CC BY
40
УДК 547.22.04:541.14:543.426:615.277.3.015.44
С.С. Брусов1, А.В. Ефременко2' 3, В.С. Лебедева1, ЕЮ. Щепелина1, Ф.В. Пономарев1, А.В. Феофанов2'3,А.Ф. Миронов1, МА. Грин1 ВЛИЯНИЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО ЗАРЯДА
В СТРУКТУРЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ХЛОРИНОВОГО РЯДА НА ФОТОИНДУЦИРОВАННУЮ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ
Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова, Москва 2Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН, Москва 3Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Контактная информация
Грин Михаил Александрович, д.хим.н., профессор, зам. заведующего кафедрой химии и технологии биологически активных соединений им. НА. Преображенского по учебной работе адрес: 119571 Москва, проспект Вернадского, 86; тел.: +7(916)304-71-05 e-mail: michael [email protected]
Статья поступила 13.11.2015, принята в печать 27.11.2015.
Резюме
Синтезированы нейтральный фотосенсибилизатор аминобутиламид хлорина е6 с терминальной аминогруппой (1) и полученный на его основе катионный фотосенсибилизатор с терминальной триметиламмониевой группой (2). Изучены спектральные, фотофизические и фотобиологические характеристики соединений 1 и 2, а также дана оценка влиянию заряда в молекуле 2 на фотоиндуцированную противоопухолевую активность в экспериментах in vitro. Определены относительные коэффициенты внутриклеточного накопления соединений 1 и 2 в клетках аденокарциномы легкого человека А549 и глиобластомы человека U251. Показано, что значения коэффициентов внутриклеточного накопления нейтрального хлорина 1 в обоих типах клеток в 5 раз выше, чем катионного хлорина 2, и, как следствие, он в 15 раз превосходит последний по фотоиндуцированной цитотоксичности.
Ключевые слова: хлорины, фотосенсибилизаторы, фотоцитотоксичность, фотодинамическая активность.
S.S. Brusov1, A. V. Efremenko2'3, V.S. Lebedeva1, E. Yu.Shchepelina1, Ph.V. Ponomarev1, A.V. Feofanov2:3, A.F. Mironov1, M.A. Grin1 INFLUENCE OF A POSITIVE CHARGE IN THE STRUCTURE OF PHOTOSENSITIZERS
OF CHLORIN SERIES ON THE PHOTOINDUCED ANTICANCER ACTIVITY
Moscow State University of Fine Chemical Technologies named after M. V. Lomonosov
2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow
3Biological Faculty, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow
Abstract
A neutral photosensitizer, aminobutylamide chlorin e6 with a terminal amino group (1), and its derivative, a cati-onic photosensitizer with a terminal trimethylammonium group (2) were synthesized. Spectral, photophysical and photobiological properties of compounds 1 and 2 were studied. An impact of a charge in molecule 2 on a photoinduced antitumor activity was evaluated in vitro. Relative coefficients of intracellular accumulation (KreL) were determined for compounds 1 and 2 in human lung adenocarcinoma A549 and human glioblastoma U251 cells. The coefficients of intracellular accumulation of neutral chlorin 1 in both cell types are fivefold higher than those of cationic chlorin 2. As a consequence, compound 1 surpasses fifteen-fold compound 2 in photoinduced cytotoxicity.
Key words: chlorin, photosensitizer, photocytotoxicity, photodynamic activity.
Введение
В клиниках ряда стран мира (США, Германии, Израиле, Канаде, России и др.) в течение последних 20 лет в онкологии активно применяются методы ФД и ФДТ опухолей, которые основаны на фотофизических и фотохимических эффектах, возникающих при облучении введенных
в организм ФС светом определенной длины волны [2-4]. Несомненным преимуществом ФДТ перед другими консервативными методами лечения злокачественных новообразований является локальность воздействия на опухоль - это обеспечивают следующие факторы: повышенная концентрация ФС в опухолевом очаге и направленное световое воздействие.
Клинические испытания метода ФДТ свидетельствуют о его эффективности при тяжелых дис-плазиях, на ранних стадиях поверхностно расположенных опухолей различной локализации, у онкологических больных с тяжелой сопутствующей патологией. Для дальнейшего повышения результативности метода необходим поиск новых высокоэффективных ФС и изучение их фотоиндуцирован-ной активности in vitro и in vivo [7].
