил-1 -метилксантин, 10 /jM инсулин, 10~8 М дексаметазон) (Sigma, США) и среде без адипо-генных стимулов при различном содержании кислорода (1,5 и 20% 02) в течение 21 сут. Адипогенную диффе-ренцировку оценивали визуально по образованию внут-риклеточно липидных капель. Клетки отмывали от среды буферным раствором, фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали с помощью 0,36% масляного красного О в изопропаноле (Sigma, США).
Для выявления способности МСК образовывать капилляроподобные структуры суспензию МСК, приготовленную для пассирования, инкубировали в матригеле (ECMatrix™, CHEMICON®, США), содержащем ламинин, коллаген IV типа, протеогликаны, энтактин, факторы роста — TGF-ß, FGF, при различном содержании кислорода (1,5 и 20% 02) в течение 12 ч.
Визуальный анализ и фотографирование клеток проводили с помощью микроскопа, оборудованного цифровой фотокамерой (Leica DMIL, Германия).
Цитофлюориметрический анализ уровня HIF-1 —
в цитоплазме
Экспрессию HIF-1 — анализировали с помощью проточной цитофлюориметрии (Epics XL, Beckman Coulter,
США). При исследовании экспрессии HIF-1 — применяли в качестве первичных антител — мышиные моноклональные антитела против HIF-1 — (H1-alpha-67, Abeam, Великобритания) в разведении 1:500; в качестве вторичных антител — соответствующие антивидовые антитела IgG, меченые ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат) (Jackson Immunoresearch, США). Позитивным контролем служили моноклональные антитела против вимен-тина (Dako Cytomation, Дания), в негативном контроле — первичные антитела не вносили. Проведено 6 серий
—
ми в монослойных культурах МСК различных пассажей.
Результаты
При культивировании МСК при 1,5 и 20% 02 в течение 3 нед. в среде, не содержащей остеогенные стимулы, клетки не кальцифицировали матрикс, тогда как в остеогенной среде отмечалось накопление солей кальция в ходе остеогенной дифференцировки МСК. Добавление остеогенных стимулов в среду роста МСК приводило к активной прогрессии остеогенеза, сопровождающейся активацией роста, формированием многослойных пластов клеток, приобретением клетками полигональной формы. При культивировании МСК при 5 и 20% 02 в течение 3 нед. клетки формировали узелки, а также интенсивно синтезировали межклеточное вещество, которое выявляли гистохимически с помощью ализаринового красного как соли кальция (рис. 1). Качественных различий (приобретение морфологических признаков остеобластов, присутствие кальция во внеклеточном матриксе) между МСК, культивируемыми при 5 и 20% 02 выявлено не было, но соотношение количества минерализованного матрикса различалось. В нормоксических (20% 02) культурах МСК синтезированный матрикс с солями кальция полностью покрывал монослой клеток, в отличие от культур, инкубируемых при 5% 02. В гипоксических условиях (1% 02) в среде с остеогенными стимулами МСК не вырабатывали минерализованного межклеточного вещества.
После индукции в адипогенном направлении клетки приобретали сферическую или близкую к ней форму, в цитоплазме клеток происходило накопление липидных включений, которые при окрашивании липофиль-ным красителем приобретали оранжево-красный оттенок. Детальная микроскопия опытных образцов выявила сходную эффективность адипогенеза между культурами МСК, экспонированными при 1,5 и 20% 02
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009
■ И I II II
■ III
Оригинальные исследования
(рис. 2). В то же время в культурах, инкубируемых с адипогенными стимулами при 20% 02, клетки объединялись с близлежащими клетками в единые колонии или кластеры с липидными включениями во внутриклеточном пространстве, которые на поздних этапах диффе-ренцировки сливались в крупные конгломераты жировых капель и заполняли весь объем клетки. Размеры жировых капель в адипогенных культурах МСК, экспонированных при 5% 02, были меньше. При культивировании МСК в среде, содержащей 1% 02, количество клеток с липидными включениями было существенно ниже, чем при инкубации при 5% 02 и 20% 02 уменьшался и размер липидных капель. В культурах МСК, инкубированных в среде без индукторов при 1,5 и 20% 02, не было отмечено клеток с наличием липидных капель.
