CC BY
25
ОЦЕНКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ НЕОАНТИГЕННЫХ ПЕПТИДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МОДЕЛИ ПРОТИВОМЕЛАНОМНОЙ ВАКЦИНЫ
М.А. Барышникова, А.А. Рудакова, З.С. Соколова, О.С. Бурова, Е.Н. Кособокова, В.С. Косоруков
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Мария Анатольевна Барышникова [email protected]
Введение. Персонализированная вакцинотерапия, направленная на усиление распознавания иммунной системой мутантных неоантигенов опухоли, является перспективным подходом к лечению некоторых видов злокачественных новообразований. Цель исследования — оценка иммуногенности и противоопухолевой эффективности синтетических неоантигенных пептидов и адъюванта Poly(I:C) на модели мышиной меланомы B16F10.
Материалы и методы. Исследовали 43 мутантных неоантигенных синтетических пептида, ранее отобранных в качестве иммуногенных на основе результатов секвенирования меланомы B16F10 с помощью биоинформатического анализа. Исследование проводили на мышах C57Bl/6Jс подкожно перевитой меланомой В16F10 после 2-кратной вакцинации группами пептидов с адъювантом Poly(I:C) и без него. Оценку иммуногенности пептидов проводили методом ELISpot по определению количества клеток, продуцирующих интерферон у (ИФН-у). Противоопухолевую активность оценивали по торможению роста опухоли и увеличению продолжительности жизни мышей.
Результаты. Количество ИФН-у-продуцирующих клеток селезенки мышей, ранее иммунизированных группами пептидов в сочетании с адъювантом, в ответ на in vitro-стимуляцию пептидами, входившими в состав модельной вакцины, увеличивалось. В группах мышей, иммунизированных пептидами без адъюванта, количество ИФН-у-продуцирующих клеток in vitro не менялось по сравнению с группой контроля как при добавлении пептидов, входивших в состав вакцины, так и при добавлении пептидов из других групп. Двукратная вакцинация пептидами с адъювантом вызывала в ряде случаев выраженный противоопухолевый эффект: 3 из исследованных 8 групп пептидов с адъювантом вызывали значимое торможение роста опухоли и увеличение продолжительности жизни мышей.
Выводы. Таким образом, показано, что вакцинация мышей пептидами в сочетании с адъювантом Poly(I:C) вызывает специфическую стимуляцию клеточного иммунного ответа во всех исследованных группах, однако увеличение количества ИФН-у-продуцирующих клеток не является показателем противоопухолевой эффективности.
Ключевые слова: неоантиген, меланома, синтетические пептиды, противоопухолевая вакцина
DOI: 10.17650/1726-9784-2019-18-4-76-81
EVALUATION OF THE ANTITUMOR EFFICACY OF SYNTHETIC NEOANTIGEN PEPTIDES FOR THE MELANOMA VACCINE MODEL
M.A. Baryshnikova, A.A. Rudakova, Z.A. Sokolova, O.S. Burova, E.N. Kosobokova, V.S. Kosorukov
N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation;
24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115478, Russia
Introduction. Personalized vaccine therapy that stimulates immune system to recognize mutant tumor neoantigens is one of the promising approaches of cancer treatment.
Objective. Evaluation of immunogenicity and antitumor efficacy of synthetic neoantigen peptides and Poly(I:C) adjuvant against murine melanoma B16F10.
Materials and methods. 43 synthetic mutant neoantigen peptides selected earlier according to the bioinformatics analysis of the results of melanoma B16F10 sequencing were investigated. The study was performed in mice C57Bl/6J with subcutaneously transplanted melanoma B16F10 after double vaccination by peptide groups with or without adjuvant poly(I:C). Immunogenicity of peptides was evaluated by ELISPOT that detected the number of interferon-gamma producing cells. Antitumor activity was evaluated on the base of tumor growth inhibition and the increase of the survival rate.
