CC BY
11
DOI: https://doi.org/10.17650/1726-9784-2021-20-4-51-58
Влияние Poly(I:C) и меланомы B16-F10 на иммунофенотип клеток селезенки мышей
А.В. Пономарев, А.А. Рудакова, З.А. Соколова, М.А. Барышникова, В.С. Косоруков
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Александр Васильевич Пономарев kl8546@yandex.ru
Введение. Известно, что агонист TLR-3 Poly(I:C), используемый в качестве адъюванта в ряде моделей противоопухолевых вакцин, вызывает торможение роста меланомы В16, однако недостаточно полно изучены иммунологические аспекты, вовлеченные в этот процесс.
Цель исследования - оценка изменений иммунофенотипа клеток селезенки мышей C57BL/6, вызванных опухолевой нагрузкой и/или Poly(I:C), для лучшего понимания процессов, происходящих при торможении роста меланомы B16-F10 под воздействием Poly(I:C).
Материалы и методы. С помощью проточной цитометрии исследовали иммунофенотип спленоцитов мышей C57BL/6: 1-я группа - контроль (интактные животные), 2-я группа - мыши с подкожно перевитой меланомой B16-F10, 3-я группа - мыши без опухоли, получавшие Poly(I:C), и 4-я группа - мыши с подкожно перевитой меланомой B16-F10, получавшие Poly(I:C).
Результаты. Медианы значений таких параметров, как иммунорегуляторный индекс CD4/CD8, количество CD69+ Т-клеток CD4+ и CD8+, количество В- и NK-клеток для группы мышей с меланомой, получавших Poly(I:C), находятся между значениями указанных параметров в контрольной группе и в группе мышей с B16-F10. При сравнении показателей количество В- и NK- клеток, количество CD69+ Т-клеток CD4+ и CD8+, их медианы в группе мышей с меланомой, получавших Poly(I:C), оказались ближе к контролю, чем к значениям, полученным в группе B16-F10 и в группе здоровых мышей, получивших Poly(I:C). В то же время нами обнаружено, что общее количество CD3+-клеток, количество наивных Т-клеток CD4+ и CD8+ выше в группе мышей с меланомой, получавших Poly(I:C), по сравнению со всеми остальными группами.
Заключение. Выявлены параметры иммунофенотипа клеток селезенки мышей (CD4/CD8, количество CD69+ Т-клеток CD4+ и CD8+, количество В- и NK-клеток), на которые влияют опухолевая нагрузка и/или введение адъюванта Poly(I:C). Изменения иммунофенотипа спленоцитов мышей связаны с наличием опухоли и ее размерами. Также обнаружено, что на иммунофенотип спленоцитов оказывает влияние многократное введение Poly(I:C) во время роста опухоли.
Ключевые слова: Poly(I:C), иммунофенотипирование, клетки селезенки, меланома В16^10
Для цитирования: Пономарев А.В., Рудакова А.А., Соколова З.А. и др. Влияние Poly(I:C) и меланомы B16-F10 на иммунофенотип клеток селезенки мышей. Российский биотерапевтический журнал 2021;20(4):51-8. DOI: 10.17650/1726-9784-2021-20-4-51-58.
Effect of Poly(I:C) and melanoma B16-F10 on the immunophenotype of murine spleen cells
Aleksandr V. Ponomarev, Anna A. Rudakova, Zinaida A. Sokolova, Maria A. Baryshnikova, Vyacheslav S. Kosorukov
N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Contacts: Aleksandr Vasilyevich Ponomarev kl8546@yandex.ru
Introduction. It is known that the agonist of TLR-3 PoLy(I:C), used as an adjuvant in a number of models of antitumor vaccines, causes inhibition of melanoma B16 growth, but the immunological aspects involved in this process have not been fully studied.
The aim of the study was to evaluate changes of the immunophenotype of the spleen cells of C57BL/6 mice caused by the tumor load and/or Poly(I:C), which is necessary for better understanding of the processes occurring during Poly(I:C) inhibition of melanoma B16-F10.
Materials and methods. The immunophenotype of splenocytes of C57BL/6 mice was studied by flow cytometry asfollowing: the group 1 was a control (intact animals), the group 2 was mice with subcutaneously transplanted melanoma B16-F10, the group 3 was mice without a tumor treated with Poly(I:C) and the group 4 - mice with subcutaneously transplanted melanoma B16-F10 treated with Poly(I:C).