В настоящее время на экспериментальных моделях опухолей активно исследуются экзогенные ФС различных классов: производные фталоциани-нов, хлоринов и бактериохлоринов [9; 10]. Повышенное внимание привлекают ФС природного происхождения, которые быстро метаболизируются и легко выводятся из организма, что существенно снижает побочные эффекты ФДТ [11; 12].
Из ФС хлоринового ряда в РФ применяются препараты «Фотодитазин» и «Радахлорин», в Республике Беларусь - «Фотолон», которые являются анионными производными хлорофилла а. Однако в последнее время внимание ученых привлекают ка-тионные ФС, в том числе, содержащие первичную аминогруппу, способную в кислых средах (воспаленные и опухолевые ткани) протонироваться, придавая молекуле ФС положительный заряд. Попадая в опухолевую ткань и протонируясь, катион-ный ФС задерживается в ней, что обеспечивает значительно большее накопление по сравнению со здоровой тканью [14]. Ранее в ряду хлорофилла а была исследована фотодинамическая активность хлорина е6 (Хл e6) и его аминоамидного производного (ЭДА-Хл e6), содержащего в положении 13 хлоринового макроцикла остаток этилендиамина [13]. Было показано, что эффективность фототерапии с аминоамидом хлорина e6 значительно выше по сравнению с таковой незамещенным хлорином. В биологических испытаниях на животных-опухоленосителях коэффициент селективности накопления ЭДА-Хл e6 в опухоли составил 20, тогда как для Хл e6 он не превышал 3, что объясняется, по-видимому, высокой аффинностью аминоа-мидного производного Хл e6 к липопротеинам низкой плотности в кровотоке и направленной доставкой подобных производных в опухолевую ткань.
Кватернизация атома азота первичной аминогруппы позволяет создать из аминоамидного производного Хл e6 новый ФС с положительным зарядом, не зависящим от pH среды [13]. Целью настоящей работы стало синтезировать аминобути-ламид хлорина e6 с терминальной аминогруппой (1), а также его катионное производное с терминальной триметиламмониевой группой (2) и сравнить их фотодинамические свойства in vitro.
Материалы и методы
Синтез метилового эфира
131-аминобутиламида хлорина е6
К раствору 50 мг (0,082 ммоль) метилового эфира феофорбида а в 2 мл хлороформа добавляли 0,36 мл (3 ммоль) диаминобутана. Реакционную смесь
перемешивали в течение 4 ч в темноте. Далее промывали водой до нейтрального значения рН. Органический слой отделяли, сушили над сульфатом натрия, отфильтровывали, растворитель упаривали досуха и полученный аминобутиламид хлорина е6 далее очищали методом тонкослойной хроматографии на сили-кагеле. Элюировали смесью хлороформ-метанол 30 : 1(по объему). Выход = 37 мг (65 %). ЭСП (CHCl3) Хмакс нм : 403,0; 502,3; 529,8; 663,2 1Н ЯМР (CDCl3 ) 5 м.д.: 9,69 (1Н, с, 10-Н); 9,62 (1Н, с, 5-Н); 8,79 (1Н, с, 20-Н); 8,06 (1Н, дд, J=15,6 Гц, J=11,4 Гц, 3(1)-Н); 6,85 (1Н, уш. м, 13(1)-NH (амид)); 6,33 (1Н, д, J=15,6 Гц, 3(2)-Н (транс)); 6,13 (1Н, д, J=11,4 Гц, 3(2)-Н (цис); 5,58 и 5,32 (2Н, все д, J=18,9 Гц, 15(1)-СН2 ); 4,48-4,39 (2Н, м, 17-Н, 18-Н); 3,98-3,92 (4Н, м, 8(1)-СН2 ), 3,81 (2Н, м, CO-NHCH2); 3,75 (3Н, с, 15(3)-СН3); 3,64 (3Н, с, 12(1)-СН3); 3,56 (3Н, с, 2(1)-СН3); 3,48 (3Н, с, 7(1)-СН3); 3,32 (3Н, с, 17(3)- СН3), 2,75 (2Н, м, 7(1)-СН2); 2,58-2,53 (2Н, м, 13(2)-СН2); 2,25 (6Н, м, 13(3)-(СН3)2); 1,76-1,71 (8Н, м, 8(2)-(СН3 ), 17(2)-СН2 , 18(1)- СН3 ); 0,09 (1Н, уш. с, I - NH); -1,85 (1Н, с, III -NH). Масс-спектр, m/z: 694.320 [M+ ]. Для C4oH50N6O5 вычислено Mi=694,384
Синтез иодида диметилового эфира 13>-№р1,№-тримепшламмошй6упшламида хлорина ев (2)