Results. The number of interferon-gamma producing cells increased after in vitro stimulation by the peptides of the model vaccine in the group of mice which had been vaccinated by these peptides with the adjuvant. The number of interferon-gamma producing cells in vitro did not change after addition of vaccine peptides or any other peptides in the groups of mice that had been vaccinated by the peptides without the adjuvant as compared to the control group. Double vaccination by the peptides with the adjuvant induced a potent antitumor effect in some
Оригинальные статьи 77
cases, three of the eight groups of the peptides with the adjuvant induced significant inhibition of tumor growth and the increase of survival rate in mice. Conclusion. Thereby, it was shown that vaccination of mice by peptides in combination with adjuvant poly(I:C) stimulated the cell immunity response, however, the increase of the number of interferon-gamma producing cells is not an indicator of the antitumor efficacy of neoantigen peptides. Key words: neoantigens, melanoma, synthetic peptides, antitumor vaccine Введение животных Национального медицинского исследова-Одним из новых эффективных эксперименталь- тельского центра онкологии им. Н.Н. Блохина. В ка-ных подходов к иммунотерапии опухолей является ждой группе было 8 мышей. Исследуемые модели персонализированная вакцинотерапия, направленная вакцин вводили подкожно (в складку кожи на левом на усиление распознавания иммунной системой му- боку мыши по направлению к передней лапке). тантных неоантигенов опухоли [1]. Персонализиро- В группах «пептиды с адъювантом» poly(I:C) вводили ванные противоопухолевые вакцины создаются подкожно за 5 мин до введения пептидов в то же са-из химически синтезированных опухолевых неоан- мое место (складку кожи на левом боку). Иммуниза-тигенных пептидов, отобранных в результате биоин- ция проводилась в 0-й и 7-й дни. форматического прогнозирования иммуногенности, На 12-й день после 1-й инъекции 3 мышей из каи адъюванта [2, 3]. ждой группы забивали, извлекали сыворотку и спле-В нашей предыдущей работе с помощью разра- ноциты для иммунологических тестов. Оставшимся ботанного биоинформатического подхода для ана- 5 мышам из каждой группы на 12-й день в правый лиза данных секвенирования нового поколения были бок перевивали по 75 тыс. клеток меланомы мыши предсказаны пептиды, способные вызывать иммун- линии B16F10 в 500 мкл среды 199. ный ответ на модели мышиной меланомы B16F10 [4]. Иммуногенность пептидов с адъювантом, пепти-Цель настоящего исследования — оценка имму- дов без адъюванта и адъюванта оценивали по опре-ногенности и противоопухолевой эффективности делению количества клеток, продуцирующих ин-синтетических неоантигенных пептидов и адъюван- терферон у (ИФН-у), методом ELISpot согласно та Poly(I:C) на модели мышиной меланомы B16F10. инструкции к набору для определения мышиного INF-y (3321-2AW-Plus, Mabtech). Клетки селезенки Материалы и методы мышей инкубировали 48 ч с группами пептидов, ко-По результатам биоинформатического анализа торыми до этого иммунизировали. В качестве поло-были синтезированы 43 пептида длиной от 22 жительного контроля использовали адъювант Poly(I:C), до 30 аминокислот (табл. 1) [4]. Пептиды были оха- он неспецифически увеличивал число клеток, про-рактеризованы методом высокоэффективной жид- дуцирующих ИФН-у. Для подтверждения специфич-костной хроматографии и масс-спектрометрически, ности клеточного иммунного ответа в одну лунку