Results. Median values of parameters such as the CD4/CD8 immunoregulatory index, the percentage of CD69+ CD4+ and CD8+ T cells, the number of B and NK cells for the group of mice with melanoma treated with Poly(I:C) were between the values in the control group and in the group of mice with B16-F10. When comparing the results, the number of B and NK cells, the percentage of CD69+ on CD4+ and CD8+ T cells, their median in the group of mice with melanoma treated with Poly(I:C) was closer to the control than to the values obtained in the B16-F10 group and in the group of healthy mice receiving Poly(I:C). At the same time, we found that the total number of CD3+ cells, the number of naive CD4+ and CD8+ T cells was higher in the group of mice with melanoma treated with Poly(I:C) compared to all other groups.
Conclusion. The analysis revealed the changes of the immunophenotype of murine spleen cells (CD4/CD8, the percentage of CD69+ CD4+ and CD8+ T cells, the number of B and NK cells), which were affected by the tumor load and/or the administration of Poly adjuvant (I:C). Changes in the immunophenotype of murine splenocytes were associated with the tumor load and its size. It was also found that the splenocyte immunophenotype was affected by the repeated administration of Poly(I:C) during the tumor growth.
Key words: Poly(I:C), immunophenotyping, spleen cells, melanoma B16-F10
For citation: Ponomarev A.V., Rudakova A.A., Sokolova Z.A. et al. Effect of Poly(I:C) and melanoma B16-F10 on the immunophenotype of murine spleen cells. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2021;20(4):51-8. (In Russ.). DOI: 10.17650/1726-9784-2021-20-4-51-58.
Введение
Применение терапевтических противоопухолевых вакцин — один из перспективных подходов к лечению злокачественных новообразований, который использует иммунную систему для распознавания и уничтожения опухолевых клеток. Важными компонентами, обеспечивающими эффективность противоопухолевых вакцин, являются адъюванты, которые усиливают иммуногенность вакцинных антигенов за счет стимуляции врожденного иммунного ответа, что приводит к развитию адаптивного иммунного ответа против опухоли. Одним из таких адъювантов является Poly(I:C) — полирибоинозино-вая-полирибоцитидиловая кислота (polyriboinosinic-polyribocytidylic acid), синтетический имитатор полимеров вирусной двуцепочечной РНК.
В литературе достаточно подробно описан феномен торможения роста меланомы мышей В16 под воздействием Poly(I:C) [1, 2]. Данное явление было отмечено и в нашем исследовании противоопухолевой эффективности модели противомеланомной неоантигенной вакцины [3]. Известно, что на опухолевых клетках меланомы B16 слабо экспрессируется молекула MHC класса I [4], поэтому вклад Т-клеток в замедление роста опухоли под влиянием Poly(I:C) не очень существенный [1]. В то же время значителен вклад NK-клеток. Это связано как с цитотоксической активностью NK-клеток [1], так и с выработкой NK-клетками интерферона у, который оказался способен напрямую ингибировать пролиферацию клеток меланомы B16 [2]. Чтобы лучше понимать иммунные процессы, происходящие при феномене торможения роста меланомы В16 под воздействием Poly(I:C), мы
изучили изменения иммунофенотипа клеток селезенки мышей.
Цель исследования — оценка изменений иммунофенотипа селезенки мышей С57ВЦ/ 6, вызванных опухолевой нагрузкой и/или Ро1у(1:С), для лучшего понимания процессов, происходящих при торможении роста меланомы В16^10 под воздействием Ро1у(1:С).
