CC BY
96
УДК 615.832.3:616-006-018-092.4 Р.И. Якубовская1, А.Д. Плютинская1, Е.А. Плотникова1, М.А. Грин2, А.Ф. Миронов2 СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ В СИСТЕМЕ IN VITRO. ПИРОФЕОФОРБИДЫ И ХЛОРИНЫ
1 Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена - Филиал ФГБУ «Федерального медицинского исследовательского центра им. П.А. Герцена» Минздрава РФ, Москва «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова», Москва
Контактная информация
Плютинская Анна Дмитриевна, к.б.н, научный сотрудник отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им. П.А. Герцена - Филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» МЗ РФ адрес: 125284 Москва, 2-й Боткинский проезд, д.3, тел. +7(495)945-87-16 e-mail: anna2031@rambler.ru
Статья поступила 10.11.2014, принята к печати 09.02.2015.
Резюме
В работе оценены физико-химические и биологические свойства гликозилированных производных пи-рофеофорбида а и хлорина е6, циклоимидных производных хлорина р6.
Гликозилированные производные пирофеофорбида а и хлорина е6 характеризовались стабильностью в растворах без воздействия светом, но при облучении подвергались фотовыцветанию.
В биологических тестах производные пирофеофорбида а проявляли высокую фотоиндуцированную активность, величина ИК50 варьировалась от 35±7нМ до 82±7 нМ (в зависимости от бокового заместителя и культуры опухолевых клеток). Среди производных хлорина е6 наибольшую активность проявил конъюгат с галак-тозным остатком в пирроле А в отношении клеток культуры НЕр2, А549 и НТ29 (ИК50 _ 15±8 нМ, 70±19 нм и 34±16 нМ, соответственно), активность которого превышала в 8-10 раз неконъюгированный аналог и производные с другой модификацией в макроцикле.
Циклоимидные производные хлорина р6 стабильны в растворе без облучения и относительно устойчивы при воздействии светом. В биологических тестах эти соединения проявляли высокую фотоиндуцированную активность (ИК50 варьировала от 35±10нМ до 250±30 нМ), которая в значительной степени превышала активность немодифицированных производных хлорина р6.
Ключевые слова: фотодинамическое воздействие in vitro, производные пирофеофорбида а, производные хлорина е6 и хлорина р6, опухолевые клетки.
R.I. Yakubovskaya1, A.D. Plyutinskaya1, E.A. Plotnikova1, M.A. Grin2, A.F. Mironov2 COMPARATIVE IN VITRO STUDY OF DIFFERENT CLASSES OF PHOTOSENSITIZERS. PYROPHEOPHORBIDES AND CHLORINES
1P.A. Hertsen Moscow Research Institute of Oncology, Moscow
2Lomonosov State Academy of Fine Chemical Technology, Moscow
Abstract
The study evaluates physical, chemical and biological properties of glycosylated derivatives of pyropheophorbide-a and chlorine е6, cycloimid derivatives of chlorine р6.
Glycosylated derivatives of pyropheophorbide a and chlorine е6 were characterized by stability in solution without light exposure, but subject to photobleaching during exposure.
Derivatives of pyropheophorbide-a showed high photo-induced activity in biological assay, the IC50 value varied from 35±7nM to 82±7 nM (depending on the pendent group and the tumor cell culture). Among the derivatives of chlorine е6 conjugate with galactose residue in A-pyrrole showed the maximum activity towards НЕр2, А549 and OT29 cells (IC50 _ 15±8 nM, 70±19 nM and 34±16 nM respectively), its activity 8-10 times exceeding the unconjugated counterpart and the derivatives with different macrocycle modification.
Cycloimid derivatives of chlorine р6 are stable in solution without exposure and relatively stable under light exposure. These compounds showed high photo-induced activity in biological assay (IC50 varied from 35±10 nM to 250±30 nM) significantly exceeding the activity of unmodified derivatives of chlorine р6.
Key words: photodynamic effect invitro, derivatives of pyropheophorbide-a, derivatives of chlorine е6 and chlorine р6, tumor cells.
Введение
Фотодинамическая терапия - способ лечения злокачественных новообразований, основанный на применении трех малотоксичных компонентов, а именно фотосенсибилизатора, кислорода и лазерного излучения, которые при совместном воздействии обусловливают цитотоксический эффект.
В последнее время особое внимание привлекают производные природных хлорофилла и бакте-
риохлорофилла. Выбор обусловлен рядом причин: распространенность в природе, интенсивное поглощение в красной и ближней ИК-областях спектра (650-830 нм), возможность химической модификации боковых заместителей, низкий уровень токсичности и быстрое выведение из организма.
К данному классу соединений относятся производные пирофеофорбида а, хлорина е6 и р6, исследования которых представлено в данной работе.