степень чистоты каждого пептида после очистки с клетками селезенки мышей, иммунизированных с помощью высокоэффективной жидкостной хрома- одной группой пептидов, добавляли пептиды этой груп-тографии составила не менее 85 %. пы, а в другую лунку — пептиды другой группы, которую Для оценки противоопухолевого эффекта пепти- не использовали для иммунизации этой мыши. ды разделили на группы, каждая из которых включа- Критериями оценки противоопухолевого эффек-ла 5 или 6 пептидов (табл. 2). Пептиды растворяли та служили торможение роста опухоли (ТРО) и уве-в физиологическом растворе (ПанЭко) или диметил- личение продолжительности жизни (УПЖ) подопыт-сульфоксиде (ДМСО) (ПанЭко) до концентрации ных мышей по сравнению с животными контрольной 10 мг/мл, мышам вводили по 100 мкг каждого пепти- группы. Путем измерений длины, ширины и высоты да из группы, — таким образом, суммарно 1 доза опухолевого узла вычисляли объем (V) опухоли у каж-включала в себя 500 или 600 мкг пептидов в физио- дого животного, а затем — средний объем опухоли логическом растворе или 10 % растворе ДМСО. в группе. Объем опухолей измеряли 2—3 раза в неделю. Исследовали эффективность пептидов, введенных Торможение роста опухоли вычисляли по формуле: с адъювантом (Poly(I: C) (Sigma) — 50 мкг на мышь в 200 мкл физраствора) и без адъюванта, а также адъ- ТРО (%) = ((V — V) : V) х 100, юванта без пептидов. В контрольной группе мыши не получали никакого воздействия. где V — средний объем опухолей в контрольной груп-Иммунизировали мышей линии C57B1/ 6J массой пе (мм3), V — средний объем опухолей в подопытной 20—22 г, полученных из отделения лабораторных группе (мм3).
4'2019 ТОМ 18 | vol. 18 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
Таблица 1. Перечень исследуемых синтетических пептидов Table 1. List of investigated synthetic peptides
№ Название Последовательность
1 g. 6393021C>G S S G H V G F I F K S G K M T S I V K D S S A A R N G
2 g. 109894747T>G P I T A H M Y E A V A L I K D H T L V N S L I R V L Q
3 g. 60246193G>T F M F S L P N I T Y S V I E K K R N F L R W K T W L E
4 g. 56226589G>T G G L A G P D G T K S V F G Q M F A K M S S F S P D S
5 g. 54847269G>T P E A K Y D A F L V T N M V Q M Y P A F K R V W T Y F
6 g. 145123749C>T W A P N E N K F A V G S G F R V I S I C Y F E Q E N D
7 g. 64957410G>C G T V F I S Q D T V E S L L A A A N L L Q I K L V L K
8 g. 108075690C>A L S E N I S H G L L L R K A P V L H Y L Y Y L A Q I G
9 g. 155991934C>A L V H Y L R L S L E Y L R A W H S E D V S L G T W L A
10 g. 69027878G>A S G G G S K V M R G R M G S S V I N E I S V E E V N K
11 g. 77174891A>C D A L Q E Y S H N S F A L Q C L L N S F P G D L E F K
12 g. 66708664A>C M R M L Q N S D T L L S H M A A K C L A S L L Y F Q L
13 g. 110327865C>T T L H N M M K K F F L Q L I A E F K R L G S S V V Y A
14 g. 106886296T>A T V Y T M Y F P F C M S Q E F R H L L C E I L P L L K
15 g. 5098048A>C V H M A A R I I A T L A A W G K E L M E G S D L N Y Y
16 g. 69615465A>T A W H T N L S R K I L R M S P L L A K F H Q F L V S E
17 g. 65813948T>A G S P F P A A V I L R D A L H M A R G L K Y L H Q E K
18 g. 108814677G>C M Q T D T Q D H Q N L C Y S A L V L A M V F S M G E A
19 g. 116820833G>C A G Y R G S F L A G F R P L P C T P G P G W V S H V D
20 g. 45553003G>T A L L Y F T G S A N F N R S M R A L A K T K G M S L S
21 g. 58476516A>C R V D Q K T L H N L L R K V V P S F S A E I E R L N Q
22 g. 35197173T>G V Q G L L K D A T G S F V L P F R H V M Y A P Y P T T