В работе оценивали такие иммунологические параметры, как количество CD4+- и CD8+-Т-клеток и отношение CD4/CD8 (иммунорегуляторный индекс) [5]. Также оценивали состояние дифференци-ровки CD4+- и CD8+-Т-клеток, которое определяется экспрессией CD44 и CD62L. Наивные CD8+-Т-клет-ки (Тп) имеют фенотип CD44- CD62L+. После инфицирования или иммунизации на антиген-активированных CD8+-Т-клетках повышается экспрессия CD44 и теряется CD62L, такие клетки становятся эффекторными Т-клетками (Тей). После разрешения инфекции популяция клеток CD8-Teff сокращается и начинают формироваться популяции клеток памяти. CD8+-T-клетки часто определяют как Т-клетки центральной памяти (Тст) CD44+CD62L+ и Т-клетки эффекторной памяти (Тет) CD44+CD62L-. Для CD4+-Т-клеток состояние дифференцировки определяется схожим образом, но с помощью проточной цитометрии отчетливо выделяются только 2 популяции — это Тп и Тет [6]. CD69 — ранний маркер активации лимфоцитов из-за его быстрого появления на поверхности плазматической мембраны после стимуляции [7]. В литературе отмечено, что CD69 связан с ингибированием противоопухолевого иммунного надзора [8]. Возможно, вклад в этот процесс
также вносит экспрессия CD69 на CD4+-T-KneTKax, обладающих регуляторными функциями [9]. NKp46 (CD335) принадлежит к семейству рецепторов естественной цитотоксичности. Его экспрессия ограничена NK-клетками и субпопуляцией NKT-клеток. NKp46 считается одним из маркеров NK-клеток мыши [10]. CD19 — член суперсемейства иммуноглобулинов. Он экспрессируется на предшественниках и зрелых В-клетках, является маркером В-клеток у мышей. Плазматические клетки не экспрессируют CD19. CD3 является маркером Т-клеток [6].
Материалы и методы
В исследовании использовали мышей-самцов C57BL/6 одного возраста массой 20—22 г, полученных из экспериментально-биологической лаборатории (вивария) ФГБУ «Национальный исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Животных разделили на 4 группы:
— 1-я группа (контроль) — интактные мыши (n = 6);
— 2-я группа — мыши с подкожно перевитой мела-номой B16-F10 (n = 5);
— 3-я группа — мыши без опухоли, которые получали Poly(I:C) (Sigma) подкожно в дозе 50 мкг в 300 мкл физиологического раствора 6-кратно с интервалом 3 сут (n = 5);
— 4-я группа — мыши с подкожно перевитой мелано-мой B16-F10, которые получали Poly(I:C) (Sigma) подкожно в дозе 50 мкг в 300 мкл физиологического раствора 6-кратно с интервалом 3 сут; 1-е введение Ро1у (I:C) было на 1-е сутки после перевивки опухоли (n = 6).
Мышам во 2-й и 4-й группах перевивали мелано-му B16-F10 подкожно по 75 тыс. клеток/мышь.
Через 19 дней после начала эксперимента мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации и забирали у них селезенку. Спленоциты осторожно выделяли из стромы органа с помощью отдельного стерильного стеклянного гомогенизатора, клеточную суспензию фильтровали через 8 слоев марли и центрифугировали при 1500 об /мин в течение 7 мин в фосфатно-солевом буфере, после чего еще раз фильтровали через стерильный одноразовый фильтр для очистки клеточной суспензии (Filcons, BD Biosciences) и подсчитывали количество клеток в камере Горяева. В полученной клеточной суспензии проводили гипотонический лизис эритроцитов, окрашивали клетки красителем жизнеспособности Fixable Viability Stain 510 (FVS510) (BD Biosciences) в соответствии с рекомендациями производителя, затем клетки отмывали и окрашивали антителами (табл. 1), инкубировали 30 мин в темноте, после чего отмывали в фос-фатно-солевом буфере. Подсчет проводили на проточном цитофлуориметре FACSCanto II с использованием программного обеспечения FACSDiva™
(Berton Dickinson). Погибшие клетки исключали из анализа по окрашиванию FVS510. Процент исследуемых клеток высчитывали от всех живых CD45+-кле-ток селезенки. Стратегия гейтирования представлена на рис. 1, 2.
Таблица 1. Антитела, применяемые в работе Table 1. Antibodies used in the work
Название Name Краситель Dye Клон Производитель Manufacturer
NKp46 (CD335) eFluor450 29A1.4 eBioscience
CD62L eFluor450 MEL-14 eBioscience
CD45 PerCP-Cy5.5 30-F11 Biolegend
CD4 PE-Cy7 GK1.5 Biolegend
CD44 APC-Cy7 IM7 Biolegend
CD8 PE 53-6.7 Biolegend
CD8 FITC 53-6.7 Biolegend
CD69 PE H1.2F3 Biolegend
CD19 FITC 6D5 Biolegend
CD3 PE 17A2 Biolegend
CD3 APC 17A2 Biolegend
I
Статистическая обработка полученных данных была выполнена с помощью программы Statistica 2.0 с использованием критерия Манна—Уитни. Различия считали статистически достоверными прир <0,05.