К раствору 30 мг (0,043 ммоль) 131-аминобутиламида хлорина е6 в 1,5 мл хлороформа прибавляли 1 мл (0,016 моль) метилиодида в присутствии 0,05 мл 2,4,6-триметилпиридина. Реакцию проводили при кипячении в течение 30 мин. Реакционную смесь экстрагировали в системе дихлорме-тан/вода. Органический экстракт сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали на роторном испарителе. ЭСП (CHCl3) I макс, нм: 403,0; 502,3; 663,0. 1Н ЯМР (CDCl3) 5 м.д.: 9,49 (1Н, с, 10-Н); 9,43 (1Н, с, 5-Н); 8,75 (1Н, с, 20-Н); 7,71 (1Н, дд, J=15.8 Гц, J=11,7 Гц, 3(1)-Н); 7,43 (1Н, уш. м, 13(1)-NH (амид)); 6,05 (1Н, д, J=15,8 Гц, 3(2)-Н (транс)); 5,84 (1Н, д, д, J=11,7 Гц, 3(2)-Н (цис); 4,93 (2Н, м, 15(1)-СН2); 4,46-4,29 (2Н, м, 17-Н, 18-Н); 3,60-3,57 (6Н, м, 8(1)-СН2 , В^-СШ-^СН;,);, , 13(3) CO-NH-CH2 ); 3,26 (3Н, с, 15(3)-СН3); 3.23 (3Н, с, 12(1)-СН3); 3,10 (3Н, с, 2(1)-СН3); 2,57 (9Н, с, 13(6)-Ы(СН3)3,); 2,17 (2Н, м, 17(2)-СН2); 1,74-1,63 (12Н, м, 8(2)-(СН3), 18(1)-СН3, 17(3)-СН3, 7(1)-СН3); -1,59(1Н, с, NH); -1,84 (1Н, с, NH). Масс-спектр, m/z: 737,469 [M+ ]. Для C43H57N6O5 вычислено Mr 737,958.
Растворы соединений 1 и 2
Для биологических исследований концентрированные растворы соединений 1 и 2 (0,6 и 0,3 мМ соответственно) готовили затиранием порошка в Кремофоре EL (CrEL, Sigma, США) и последующим разбавлением 50 мМ Na-фосфатным буфером (pH 7,0) до 5 % CrEL. Концентрацию соединений в растворах CrEL определяли спектрофотометрически с использованием коэффициента молярной экстинк-ции 34000 М-1 хсм-1 на длине волны 664 нм. Спектры поглощения соединений 1 и 2 измеряли с помощью спектрофотометра СФ 103 (Аквилон, Россия).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛИЯНИЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО ЗАРЯДА... 89
Клетки области спектра 630-700 нм с пространственным Клетки аденокарциномы легкого человека латеральным и аксиальным разрешением 0,3 и 0,6 А549 и глиобластомы человека U251 выращивали в мкм, соответственно. средах Игла-МЕМ и DMEM соответственно с добавлением 8 % эмбриональной телячьей сыворотки Методика изучения темновой и (ЭТС) и 2 мМ глутамина. Пересевы проводили 2 фотоиндуцированной раза в неделю. цитотоксичности соединений Для определения темновой и фотоиндуциро-Микроскопические исследования ванной цитотоксичности соединений 1 и 2 клетки Накопление и распределение соединений в высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты клетках А549 и U251 были изучены методами кон- (плотность посева 5х104 клеток/мл). Тестируемые фокальной микроскопии и реконструкции спек- вещества вносили в лунки через 24 ч после посева, тральных изображений (КОМИРСИ) и лазерной варьируя концентрацию от 0.005 до 16 мкМ. Для сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ). оценки фотоиндуцированной цитотоксичности через Для микроскопических исследований клетки в ло- 2 ч инкубации с соединениями 1 и 2 клетки облуча-гарифмической фазе роста отсевали на покровные ли 15 мин с помощью 500 Вт галогеновой лампы стекла в 24-луночные планшеты и выращивались через водный фильтр толщиной 5 см и широкопо-сутки при +37 °С, при 5 % СО2 до образования лосный фильтр КС-13 с пропусканием 630-1000 нм. рыхлого монослоя. Клетки инкубировали с соеди- Плотность мощности составляла 20-22 мВт/см2. По-нениями 1 и 2 в концентрации 0,5 мкМ в течение 2 сле облучения клетки инкубировали в стандартных ч и помещали под микроскоп для исследования. условиях в течение 3 ч, а затем окрашивали красите-Конфокальные спектральные изображения лями Hoechst 33342 и йодистым пропидием (PI). клеток, а также спектры флуоресценции калибро- Hoechst (6 мкМ) и PI (4 мкМ) добавляли к клеткам за вочных растворов измеряли с помощью