23 g. 105559136C>T A S L S E A V Q A A Y M L R Y Q K C L D A R S Q T S T
24 g. 126439132G>T F N I T A D P Y E R V D L S S M Y P G I V K K L L R R
25 g. 101573665C>G G R I S G I G S A F G S R S L Y N L G G T R R V S I G
26 g. 140328678C>G T F L C P A D V T D P T T F Q K I L E L L P S R R A D
27 g. 121734550T>C Y T E T P E K I R L H L Y H L N E T V T I T A S L V S
28 g. 190937554G>A R N V D S T C E D R E D K F N F S V M S Y N I L S Q D
29 g. 153509426A>T L L L A M R L V N E A T F P L LL N C F G Q P K T K W
30 g. 142664440A>G P S Q V T E M F N Q G R A F A A V R L P F C G H K N I
31 g. 81419559T>A K I T T I P F T T E V F A P V T E T V T V S A I P
32 g. 24108965G>C N E E G I E E L V V A L T C V G G W Q A P L N Q N W V
33 PSKPSFQE P S K P S F Q E F V D W E N V S P E L N S T D Q P F L
34 REGVELCPG R E G V E L C P G N K Y E M R R H G T T H S LV I H D
35 g. 28894578A>C S G L V T F Q A F I D V M S R E T T D T D T A D Q V I
36 g. 29565843C>G V D R N P Q F L D P V L A Y L M K G L C E K P L A S A
37 g. 65813948T>A G S P F P A A V I L R D A L H M A R G L K Y L H Q E K
38 g. 41232378A>G P A M V C G T A F F I N F I A I Y H H A S R A I P F G
39 g. 4007844T>G W I P S G T T I L N C F H D V L S G K L S G G S P G V
40 g. 123421534G>C F R R K A F L H W Y T G E A M D E M E F T E A E S N M
41 g. 107599034A>C L R R L V L H V V S A A Q A E R L A R A E E A A A P A
42 g. 93352588T>C R N I E G I D K L T Q L K K P F L V N N K I N K I E N
43 GFSQPLRRL G F S Q P L R R L V L H V V S A A Q A E R L A R A E E
Оригинальные статьи
79
Таблица 2. Группы пептидов, сформированные для введения животным Table 2. Peptide groups formed for administration to animals
Группы пептидов Peptide groups
1 2 3 4 5 6 7 8
g. 116820833 g. 110327865 g. 123421534 g. 107599034 g. 65813948 g. 10559136 g. 101573665 g. 155991934
g. 140328678 g. 126439132 g.130452479 g. 108075690 g. 69615465 g. 106886296 g.190937554 g. 41232378
g. 142664440 g. 4007844 g. 28894578 g. 109894747 g. 69027878 g. 108814677 g. 60246193 g. 54847269
g. 145123749 g. 6393021 g. 4553003 g. 29565843 g. 93352588 g. 121734550 g. 7163330 g. 58476516
g. 35197173 g. 64957410 g. 5098048 g. 56226589 REGVELCPG g. 153509426 g. 77174891 g. 66708664
GFSQPLRRL PSKPSFQE g. 81419559
Физраствор Saline solution Физраствор Saline solution Физраствор Saline solution Физраствор Saline solution Физраствор Saline solution ДМСО DMSO ДМСО DMSO ДМСО DMSO
Количество продуцирующих интерферон у клеток селезенки мышей, ранее иммунизированных пептидами с адъювантом, после стимуляции пептидами in vitro: а, б — стимуляция пептидами, входившими в состав вакцины, вызывает увеличение числа клеток, продуцирующих интерферон у; в, г — стимуляция пептидами, не входившими в состав вакцины, не вызывает увеличения числа клеток, продуцирующих интерферон у
The number of interferon-y-producing spleen cells of mice, which were immunized by the peptides with the adjuvant, after in vitro stimulation by the peptides: а, б — increase in the number of interferon у producing cells after in vitro stimulation by the peptides, which were part of the vaccine; в, г — no increase in the number of interferon у producing cells after in vitro stimulation by the peptides, which were not part of the vaccine
Увеличение продолжительности жизни вычисляли после гибели всех животных в ходе опыта по формуле:
УПЖ (%) = ((СПЖо - СПЖк) : СПЖк) х 100,
где СПЖк — средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе (дни), СПЖо — средняя продолжительность жизни животных в подопытной группе (дни).