Результаты и обсуждение
В табл. 2 представлены результаты иммунофено-типирования спленоцитов мышей С57ВЦ/6.
При сравнении иммунофенотипа спленоцитов мышей 1-й (контрольной) группы и 2-й группы (с опухолью) обнаружен ряд отличий. Количество CD4+-Т-клеток значимо снижено во 2-й группе, при этом также понижен иммунорегуляторный индекс, что встречается при хронической антигенной стимуляции [5], но различие не является статистически значимым. Нами отмечено значимое повышение субпопуляции CD69-положительных CD4+- и CD8+-Т-клеток во 2-й группе по сравнению с контролем. В литературе имеются данные о повышении количества CD69-положительных CD4+-Т-клеток у мышей с опухолью В16 и отмечается, что это связано с им-муносупрессией [9]. Во 2-й группе нами отмечено значимое снижение количества наивных CD44-CD62L+ Т-клеток CD4+ и CD8+ по сравнению с контролем, что также может свидетельствовать о хронической антигенной стимуляции. Кроме того,
18Л 2/2С-10
1 В Л 2J2D-1 О
1 в/12/20-10
;г ■ | 1 | 1 1 ■ "it, г INI- , гипг, 9 10 J 10 10*
FVS510AmCyan-A
13/12/3010
ппп; I ИЩИ] I irrFK) i' li 10 10s CD 4 5 PE-Üyü-A
d>
9*>„
Q_ 2
Ql-f 3,6% Q2-?
_ ru ' fl 03-7 04-7
-в«
Ш ID
CD3 PE-A
10
К -»г.п I ■ г 11......'I 1 г и ни I "»""I i'
с ir 10 10s CD3 PE-A
■W9
Рис. 1. Стратегия гейтирования лейкоцитов селезенки мыши, пробирка 1. Из всех событий лейкоциты можно отличить по их свойствам FSC/SSC (гейт Р1). После гейтирования лейкоцитов дублеты исключаются дважды (Р2 и Р3) с последующим исключением мертвых клеток (Р4). Далее выделяются все CD45+-клетки (Р5) и уже из этого гейта проводятся дальнейшие измерения Т-, В-, NK-клеток
Fig. 1. Gating strategy of mouse spleen leukocytes, test tube 1. Of all the events, leukocytes can be distinguished by their FSC/SSC properties (gate P1). After the gating of leukocytes, doublets are excluded twice (P2 and P3), followed by the exclusion of dead cells (P4). Next, all CD45+ cells (P5) are isolated and further measurements of T-, B-, NK-cells are carried out from this gate
в группе с опухолью мы видим значимое повышение количества CD19+-В-клеток по сравнению с контролем. По данным литературы, не было отмечено значимой разницы для CD19+-В-клеток в селезенке здоровых мышей и с меланомой В16 [11]. Возможно, это расхождение связано с отличиями в количестве перевиваемых опухолевых клеток. В работе [11] отмечено значимое снижение CD3+-клеток в селезенке мышей с опухолью. Нами также отмечено снижение количества CD3+-клеток в группе с опухолью по сравнению с контролем, но данное снижение не было статистически значимым. По данным литературы, количество NK-клеток в селезенке мышей после введения меланомы В16 меняется с течением времени. S. Paul и соавт. обнаружили увеличение субпопуляции NK-клеток в селезенке на 5-й день после введения
В16 по сравнению с селезенкой интактной мыши и возвращение к исходным уровням, как и в селезенке интактной мыши, на 13-й день [12]. Нами обнаружено статистически значимое снижение количества NK-клеток в селезенке мышей с выраженной опухолью. G. Ьтогапи и соавт. также отметили существенное снижение количества NK-клеток в селезенке мышей с меланомой В16 [13].