экспери- 15 мин до окончания инкубации. Hoechst окрашива-ментальной установки для микроспектрального ет ядра как живых, так и мертвых клеток. PI избира-конфокального анализа [1]. Возбуждение флуорес- тельно проникает через мембрану мертвых клеток и ценции осуществляли гелий-неоновым лазером интенсивно флуоресцирует, связавшись с ДНК. (длина волны 632 нм, 12 мкВт). Измеренные спек- Темновую циг°токсичн°сть измеряли п°сле 5 час°в тры флуоресценции представлялись в виде суммы инкубации клетот с исследуемьши соединениями. модельных спектров: аутофлуоресценции в клетке, Цитотоксическое воздействие анализировали базовой линии, обусловленной особенностями при- при помощи эпи-флуоресцентной микроскопии, бора и флуоресценции исследуемого соединения, используя флуоресцентный микроскоп АхюОЬ- измеренной в 1% CrEL. На основе интенсивности ^ег (Zeiss, Гермтания), как «писано ранее [6; 8]. , Флуоресценцию Hoechst возбуждали в области флуоресценции исследуемого соединения строили ^ J г j г 359-371 нм, а регистрировали в области длин волн спектральные изображения, описывающие распре* * * * >397 нм. Флуоресценцию PI возбуждали в области деление даншго соединения в клеток. По полу- 530-585 нм, а регистрировали в области длин волн ченным спектральным изображениям определяли >615 нм. По изображениям свечения Hoechst счи- среднюю интенсивность флуоресценции соедине- тали общее количество клеток, а по изображениям ния в цитоплазме клетки 1ЦИт. Коэффициент накоп- свечения PI - количество мертвых клеток. В каж- ления рассчитывали по формуле: дой выборке просчитывалось 200-300 клеток. Для сравнения фотоцитотоксичности соединений рас- К _ Iцит/Iк, где считывали величины LD50 и LD90, соответствующие концентрациям соединений, при которых наблюда- Iк - интенсивность флуоресценции калибровочного рас- ется 50 %-ная и 90 %-ная гибель клеток. твора исследуемого соединения в 1 %-ном CrEL при концентрации, с которой инкубировали клетки. Ik изме- Результаты и обсуждение ряли под микроскопом при тех же условиях, при которых проводили исследования клеток. В каждой выборке об- Наиболее удобным способом синтеза хлори-рабатывалось и усреднялось 20-30 клеток. нов с терминальной аминогруппой и, в частности, соединения 1, является реакция нуклеофильного Значение К для соединения 1 в клетках А549 раскрытия циклопентанонового фрагмента в фео-принимали за 100 % и относительно него рассчи- форбиде а голученном из хлорофилла а выделен-тывали относительные коэффициенты внутрикле- ного из микроводорослей Spirulina platensis. В ка-точного накопления (Котн, %) для обоих соединений честве нуклеофила нами был использован диами-в клетках А549 и U251. нобутан. Реакцию проводили в хлороформе в тече- Внутриклеточное распределение соединений ние 4 ч (рис. 1). Ход реакции контролировали хро-изучали с помощью конфокального лазерного ска- матографически по уменьшению подвижности нирующего микроскопа TCS SP2 (Leica, Германия). продукта реакции и спектрофотометрически по Флуоресценцию соединений 1 и 2 возбуждали Ar+- гипсохромному сдвигу полос Соре и Q2 с 413 и 668 лазером (длина волны 488 нм) и регистрировали в нм до 403 и 663 нм соответственно.
№ 4/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
н,гох
Рис. 1. Синтез катионного аминоамида хлорина ев.
ж*
' I 4 . " . < >.. У- '
Рис. 2. Спектры поглощения соединений 1 и 2 в 1 %-ной эмульсии СгБЬ (50 мМ №-фосфатный буфер, рН 7).
Рис. 3. Распределения соединений 1 (А, Б) и 2 (В, Г) в клетках А549:
А, В - изображения клеток в проходящем свете; Б, Г - внутриклеточное распределение исследуемых соединений, измеренное методом ЛСКМ.