Исследования по выявлению возможности МСК образовывать капилляроподобные структуры показали, что МСК, инкубируемые в матригеле с факторами роста как при 5% 02, так и при 20% 02, способны к дифференци-ровке в эндотелиальном направлении. В экспериментальных образцах уже через 8 ч. инкубации отмечена организация клеток в сетевидные трехмерные структуры (рис. 3). Сетевидная структура генерировалась из клеток, которые представляли собой уплотненные шаровидной формы образования, соединенные друг с другом длинными узкими отростками. В процесс дифференци-
ровки под действием специфических факторов, содержащихся в среде инкубирования, были вовлечены практически все клетки, экспонированные как при 5% 02, так и при 20% 02. При сопоставлении морфологических характеристик и временной динамики при инициализации дифференцировки МСК в капилляроподобные структуры не было отмечено существенных различий между культурами МСК, инкубируемыми при 5% 02 и 20% 02
Для сравнительного определения экспрессии цитоплазматического Н1Р-1 —, клетки инкубировали при различном содержании кислорода (1, 5 и 20%) в течение 24 ч. или 7 сут. В результате цитофлюориметрическо-го анализа исследуемых культур МСК, инкубированных в нормоксии и гипоксии в течение 24 ч., были выявлены различия в уровне экспрессии Н1Р-1—, зависящие от концентрации кислорода в среде. В нормоксических культурах число клеток с выявляемым в цитоплазме Н1Р-1 — сильно варьировало в зависимости от пассажа клеток и составляло от 13 до 75 % популяции. Экспозиция при 5% 02 в течение 24 ч. снижала число кле-
—
ровали от 5 до 50% популяции (рис. 4). Снижение до 1% 02 в среде приводило к понижению доли клеток, экспрессирующих исследуемый транскрипционный фактор до критически низких значений.
Рис. 2. Индуцированная адипогенная дифференцировка МСК, культивированных при различном содержании кислорода: А - 20% Ог; Б-5%0г;В - 1% Ог). Окраска: масляный красный О, У в, х400
Рис. 3. Капилляроподобные структуры в культуре МСК, инкубированных при 20% Ог[А)и 5%> Ог (Б). Фазовый контраст. Ув. х100
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009
І І І І І І
Оригинальные исследования
І
ц,
а
к
t;
о
Ч
Содержание кислорода
Содержание кислорода
Рис. 4. Доля клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор НІР-1 а в цитоплазме МСК, культивированных при различном содержании кислорода.
Экспозиция - 24 ч. Данные репрезентативного эксперимента для клеток 5 пассажа
Рис. 5. Доля клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор НІР-1 ав цитоплазме МСК, культивированных при различном содержании кислорода.
Экспозиция - 7 сут. Данные репрезентативного эксперимента для клеток 5 пассажа
Аналогичное уменьшение числа клеток, экспресси-—
рах МСК, экспонированных при 1 и 5% 02 (рис. 5). В популяциях МСК, культивированных в течение 7 сут. при 20% 02 наблюдали высокий уровень числа клеток,
—
ми 24-часовой экспозиции, который составлял от 24 до 85%, в зависимости от пассажа МСК. Понижение содержания кислорода в среде сопровождалось сниже-
—
—
содержащей 5% 02, варьировала от 16 до 77%. При инкубировании клеток в течение 7 сут. при 1 % 02 отмечали
—
Обсуждение
Дифференцировочный потенциал является одной из определяющих функциональных характеристик МСК.
Индуцированная остеогенная дифференцировка приводила к появлению клеток, обладающих полигональной формой, продуцирующих минерализованный матрикс. Свойства изученных клеток, одновременно направленных по пути дифференцировки, в разной степени соответствовали приведенным признакам. Свидетельствующие о функциональной активности МСК костного мозга человека признаки остеогенной и адипогенной дифференцировки в значительной степени варьировали в зависимости от концентрации кислорода. Если в среде, содержащей 5% 02 наблюдалось понижение способности МСК к минерализации внеклеточного матрикса и накоплению липидных капель, по сравнению с таковыми при 20% 02, то в условиях 1% 02 МСК практически полностью теряли способность к минерализации матрикса и не могли успешно дифференцироваться в адипо-цитарном направлении, что, вероятно, свидетельствует о невозможности завершить фенотипическую трансформацию в условиях «жесткой» гипоксии.
На культурах МСК, остеобластов человека и имморта-лизованных остеобластоподобных клетках было показано, что в условиях пониженного содержания кислорода (0,2^2% 02) происходит снижение экспрессии ключе-
вого для остеогенной дифференцировки транскрипционного фактора — Runx2. Как следствие этого продемонстрировано снижение образования «нодул» и минерализованных участков в культуре исследуемых клеток
[17]. Ранее нами показано, что культивирование МСК из костного мозга крыс в среде с остеогенными стимулами при пониженном содержании кислорода (5% 02) приводит к снижению активности раннего маркера остеогенной дифференцировки — щелочной фосфатазы
[18].