44 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ...
Пирофеофорбиды представляют группу ФС, инкубировали в течение 28 ч при +37 °С в увлаж-для которых характерно наличие в спектрах интен- ненной атмосфере, содержащей 5 % CO2 (стандарт -сивной полосы поглощения в области 660-670 нм с ные условия). Посевная концентрация клеток уста-коэффициентом экстинкции 3,5-4,5*104 М-1см-1. навливалась для каждой культуры с таким расче-Квантовый выход синглетного кислорода - 0,5-0,6. том, чтобы воздействие проходило в Соединения данного класса гидрофобны, введение экспоненциальной (логарифмической) фазе роста спиртовых групп, аминокислот, различных угле- клеток. Далее в планшеты вносили ФС в различных водных заместителей в молекулу феофорбидов концентрациях (при двух- или трехкратных после-увеличивает гидрофильные свойства ФС и собст- довательных разведениях в дуплетах) и проводили венно их растворимость в водных растворах. Сле- облучение галогеновой лампой с набором фильт-дует отметить, что конъюгирование ФС углевод- ров, режим облучения - непрерывный. После воз-ными фрагментами может способствовать увеличе- действия светом клетки инкубировали в стандарт-нию их направленной доставки в клетку. Ряд авто- ных условиях 24-28 часов. Оценку выживаемости ров показали высокую противоопухолевую актив- клеток проводили с использованием МТТ-теста [8]. ность производных пирофеофорбида а в системах Уровень ингибирования роста клеток вычисляют in vitro и in vivo [1; 6; 7; 9]. по формуле: В последнее время уделяется пристальное внимание классу природных хлоринов, обладаю- qd — QD щих рядом преимуществ: они биодеградируют и ИР(%) = [-k--] х 100$%, где сравнительно быстро элиминируют из организма; в QDk качестве исходных веществ используются пурпурные бактерии и водоросли, что значительно снижает затраты при синтезе. Хлорины - соединения с ИР - ^^ ингибирования роста клеток в кУльтУре; лтах при 665 нм и коэффициентом экстинкции 2,5- ODo и Шк - оптическая шотаосш, ртслтюрт ф°рмазана в iTiM ~ „ „ „„„ опытных и контрольных лунках, соответственно. 3^10 М см . Квантовый выход синглетного ки- F J слорода 0,4-0,7. Однако они имеют ограниченное „ ттт, применение в качестве ФС из-за низкой фотоста- Для расчета в0™™™ ИКз0 строилифкривУю бильности и недостаточной растворимости в био- крлоесттаочнзаовйиксуилмьотсутриы ионтгкиобницреонвтарнаицяиипрФоСл,ифпоеркаоцтиои-совместимых средах, поэтому встает необходи- крлоейтончахноодйиклуильегтоуркыоноцтекнотнрцаценитюр,асцоиоитвФеСтс,тпвоуюкощтеой-мость создания более устойчивых красителей, хи- 50*его концентраДию, соответствующей ** У I /П"ТТПИ ГИПРТТИ КТТРТПК мическая модификация которых позволит оптимизировать гидрофильно-гидрофобный баланс замес- р б тителей в макроцикле, что улучшит их фотофизи- ^зуттагы и м^вдште ческие свойства и растворимость [2; 4; 5]. „ , , , - , В статье представлены результаты исследо- ПрошвоОные пирофеофорбида а вания производных природного хлорофилла а: пи- Нами изучены пирофеофорбид а и зго гид-рофеофоорбида а, хлорина е, и р6, пурпУринимидов f1^-' глико- и п™0™™ прои1зводньК-в системе in vitro с различными боковыми замести- 1), являющиеся ^Щ™фобными тоедшетм-. телями. Изучены и£ физико-химические свойства, ми. П0 даIJIIЬIM ^^фф^ юшкопфс^ашге щб оценена фотоиндуцированная цитотоксичность сситвтоевлаетйьуугвлеелвиочденныимюинфарпаргамвелнентанмоий дмоосжтеатвксипоФсСобв-относительно опухолевых клеток человека различ- станин нанравленной ДО^ш ФСв ного эпителиального происхождения in vitro ^С, а также приДавать с°0Jаекале aм(j[)вIфильньIй характер, увеличивая растворимость красителей в Материалы и методы водныхрастворах [1; 10]. 1 Стабильность крссителеи Производные пирофеофорбида а, едшомше в ^ту^шой среде хлорина е6 и хлорина р6 ^ видн0 из ^cra^™ в табл. 2 да% Синтезированы на кафедре химии и техноло- ЭТС в к^чФ^™ среде с с°)ДеIC^aнв3есB 7 00 гии биологически активный соединений МИТХТ ЭТС все изученные соединения характеризовались им. М.В.Ломоносова под руководством проф. А.Ф. ст^^стью в течение ^фшшого щхаюшого Миронова и д.х.н. М.