Минимальные критерии противоопухолевой активности: ТРО >50 %, УПЖ >50 %.
Статистическая обработка полученных данных была выполнена с помощью программы Statistica 2.0 с использованием критерия Манна—Уитни. Параметры увеличения продолжительности жизни анализировали с помощью логрангового критерия. Различия считались статистически достоверными прир <0,05.
Результаты
Количество ИФН-у-продуцирующих клеток селезенки мышей, ранее иммунизированных группами пептидов в сочетании с адъювантом, в ответ на in vitro -стимуляцию пептидами, входившими в состав модельной вакцины, увеличивалось. Тогда как при добавлении в лунки с клетками этих мышей пептидов из других групп, не входивших в состав модельной вакцины, количество ИФН-у-продуцирующих клеток оставалось таким же, как в группе контроля (см. рисунок).
В группах мышей, иммунизированных пептидами без адъюванта, количество ИФН-у-продуцирую-щих клеток in vitro не менялось по сравнению с группой контроля как при добавлении пептидов, входивших в состав вакцины, так и при добавлении пептидов из других групп.
Таким образом, показано, что вакцинация мышей пептидами в сочетании с адъювантом Poly(I:C)
Торможение роста опухоли, % Увеличение продолжительности жизни, %
Группы пептидов Peptide groups Сутки
Increase of survival rate, %
18 23 27 32
Poly (I:C) 67 7 0 0 27
1 0 0 0 0 7
2 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
4 16 0 0 0 3
5 82 34 0 0 18
6 100 91 71 26 19
7 88 68 35 25 58
8 37 20 0 0 14
1 + Poly (I: C) 64 0 0 0 10
2 + Poly (I: C) 0 0 0 0 3
3 + Poly (I: C) 0 0 00 0 0
4 + Poly (I: C) 100* 100* 98* 71* 60*
5 + Poly (I: C) 95 76* 69* 34 40
6 + Poly (I: C) 95* 40* 44 0 35
7 + Poly (I: C) 100* 100* 97* 92* 67* 2 из 5 мышей живы >90 дней
8 + Poly (I: C) 97 69 62 52 67*
*p <0,05по отношению к контролю. *p <0,05 in relation to control.
Таблица 3. Противоопухолевый эффект моделей пептидной вакцины Table 3. Antitumor efficacy of peptide vaccine models
вызывает специфическую стимуляцию клеточного иммунного ответа.
Результаты оценки противоопухолевого эффекта исследуемых моделей вакцины после 2-кратной вакцинации представлены в табл. 3.
Из табл. 3 видно, что пептиды групп 1—3 не обладали противоопухолевым эффектом, возможно, это связано с недостаточной растворимостью их в физрастворе и, как следствие, сниженной биодоступностью.
Эффект пептидов значительно усиливался при использовании адъюванта Ро1у(1:С), самого по себе обладающего противоопухолевой активностью, но менее выраженной, чем при комбинации с пептидами.
Модель вакцины 7 + Ро1у(1:С) обладает выраженным противоопухолевым эффектом. «Пептиды 7» без адъюванта, в отличие от других групп пептидов без
адъювантов, у которых эффект незначительный или отсутствует, увеличивали продолжительность жизни мышей примерно на 58 %.