При сравнении иммунофенотипа спленоцитов мышей контрольной группы и группы без опухоли, получавшей Ро1у(1:С) (3-я группа), показано отсутствие значимых различий для количества CD4+-и CD8+-Т-клеток и показателя CD4/CD8, при этом отмечается незначительное снижение иммуноре-гуляторного индекса после введения препарата (см. табл. 2). Нами отмечено статистически значимое
Рис. 2. Стратегия гейтирования лейкоцитов селезенки мыши, пробирка 2. Выделение CD45+-клеток и исключение мертвых клеток с дублетами, как описано на рис. 1. Далее выделяются CD4+-Т-клетки (Р6) и среди них определяются CD69+-клетки, а также Tn и Tem. Среди CDS^-Т-клеток (Р7) определяются CD69+-клетки, а также Tn, Tcm, Tem
Fig. 2. Gating strategy of mouse spleen leukocytes, test tube 2. The isolation of CD45+ cells and the exclusion of dead cells with doublets is similar to Fig. 1. Next, CD4+ T cells (P6) are isolated and CD69+ cells, as well as Tn and Tem are determined among them. CD69+ cells, as well as Tn, Tcm, and Tem are identified among CD8 T cells (P7)
повышение количества CD69-положительных CD4+-и CD8+-Т-клеток в 3-й группе по сравнению с контролем. Из литературы известно о способности Poly(I:C) индуцировать экспрессию CD69 на поверхности CD4+-Т-клеток [14]. Нами отмечено значимое повышение количества клеток CD4+-Tem и CD8+-Тст в 3-й группе по сравнению с контролем. В литературе есть данные, что введение мышам Ро1у(1:С) через 12 ч приводит к снижению количества Т-клеток памяти в селезенке [15], но показано, что через сутки или более Ро1у(1:С) стимулирует пролиферацию CD44+ CD8+-Т-клеток памяти [16]. Также есть данные, что через несколько дней процент CD8+-Т-клеток памяти в крови мышей начинает превышать значения нормы [17]. Нами не отмечено статистически значимых различий для параметров CD19 и CD3. При этом отмечено значимое снижение количества NK-клеток после воздействия Ро1у(1:С) по сравнению с контролем. Можно отметить, что количество NK-клеток в 3-й группе (Ро1у(1:С)) оказалось ниже, чем во всех остальных группах.
На основании сравнения изменений иммуно-фенотипа между контрольной группой и 2-й или 3-й группами (для некоторых из них найдены подтверждения и обоснования в литературе) мы проанализировали результаты, полученные в 4-й группе, в которой мышам перевивали меланому и вводили Ро1у(1:С). Данные, приведенные в табл. 2, показывают, что медианы таких параметров, как CD4/CD8, количество CD69-положиIельных Т-клеток СМ+ и CD8+, CD19, N^46, для 4-й группы находятся между значениями медиан группы контроля и 2-й группы (В16^10). Это может свидетельствовать о торможении роста опухоли под воздействием адъюванта Ро1у(1:С). В 4-й группе к окончанию эксперимента у 3 мышей не выросли опухоли, а у остальных имели объем не более 0,5 см3, тогда как у мышей во 2-й группе опухоли достигали объема 1 см3 (рис. 3). Вероятно, опухоль меньших размеров оказывает более слабое влияние на иммунологические параметры.
Если сравнить показатели CD4/ CD8, количество CD69-положительных Т-клеток CD4+ и CD8+,
Таблица 2. Субпопуляции исследуемых клеток, медиана (min—max), % Table 2. Subpopulations of the investigated cells, median (min—max), %
Антигены 1-я группа (контроль) 2-я группа (B16-F10) 3-я группа (Poly(I:C)) Group 3 (Poly(I:C)) 4-я группа (В16^10 + Poly(I:C)) Group 4 (В16-Е10 + Poly(I:C))
CD4 18,9 (17-21,8) 14,9* (11,8-18,8) 16,8 (11,8-19,2) 19 7**, *** (17,1-21,1)
CD8 10,1 (8,7-11,4) 9,2 (8,1-11,6) 9,3 (9-12) 12,25*, **, *** (9,8-13,2)
CD4/CD8 1,89 (1,73-2,11) 1,51 (1,28-2,04) 1,78 (0,98-2,06) 1,67* (1,43-1,84)
CD69 на CD4 CD69 on CD4 12,1 (10,7-14,9) 16,2* (14,2-23,2) 17,3* (15-19,9) 13,9**, *** (10,5-15,7)
CD69 на CD8 CD69 on CD8 4,5 (4-5,3) 6,2* (5,3-7,5) 6,6* (5,6-11,5) 5,15*** (4,3-6,8)