Т. Fink и соавт. при изучении адипогенного фенотипа МСК человека в условиях низкого содержания кислорода (1—2% 02) установили, что, несмотря на накопление липидов во внутриклеточном пространстве, эти процессы, свидетельствующие о приобретении клетками адипогенного фенотипа, не сопровождались увеличенной транскрипцией специфичных для адипоцитов факторов, таких как ADD1/SREBP1 с, PPAR-y2, аР2. Авторы отмечают также, что при определенных гипокси-ческих условиях МСК способны приобрести морфологию адипоцитарных клеток в отсутствие истинного адипогенного преобразования [19].
Потенциал МСК костного мозга человека не ограничивается только дифференцировкой по ортодоксальным направлениям. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что действие определенных ростовых факторов и химических индукторов вызывает диффе-ренцировку МСК в нейроноподобные клетки [20, 21], гепатоциты [22], эпителиоциты легких [23]. Согласно данным М. Majumdar, МСК не только сами подвергаются различным дифференцировкам, но и способны регулировать дифференцировку других стволовых клеток, в частности, кроветворных [24]. В нашей работе при оценке способности МСК образовывать капилляроподобные структуры была доказана возможность этих клеток дифференцироваться в эндотелиальном направлении, успешно реализуемая и при пониженном содержании кислорода в среде. Необходимо отметить, что наряду с изменениями дифференцировочных способностей МСК в остеогенном и адипогенном направлениях при культивировании в течение 3 нед. в условиях пониженного содер-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009
■ И I II II
■тп
Оригинальные исследования
жания кислорода, показанными в нашем исследовании, при дифференцировке МСК в эндотелиальном направлении отчетливых различий не установлено. По-видимому, короткие сроки экспонирования МСК при различном содержании кислорода не позволили выявить отличительные особенности при формировании капилляроподобных структур.
Продемонстрированные уже через 24 ч различия в экспрессии HIF-1 — в нормоксических и гипоксических условиях подтверждают, что транскрипционный фактор HIF-1 — является одним из первых регуляторов клеточного системного ответа индуцирующих адаптивную реакцию. Это происходит путем транслокации HIF-1 — из цитоплазматического пространства в ядро и гетероди-меризации с конститутивно экспрессируемой субъединицей HIF-1 р, образования транскрипционного активного комплекса и последующей транскрипционной активацией генов-мишеней [5, 8, 25]. В исследованиях с культурами клеток, так и условиях in vivo описывают переход цитоплазматического HIF-1 — в ядро в гипоксических условиях [26, 27]. Таким образом, можно предположить, что детектируемое на уровне белка снижение HIF-1 — относительно нормоксических условий, указывает на активацию данного транскрипционного фактора при пониженном содержании кислорода. Кроме того, известно, что в нормоксических условиях HIF-1 — подвергается убиквитин-протеасомальной деградации в реакциях пролил-гидроксилирования [9]. Высокая активность пос-
—
—
тарата и аспартата, которые проявляют при этом анти-оксидантные свойства и ограничивают свободнорадикальную активность. Исходя из этого, целесообразно допустить, что широкая вариабельность содержания
—
при пониженном содержании кислорода тесно сопряжена с регуляторным взаимодействием пролил-гидро-ксилазных реакций и сигнальными субстратами.
Таким образом, признаки, свидетельствующие о реализации дифференцировочных потенций МСК, в существенной степени варьировали в зависимости от концентрации кислорода. Если в среде, содержащей 5% 02, наблюдалось небольшое понижение способности МСК к минерализации внеклеточного матрикса и накоплению липидных капель по сравнению с таковыми при 20% 02, то в условиях 1% 02 МСК практически полностью теряли способность к минерализации матрикса и не могли дифференцироваться в адипоцитарном направлении. Не исключено, что эти процессы могут регулироваться за счет активации гипоксией индуцибель-
—
лирует работу множества генов, активирующих синтез ростовых факторов, гликолитических ферментов, про-апоптотических белков.
Работа выполнена при поддержке программы ОБН РАН и госконтракта Роснауки № 02.552.11.2006.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells. J. Orthop Res. 1991; 9 [5]: 641-50.
2. PittengerM. F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Mutilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143—7.
3. Semenza G.L., Wang G.L. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol. Cell Biol. 1992; 12 [121: 5447-54.
4. Carmeliet P., Dor Y., Herbert J.M. et al. Role of HIF-1 alpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis. Nature. 1998; 394: 485—490.