■ .
Рис. 4. Распределения соединений 1 (А, Б) и 2 (В, Г) в клетках и251:
А, В - изображения клеток в проходящем свете; Б, Г - внутриклеточное распределение исследуемых соединений, измеренное методом ЛСКМ.
Рис. 5. Темновая (незакрашенные символы) и фотоин-дуцированная (закрашенные символы) цитотоксич-ность соединений 1 (кружки) и 2 (треугольники).
Соединение V нм нм Когто % ЬБ50, мкМ ЬБП„ мкМ 90?
А549 и251
1 664 670 100 98 0,11±0,01 0,17±0,01
2 664 670 19 18 1,8±0,1 2,8±0,1
Таблица
Фотофизические и фотобиологические характеристики соединений 1 и 2
Х^ - максимум р-полосы поглощения в 1% СгБЬ;
е(Х^) - коэффициент молярной экстинкции на длине волны Х^;
Хфл - максимум спектра флуоресценции в 1% СгБЬ;
ЬБд0 и ЬБ50 - концентрации соединений, соответствующие 90 и 50% уровню фотоцитотоксичности для клеток А549; Котн - относительный коэффициент внутриклеточного накопления соединений 1 и 2_
Катионный ФС 2 получали метилированием терминальной аминогруппы при кипячении в течение 10-30 мин хлорина 1 в избытке йодистого метила с небольшим количеством лутидина. Триме-тиламмониевое производное хлорина 2 является значительно более гидрофильным соединением по сравнению с исходным хлорином 1.
Для него (2) характерна лучшая растворимость в водно-спиртовых растворах, что делает соединение 2 удобным для биологического приме-неиия.
Для дальнейших экспериментов на клетках соединения 1 и 2 были растворены в 5 %-ной водной эмульсии СгБЬ, являющегося оптимальным солюбилизатором для растворения гидрофобных порфиринов и способствующего их мономеризации
[1; 5; 6; 8].
Спектры поглощения соединений 1 и 2 в 1 %-ной эмульсии СгБЬ практически совпадают в области длин волн 450-700 нм (рис. 2) и типичны для мономерной формы производных хлорина е6, у которых боковые заместители не влияют на спектральные свойства самого хромофора. Спектры флуоресценции соединений 1 и 2 полностью совпадают по форме и имеют одинаковый максимум 670 нм (см. табл.).
Накопление и распределение соединений
1 и 2 в клетках А549 и и251
Методом ЛСКМ установлено, что соединения 1 и 2 проникают в клетки А549 и накапливаются в цитоплазматической области. Для обоих соединений наблюдается сходное внутриклеточное распределение: концентрирование в везикулярных клеточных структурах субмикронного размера, а также диффузное окрашивание цитоплазмы (рис.3). Соединения 1 и 2 в ядро клетки не проникают и не накапливаются в плазматической мембране. Для того, чтобы оценить, зависит ли внутриклеточное накопление и распределение соединений 1 и 2 от гистогенеза опухолевых клеток, было исследовано взаимодействие этих соединений с клетками гли-областомы человека и251. Обнаружено, что соединения 1 и 2 проникают в клетки и251 и для них характерно внутриклеточное распределение аналогичное клеткам А549 (рис. 4).
Согласно результатам микроспектральных исследований, внутриклеточные спектры флуорес-
ценции соединений 1 и 2 одинаковы по форме и максимуму во всех участках цитоплазмы клеток А549 и и251 и совпадают со спектрами флуоресценции в 1 %-ном СгБЬ. Это позволяет предположить, что данные соединения накапливаются в клетках в липидоподобном окружении. Нами были определены относительные коэффициенты внутриклеточного накопления (Котн) соединений 1 и 2 в клетках А549 и и251. Отношение внутриклеточной концентрации соединения 1 в клетках А549 к его концентрации в инкубационной среде было принято за 100 % (Котн=100%). Обнаружено, что для соединений 1 и 2 нет зависимости накопления от гистогенеза раковых клеток. Они в одинаковой степени проникают в клетки А549 и и251 (см. табл.). При этом относительный коэффициент внутриклеточного накопления для соединения 1 в 5 раз больше, чем для соединения 2 (см. табл.). Таким образом, введение положительного заряда существенно снизило способность соединения 2 проникать и накапливаться в раковых клетках.