Заключение
Вакцинация мышей синтетическими неоантигенными пептидами в сочетании с адъювантом Poly (I:C) вызывает стимуляцию клеточного иммунного ответа, выражающуюся в увеличении количества ИФН-у-продуцирующих клеток селезенки. Однако не во всех случаях наблюдаемая стимуляция клеточного иммунитета приводила к развитию противоопухолевого ответа. Пептиды, проявившие выраженную противоопухолевую эффективность, будут использованы как модель для более углубленного изучения персонализированной пептидной неоантигенной вакцины против меланомы B16F10.
Оригинальные статьи
1. Барышникова М.А., Кособокова Е.Н., Косоруков В.С. Неоантигены в иммунотерапии опухолей. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(2):6—14. DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-2-6-14. [Baryshnikova M.A., Kosobokova E.N., Kosorukov V.S. Neoantigens in tumor immunotherapy Rossiysky bioterapev-tichesky zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(2):6—14. (In Russ.)].
4. Косоруков В.С., Барышникова М.А., Кособокова Е.Н. и др. Выявление им-
2. Castle J.C., Kreiter S., Diekmann J. et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 2012;72(5):1081-90. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-11-3722.
3. Ott P.A., Hu Z., Keskin D.B. et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature 2017;547(7662):217-21. DOI: 10.1038/nature22991.
муногенных мутантных неоантигенов в геноме меланомы мышей. Российский биотерапевтический журнал 2019;18(3):23-30. DOI: 10.17650/17269784-2019-18-3-23-30. [Kosorukov V.S., Baryshnikova M.A., Kosobokova E.N. et al. Identification of immunogenic mutant neoantigens in the genome of murine melanoma Rossiysky bioterapevtichesky zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2019;18(3):23-30. (In Russ.)].
Вклад авторов
М.А. Барышникова: концепция и дизайн, сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных, подготовка рукописи;
A.А. Рудакова: предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных, редактирование статьи; З.А. Соколова: предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных, редактирование статьи; О.С. Бурова: предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных, редактирование статьи; Е.Н. Кособокова: сбор и обработка данных, анализ и интерпретация данных, редактирование статьи;
B.С. Косоруков: концепция и дизайн, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация данных, редактирование статьи, утверждение окончательного варианта статьи.
Author's contributions:
M.A. Baryshnikova; concept and design, data collection and processing, provision of study materials, data analysis and interpretation, article preparation;
A.A. Rudakova: provision of study materials, data analysis and interpretation, editing of the article; Z.A. Sokolova: provision of study materials, data analysis and interpretation, editing of the article; O.S. Burova: provision of study materials, data analysis and interpretation, editing of the article; E.N. Kosobokova: data collection and processing, data analysis and interpretation, editing of the article;
V.S. Kosorukov: concept and design, data collection and processing, data analysis and interpretation, editing of the article, approval of the final version.
ORCID авторов/ORCID of authors
М.А. Барышникова/M.A. Baryshnikova: https://orcid.org/0000-0002-6688-8423
A.А. Рудакова/A.A. Rudakova: https://orcid.org/0000-0001-7266-7689 З.А. Соколова/Z.A. Sokolova: https://orcid.org/0000-0003-4755-5313 О.С. Бурова/O.S. Burova: https://orcid.org/0000-0001-8897-0172
B.С. Косоруков/V.S. Kosorukov: https://orcid.org/0000-0002-8462-2178 Е.Н. Кособокова/E.N. Kosobokova: https://orcid.org/0000-0002-4660-8519
Конфликт интересов. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа была выполнена при финансовой поддержке Минздрава России в рамках экспериментальной научной разработки № АААА-А18-118032290146-5.
Financing. The study was carried out with the financial support of the Ministry of Health of Russia in the framework of the experimental scientific development No АААА-А18-118032290146-5.
Соблюдение правил биоэтики. Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей. Compliance with principles of bioethics. The study was performed in accordance with ethical principles adopted by the European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes.
Статья поступила: 03.09.2019. Принята в печать: 15.10.2019. Article submitted: 03.09.2019. Accepted for publication: 15.10.2019.