5. Semenza G.L. Hypoxia, clonal selection, and the role of HIF-1 in tumor progression. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2000; 35: 71—103.
6. Greijer A.E., van der Wall E. The role of hypoxia inducible factor 1 [HIF-1] in hypoxia induced apoptosis. J. Clin. Pathol. 2004; 57: 1009—14.
7. Manalo D.J., Rovan A., Lavoie T. et al. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1. Blood 2005; 105: 659-69.
8. Wang G.L, Jiang B.H, Semenza G.L. Effect of protein kinase and phosphatase inhibitors on expression of hypoxia-inducible factor 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216: 669—75
9. Maxwell P.H., Wiesener M.S., Chang G.W. et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 1999; 399: 271—5.
10. Yun Z., MaeckerH.L., Johnson R.S., Giaccia A.J. Inhibition of PPAR gamma 2 gene expression by the HIF-1-regulated gene DEC1/Stra13: a mechanism for regulation of adipogenesis by hypoxia. Dev. Cell. 2002; 2: 331-41.
11. Расагу E., LegrosH., ValableS. et al. Synergistic effects of CoCI2 and ROCK inhibition on mesenchymal stem cell differentiation into neuronlike cells. J. Cell Sci. 2006; 119: 2667-78.
12. Kieda C., Greferath R., Da Silva C.C. et al. Suppression of hypoxia-induced HIF-1— and of angiogenesis in endothelial cells by myo-inosito! trispyrophosphate-treated erythrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006; 103(421: 15576-81.
13. Provot S., Zinyk D., Gunes Y. et al. HIF-16 regulates differentiation of limb bud mesenchyme and joint development. J. Cell Biol. 2007; 177: 451-64.
14. RamHrez-Bergeron D.L., Simon М. C. Hypoxia-inducible factor and the development of stem cells of the cardiovascular system. Stem Cells 2001; 19t4]: 279-86.
15. Pugh C.W., Ratcliffe P.J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nat. Med. 2003; 9: 677—84.
16. Kelly B.D., Hackett S.F., Hirota K. et al. Cell type-specific regulation of angiogenic growth factor gene expression and induction of angiogenesis in nonischemic tissue by a constitutively active form of hypoxia-inducible factor 1. Circ. Res. 2003; 93(111: 1074-81.
17. Salim A., Nacamuli R.P., Morgan E.F. et al. Transient changes in oxygen tension inhibit osteogenic differentiation and Runx2 expression in osteoblasts. J. Biol. Chem. 2004; 279: 40007—16.
18. Буравкова Л.Б., Анохина Е.Б. Мезенхимальные стромальные клетки-предшественники: общая характеристика и особенности функционального состояния при пониженном содержании кислорода. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова 2008; 94 [71: 737-57.
19. Fink Т., Abildtrup L., Fogd К. et al. Induction of adipocyte-like phenotype in human mesenchymal stem cells by hypoxia. Stem Cells 2004; 22: 1346-55.
20. Hermann A., Gastl R., Liebau S. et al. Efficient generation of neural stem cell-like from adult human bone marrow stromal cells. J. Cell Sci. 2004; 117: 4411-22.
21. Wislet-Gendebien S., Hans G., Leprince P. et al. Plasticity of cultured mesenchymal stem cells: switch from nestin-positive to excitable neuronlike phenotype. Stem cells. 2005; 23 [31: 392-402.
22. Wang P.P., Wang J.H., Yan Z.P. et al. Expression of hepatocyte-like phenotypes in bone marrow stromal cells after HGF induction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 320: 712—16.
23. Prockop D.J., Gregory C.A., Spees L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 11917-23.
24. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D. et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells tMSCs] and stromal cells. J. Cell. Physiol. 1998; 176: 57—66.
25. Maxwell P.H., Dachs G.U., Gleadle J.M. et al. Hypoxia-inducible factor-1 modulates gene expression in solid tumors and influences both angiogenesis and tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94: 8104-09.
26. Hollander A.P., Corke K.P., Freemont A.J., Lewis C.E. Expression of hypoxia-inducible factor 16 by macrophages in the rheumatoid synovium. Arthritis Rheum. 2001; 44 [71: 1540—44.
27. Hitchon C., Wong K., Ma G. et al. Hypoxia-induced production of stromal cell-derived factor 1 [CXCL12] and vascular endothelial growth factor by synovial fibroblasts. Arthritis Rheum. 2002; 46 [101: 2587—97.
Поступила 91.012009
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 3, 2009