Tn от CD4 Tn from CD4 55 (50,9-55,8) 49,3* (38,3-54,1) 51,8 (46,4-53,6) 61 35*, **, *** (57,5-65,4)
Tem от CD4 Tem from CD4 34,9 (34,2-38,8) 37,6 (35,9-51,5) 39,6* (38-43,9) 28,6*, **, *** (25,7-32,7)
Tn от CD8 Tn from CD8 41,55 (36,5-43,5) 35* (27,8-40) 39,6 (33,8-42,6) 44,05*, **, *** (42,2-53,4)
Tem от CD8 Tem from CD8 16,45 (14,6-22) 20,7 (13,1-25,1) 16 (15-18,5) 10,85*, **, *** (9,2-14,2)
Tcm от CD8 Tcm from CD8 38,1 (35,1-40,2) 41,5 (35-47,5) 40,3* (37,9-48,2) 39,7 (33,3-41,8)
CD19 51,5 (49,5-53,9) 55 7* (54,7-57,7) 54,4 (49,4-56,5) 52,3** (44,3-56,1)
CD3 32,75 (29,9-38,3) 30 (26,6-32,7) 30,2 (28,4-34,2) 36,2**, *** (31,2-38,8)
NK (NKp46) 3,35 (2,9-4,4) 2,8* (2,8-3,2) 2,7* (2,2-2,9) 2,95* (1,9-3,2)
*Различия показателей по сравнению с 1-й группой (контроль) статистически значимы (р <0,05); **различия показателей по сравнению со 2-й группой (B16-F10) статистически значимы (р <0,05); ***различия показателей по сравнению с 3-й группой (Poly (I:C)) статистически значимы (р <0,05).
*Differences in indicators compared to the group 1 (control) are statistically significant (р <0.05); **differences in indicators compared to the group 2 (B16-F10) are statistically significant (p <0.05); ***differences in indicators compared to the group 3 (Poly (I:C)) are statistically significant (p <0.05).
процент Тп от CD4+ и CD8+, то можно отметить, что в 3-й группе (Ро1у(1:С)) они выше, чем во 2-й группе (В16^10). В связи с этим можно предположить, что Ро1у(1:С) оказывал более сильное влияние на актива-ционный маркер CD69 по сравнению с воздействием, оказываемым опухолью. Но при этом не было такой антигенной стимуляции, как в случае опухоли, и процент Тп остался более высоким, чем в группе с опухолью.
Для 4-й группы (В16 + Ро1у(1:С)) вычисленное значение иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 находится между более высоким значением — в 3-й группе (Ро1у(1:С)) и более низким значением — во 2-й группе (В16^10) (см. табл. 2). Это может свидетельствовать о том, что меньший размер опухоли вызывает более слабую антигенную нагрузку и иммунорегуляторный индекс не понижается до значений 2-й группы за счет
влияния Ро1у(1:С). В 4-й группе количество CD19+-В-клеток и CD69-положительных Т-клеток ниже, чем в 3-й группе и во 2-й группе, но выше, чем в контрольной группе. То есть данные значения ближе к нормальным, чем в группе с опухолью и в группе с Ро1у(1:С). Количество NK-клеток в 4-й группе также оказалось ближе к контролю, чем в группе с опухолью и в группе с Ро1у(1:С). Такое приближение указанных выше параметров в 4-й группе к значениям в контрольной группе можно попытаться объяснить тем, что иммуноактиви-рующее влияние Ро1у(1:С) ослабевает под воздействием опухоли, за счет чего, например, становится меньше CD69-положительных Т-клеток. Но так как опухолевая нагрузка слабее, то и показатели становятся ближе к нормальным. В то же время нами обнаружено, что в 4-й группе общее количество CD3+-клеток и ко-
л
о
&
е
fi
о О
15GG '
1GGG ■
5GG ■
B16-F10
B16-F10 + Poly (I:C)
12
15
1S
Сутки после трансплантации / Day after transplantation
Рис. 3. Рост меланомы у мышей во 2-й группе (В16-F10 без препарата) и 4-й группе (В^-FW с Poly (I:C))
Fig. 3. Melanoma growth in mice in group 2 (B16-F10 without the drug) andgroup 4 (B16-F10 with Poly (I:C))
личество Tn CD4+ и CD8+ оказалось выше, чем в остальных группах. Этот результат является достаточно необычным. Можно предположить, что повышение количества Tn под действием Poly(I:C) может дать преимущество в борьбе иммунитета против Т-зависимых опухолей, иммунный надзор за которыми в большей степени осуществляется Т-клетками. Меланома В16, как известно, является NK-зависимой опухолью [1]. Например, имеются данные, что Poly(I:C) способствовал усилению местного Т-клеточного ответа на мышиной модели опухоли 4T1-Luc [18].