А. Грина. Для растворения интервала (24 часа). За время ш^дешм не отме-использовали 100 %-ный раствор Кремофора EL чалось сдвига мaкcис°ум0в поглощения,фснижения (содержание кремофора £ растворе составляло к™-™ оптичезмого 1Югл0Щения, прoc°вCJaь спек-10 %) Диапазон концентраций ФС варьировали - тра оставался низменными в течение суток. для физико-химических исследований от 0,5 до 25 Оценка ^P010^1™* мкМ для биoлoгинеcких исследований - от 5 нМ П спектрам флУоресьенЧии до 2 мкМ. При изучении фотовыцветания производных Для изучения биологической (противоопу- пирo(í)йoфoрбвC^Г)0 с показано, чт0 дaHHыí° класс кра-холевой) активности ФС были отобраны соедине- свиозтделейействхиаирсавкеттеормиз(отваабллс.я3).неустойчивостью при ния, хорошо растворимые в биосовместимых сре- юзд^ствиисветом (табл. 3). дах и характеризуюЩиеся устойчивостью в бескле- Фмотдщ^втная активное „ ~ производных пирофеофорбида с точной среде в течение 24 часов. г относительно опухолевых клеток в культуре Исследования in vitro При ^^ fa™**®« свойств ФйС ^ В работе использованы клеточные линии че- ^^ что соединения 5 и 7 где ^вадшш остаь ловека (ФгБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Иванов- той Щикхидашя через ^^ ского Мз РФ): А549 (карцинома легкого), НЕр2 л0й цит0т0кcанн0cтью (от л0 ДО 100 н^, чт0 дела- (эпидермоидная карцинома гортаноглотки), НТ29 л0 ихй неперспективйыми дл1 дальнейпшх жовдсь (карцинома толстой кишки). В работе использовали 15)111Ий. У соединений 1-4 и 6 тешюкш щстотсж^ клеточные линии от 3 до 18 пассажей. Клетки рас- ности о™0^льн0 клеток вульгУры А549 не выявлено (рис. 1). севали в 96-луночные культуральные планшеты,
№ 1/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Пирофеофорбид а (1) и его гидроксипроиз-водное (2) проявляли высокую фотоиндуцирован-ную активность в отношении опухолевых клеток А549 (ИК50 составляла 160±30 нМ и 200±25 нМ). А введение углеводных остатков в пиррольное кольцо А (соединения 3; 4 и 6) в значительной степени повышало эффективность ФС при ФДВ (величина ИК50 составляла 75±5, 40±5 и 80±10 нМ, соответственно; рис. 2).
Отмечено, что все соединения накапливались в клетках со средней скоростью, поскольку временной интервал, при котором наблюдалась максимальная активность у этого класса ФС, составлял 4 часа.
На опухолевых клетках, которые характеризовались высоким уровнем экспрессии углевод-связывающих рецепторов (НЕр2 и НТ29), гликози-лированные производные пирофеофорбида а (3; 4 и 6) проявляли высокую фотоиндуцированную активность, сопоставимую с активностью относительно клеток культуры А549. Величина ИК50 для соединений 3; 4 и 6 составляла 82±7 нМ, 35±7 нМ и 74±8 нМ для культуры клеток НЕр2 и для 71±8 нМ, 33±5 нМ и 80±10 нМ культуры клеток НТ29, соответственно.
Производные хлорина е6 В работе изучали триметиловый эфир хлорина е6 и его гликозилированные производные, представленные в табл. 4.
Стабильность красителей в динамике в культуральной среде При изучение абсорбционных и флуоресцентных спектров показано, что триметиловый эфир хлорина е6 (8) характеризовался меньшей стабильностью в растворах, оптическая плотность и интенсивность флуоресценции соединения в течение 4 часов оставалась неизменной и незначительно снижалась через сутки инкубации при комнатной температуре.
Гликозилированные производные - стабильны в течение 24 ч инкубации (без воздействия светом). При выбранном временном диапазоне не отмечено снижения величины оптического поглощения и интенсивности флуоресценции в максимумах и изменений профиля спектров (табл. 5).
Как видно из данных, представленных на рис. 3-4, триметиловый эфир хлорина е6 (8) и его производные с углеводным заместителем в пирроле С (10 и 11) неустойчивы в культуральной среде с содержанием 7 % ЭТС после светового воздействия. Так, при облучении с дозой света 5 Дж/см2 интенсивность флуоресценции снижалась в 1,5-2 раза относительно показателя, детектированного до воздействием светом, с дальнейшим незначительным фотовыгоранием красителя при увеличении плотности энергии до 10 Дж/см2. Выявлено, что фотовыцветание триметилового эфира хлорина е6 с галактозой в пирроле А (9) было менее интенсивным, фотовыгорание красителя сопровождалось незначительным снижением интенсивности полосы с максимумом на 670 нм.