Темновая
и фотоиндуцированная цитотоксичность соединений 1 и 2 в отношении клеток А549 Установлено, что без облучения светом хлорины 1 и 2 не токсичны для клеток А549 при концентрации соединения в среде меньше 16 мкМ и времени инкубации 5 ч (рис. 5). Дальнейшее увеличение концентрации соединений в среде ограничено собственной цитотоксичностью CrEL.
Для соединений 1 и 2 было проведено исследование их фотоиндуцированной цитотоксичности. Световая доза в этих экспериментах соответствовала «стандартной» дозе, которая использовалась нами ранее для сравнения активности различных фотосенсибилизаторов [1; 5; 6; 8].
Обнаружено, что соединения 1 и 2 вызывают фотоиндуцированную концентрационно-зависимую гибель клеток (рис. 5). По параметрам ЬЭ50 и ЬБ90 (концентрации, вызывающие гибель 50 и 90% клеток, см. табл.) соединение 2 уступает более высокоактивному фотосенсибилизатору 1 в 15 раз.
Наиболее вероятной причиной слабой фото-индуцированной цитотоксичности соединения 2 является его пониженная способность накапливаться в раковых клетках.
В нашей работе показано влияние периферических заместителей в хлориновом макроцикле на реализацию фотоиндуцированной противоопухолевой активности. Установлено, что введение положительно заряда снижает внутриклеточное накоп-
Заключение
-ление ФС и фотоиндуцированный цитотоксиче-ский эффект в отношении опухолевых клеток различного генеза.
Работа поддержана грантами РФФИ №1303-00577, 13-04-00670, 14-03-00503 и 15-03-02988.
Литература
1. Игнатова А А, Маслова А.С, Кирпичников М.П., Феофанов А.В. Взаимодействия фотосенсибилизатора 13,15-Ы-(3-гидроксипропил) циклоимида хлорина р6 с нормальными и раковыми клетками крови // Биоорг. хим. - 2009. - 35(6) - С. 830-6.
2. Странадко, Е.Ф. Исторический очерк развития фотодинамической терапии // Лазерная медицина. -2002. - №4. - С. 4-8.
3. BonnettR. Photodynamic therapy in historical perspective // Rev. Contemp. Pharmacother. - 1999. - 10(1).
- Р. 1-17.
4. Dougherty T.J., Comer C.J., Henderson B.W. et al. Photodynamic therapy // J. Natl. Cancer Inst. - 1998. -90. - Р. 889-905.
5. Feofanov A., Crichine A., Karmakova T. et al. Near-infrared photosensitizer based on a cycloimide derivative of chlorin p6: 13,15-N-(3'-hydroxypropyl)cycloimide chlorin p6 // Photochem. Photobiol. - 2002. - 75
- Р. 633-43.
6. Crin M.A., Bregadze V.I., Sivaev I.B. et al. Cobalt bis(dicarbollide) versus closo-dodecaborate in boronated chlorin e(6) conjugates: implications for photodynamic and boron-neutron capture therapy // Photochem. Photobiol. Sci. - 2012. - 11 - Р. 645-52.
7. Crin M.A., MironovA.F., ShtilAA. Anti-Cancer Agents // Med. Chem. - 2008. - 8. -Р. 683-97.
8. Crin M.A., Refregiers M, Yakubovskaya R.I. et al. Cycloimide bacteriochlorin p derivatives: photodynamic properties and cellular and tissue distribution // Free Radic. Biol. Med. - 2006. - 40. - Р. 407-19.
9. Moan J, Peng Q, Iani V. et al. Biodistribution, pharmacokinetic and in vivo fluorescence spectroscopic studies of photosensitizers // SPIE - 1995. - 2625. - Р. 234-8.
10. Moser J.C. Definitions and General Properties of 2nd and 3rd Generation Photosensitizers // Photodynamic Tumor Therapy - London: Harwood Academic Publishers. - 1997. - Р. 3-8.
11. Pandey R.K., Chitgupi U, Lakhminarayanan V.J. Porphyrins Phthalocyanines. - 2012. -16 - Р. 1055-8.
12. Pandey R.K, Zheng C. The Porphyrin Handbook / Kadish KM, Smith KM and Guilard R. (Eds.) - Elsevier, 2000. - Р. 157-230.
13. Ponomarev C.V., Kaplan M.A., Pospelov V.I. et al. Photosensitizer and its' Obtaining Method. RF Patent Application. - 2011. - №2416614.
14. Sharma S.K., Krayer M, Sperandio F.F. et al. Porphyrins Phthalocyanines. - 2013. - 73 - P. 17-85.