Заключение
При изучении влияния опухолевой нагрузки клетками меланомы В16^10, а также 6-кратного введения адъюванта Ро1у(1:С) в сочетании с опухолевой нагрузкой и без нее на иммунофенотип спле-ноцитов мышей выявлен ряд отличий, которые оказались статистически значимы, и часть из которых также подтверждается данными литературы. В группе мышей с меланомой В16^10, получавших Ро1у(1:С), обнаружен ряд параметров, медиана которых оказалась в промежутке между значениями для групп контроля и В16^10, не получавшей Ро1у(1:С). Можно предположить, что опухоль меньших размеров оказывает более слабое влияние на эти иммунологические параметры. В группе мышей с меланомой В16^10, получавших Ро1у(1:С), кроме того, обнаружен ряд параметров, медиана которых оказалась ближе к контролю, чем к значениям во 2-й группе (В16^10) и в группе здоровых мышей, получавших Ро1у(1:С). Вероятно, иммуноактивирующее влияние Ро1у(1:С) ослабевает под воздействием опухоли, но так как опухолевая нагрузка меньше в 4-й группе, то и показатели становятся ближе к нормальным. Обнаружен необычный результат — общее количество CD3+-клеток и количество наивных Т-клеток CD4+ и CD8+ в группе с меланомой В16^10, получавших Ро1у(1:С), выше по сравнению с остальными тремя группами, что может дать преимущество в борьбе иммунитета против Т-зависимых опухолей.
G
G
3
б
9
Л И Т Е Р А Т
1. Akazawa T., Ebihara T., Okuno M. et al. Antitumor NK activation induced
by the Toll-like receptor 3-TICAM-1 (TRIF) pathway in myeloid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104(1):252-7. DOI: 10.1073/pnas.0605978104.
2. Shime H., Kojima A., Maruyama A. et al. Myeloid-derived suppressor cells confer tumor-suppressive functions on natural killer cells via polyinosinic: polycytidylic acid treatment in mouse tumor models. J Innate Immun 2014;6(3):293-305.
DOI: 10.1159/000355126.
3. Барышникова М.А., Рудакова А.А., Соколова З.С. и др. Оценка противоопухолевой эффективности синтетических неоантигенных пептидов для модели противомеланомной вакцины. Российский биотерапевтический журнал 2019;18(4):76-81. [Baryshnikova M.A., Rudakova A.A.,
УРА I R E F E
Sokolova Z.A. et al. Evaluation of the antitumor efficacy of synthetic neoantigen peptides for the melanoma vaccine model. Rossiyskiy bioterapev-ticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2019;18(4):76-81. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/1726-97842019-18-4-76-81.
4. Seliger B., Wollscheid U., Momburg F. et al. Characterization of the major histocompatibility complex class I deficiencies in B16 melanoma cells. Cancer Res 2001;61(3):1095-9. PMID: 11221838.
5. Myrick C., DiGuisto R., DeWolfe J. et al. Linkage analysis of variations in CD4:CD8 T cell subsets between C57BL/6 and DBA/2. Genes Immun 2002;3(3):144-50.
DOI: 10.1038/sj.gene.6363819.
6. Cossarizza A., Chang H-D., Radbruch A. et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting
R E N C E S
in immunological studies (second edition). Eur J Immunol 2019;49(10):1457-1973. DOI: 10.1002/eji.201970107.
7. Cibrián D., Sánchez-Madrid F. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur J Immunol 2017; 47(6): 946-53. DOI: 10.1002/eji.201646837.
8. Esplugues E., Sancho D., Vega-Ramos J. et al. Enhanced antitumor immunity
in mice deficient in CD69. J Exp Med
2003;197(9):1093-106.
DOI: 10.1084/jem.20021337.
9. Han Y., Guo Q., Zhang M. et al. CD69+ CD4+ CD25- T cells, a new subset
of regulatory T cells, suppress T cell proliferation through membrane-bound TGF-beta 1. J Immunol 2009;182(1):111-20. DOI: 10.4049/jimmunol.182.1.111. 10. Walzer T., Blery M., Chaix J. et al. Identification, activation, and selective in vivo ablation of mouse NK cells via
NKp46. Proc Natl Acad Sci U S A
2007;104(9):3384-9.
DOI: 10.1073/pnas.0609692104.
11. Kamran N., Li Y., Sierra M. et al. Melanoma induced immunosuppression is mediated by hematopoietic dysregula-tion. Oncoimmunology 2017;7(3):e1408750. DOI: 10.1080/2162402X.2017.1408750.
12. Paul S., Kulkarni N., Shilpi, Lal G. Intratumoral natural killer cells show reduced effector and cytolytic properties and control the differentiation of effector Th1 cells. Oncoimmunology 2016;5(12):e1235106.
DOI: 10.1080/2162402X.2016.1235106.
13. Isvoranu G., Surcel M., Huica R. et al. Natural killer cell monitoring
in cutaneous melanoma — new dynamic biomarker. Oncol Lett 2019;17(5):4197-206. DOI: 10.3892/ol.2019.10069.
14. Radulovic K., Manta C., Rossini V. et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol 2012;188(4):2001-13. DOI: 10.4049/jimmunol.1100765.
15. Bahl K., Huebner A., Davis R., Welsh R. Analysis of apoptosis of memory T cells and dendritic cells during the early stages of viral infection or exposure to toll-like receptor agonists. J Virol 2010;84(10): 4866-77. DOI: 10.1128/JVI.02571-09.
16. Tough D., Borrow P., Sprent J. Induction of bystander T cell proliferation by
viruses and type I interferon in vivo. Science 1996;272(5270): 1947-50. DOI: 10.1126/science.272.5270. 1947.
17. Koschella M., Voehringer D.,
Pircher H. CD40 ligation in vivo induces bystander proliferation of memory phenotype CD8 T cells. J Immunol 2004;172(8):4804-11. DOI: 10.4049/jimmunol.172.8.4804.
18. Forghani P., Waller E. Poly(I:C) modulates the immunosuppressive activity of myeloid-derived suppressor cells in a murine model of breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2015;153(1):21-30.
DOI: 10.1007/s10549-015-3508-y.
Вклад авторов
А.В. Пономарев, М.А. Барышникова: концепция и дизайн, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация данных, написание текста рукописи, редактирование рукописи;
A.А. Рудакова: предоставление материалов исследования, сбор и обработка данных, редактирование рукописи;
З.А. Соколова: предоставление материалов исследования, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация данных, редактирование рукописи;
B.С. Косоруков: концепция и дизайн, редактирование рукописи. Author's contributions:
A.V. Ponomarev, M.A. Baryshnikova: concept and design, data analysis and interpretation, article writing the text of the manuscript, editing of the article;
A.A. Rudakova: provision of study materials, data collection and processing, editing of the article;
Z.A. Sokolova: provision of study materials, data collection and processing, data analysis and interpretation, editing of the article; V.S. Kosorukov: concept and design, editing of the article.
ORCID авторов / ORCID of authors
А.В. Пономарев / A.V. Ponomarev: https://orcid.org/0000-0001-9517-8183
A.А. Рудакова / A.A. Rudakova: https://orcid.org/0000-0001-7266-7689 З.А. Соколова / Z.A. Sokolova: https://orcid.org/0000-0003-4755-5313
М.А. Барышникова / M.A. Baryshnikova: https://orcid.org/0000-0002-6688-8423
B.С. Косоруков / V.S. Kosorukov: https://orcid.org/0000-0002-8462-2178
Конфликт интересов. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения России в рамках исследования № АААА-А20-120022090056-5.
Financing. The study was carried out with the financial support of the Ministry of Health of Russia in the framework of the research No ААА-А-А20-120022090056-5.
Соблюдение правил биоэтики. Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей. Statement of the welfare of animals. The study was carried out in accordance with the ethical standards for the treatment of animals adopted by the European Convention for the Protection of Vertebrates Used for Research and Other Scientific Purposes.
Статья поступила: 05.08.2021. Принята к публикации: 01.10.2021. Article received: 05.08.2021. Accepted for publication: 01.10.2021.