Фотоиндуцированная активность производных хлорина е6 на опухолевых клетках в культуре При проведении скрининга производных хлорина е6 на клетках культур различного генеза (НЕр2, А549 и НТ29) при варьировании концентрации ФС, времени преинкубации до воздействия, а также при облучении с удалением красителей из среды показано, что все соединения представлен-
ного класса проявляли высокую фотоиндуцирован-ную активность in vitro. Показано, что все соединения не проявляли темновой цитотоксичности in vitro (диапазон концентраций от 3 до 1000 нМ). Введение углеводного остатка в пиррол А (9) в значительной степени (в 2-25 раз, в зависимости от клеточной линии) повышало фотоиндуцированную активность ФС, а присутствие углевода в пирроле С (соединение 10) и замещенного триазольного цикла (соединение 11), наоборот, снижало фотоактивность красителей как по сравнению с неглико-зилированным производным (8), так и с глико-коньюгатом (9).
Все производные триметилового эфира хлорина е6 оказались существенно активнее, чем известный официнальный препарат «Радахлорин» (табл. 6).
Выявлено, что представленные производные хлорина е6 проявляли максимальный эффект при ФДВ и 4-часовой инкубации относительно опухолевых клеток культур НЕр2, А549 и НТ29, с увеличением времени до 6 часов величина ИК50 изменялась незначительно (рис. 3; 4).
На культуре клеток НЕр2 проведена оценка фотоиндуцированной цитотоксичности соединений в зависимости от присутствия в среде во время воздействия светом и с их удалением непосредственно перед облучением. Показано, что эффективность соединений при ФДВ не снижалась при удалении из среды, что косвенно свидетельствовало о проникновении и накоплении ФС в опухолевых клетках (табл. 7).
Производные хлорина р6 Хлорин р6 (12) является близким структурным аналогом хлорина е6, отличающимся заместителем в 15 положении макроцикла. Замена виниль-ной группы на формильную в 3-м положении макроцикла обеспечивает сдвиг максимума до 690 нм (формильное производное хлорина р6 13), а введение дополнительного имидного экзоцикла в молекулу хлорина р6 - к еще более существенному сдвигу до 710-715 нм.
При этом варьирование заместителей в пи-ролле А (Rj) и экзоцикле Е (R2) позволило сместить длинноволновую полосу поглощения в область 724 - 746 нм [3]. В табл. 8 представлены изученные циклоимидные производные хлорина р6 с различными заместителями в макроцикле Стабильность красителей в динамике в культуральной среде При проведении абсорбционного и флуоре-центного анализа показано, что все представленные соединения не подвергались деградации в культу-ральной среде и характеризовались стабильностью в течение выбранных временных интервалах (не отмечено появления дополнительных пиков и снижение оптической плотности в Q-полосе для всех ФС; табл. 9).
При оценке фотовыцветания ряда производных хлорина р6 выявлено, что соединения 20 и 23 подвергались фотобличингу в меньшей степени, чем соединения 17; 19 и 22 (табл. 10). Фотоиндуцированная активность производных хлорина р6 на опухолевых клетках в культуре Все соединения характеризовались отсутствием темновой цитотоксичности относительно клеток А549. Оценка фотоиндуцированной активности хлорина р6 и его производных показала, что введение заместителей в макроцикл красителя существенным образом увеличивало эффективность производных при ФДВ.
Таблица 1
Пирофеофорбид а и его производные
ФС Тип макроцикла Тип бокового заместителя (Я)
1 V-NH N==/ ^ H-V-N HN-Д H3COOC -СН=СН2
2 -ОН
3 -О-СН2-ва1
4 -О-СН2-в1и
5 -8-(СН2)2-0-ва1
6 -О-ва1
7 -Б-в1и
Таблица 2
Стабильность пирофеофорбида а и его производных в среде Игла, содержащей 7%ЭТС
ФС Время инкубации, часы
Ex tempore 2 24
Лтах,НМ OD, усл.ед. Лтах,НМ OD, усл.ед. лтах,НМ OD, усл.ед.
1* 672 0,55±0,03 672 0,53±0,01 672 0,53±0,03
2* 662 0,42±0,02 662 0,40±0,01 662 0,4±0,02
3* 662 0,47±0,02 662 0,46±0,02 662 0,45±0,03
4* 660 0,56±0,01 660 0,54±0,01 660 0,55±0,02
5* 663 0,38±0,02 663 0,37±0,02 663 0,37±0,02
6* 662 0,32±0,01 662 0,32±0,01 662 0,32±0,01
7* 662 0,45±0,03 662 0,45±0,01 662 0,45±0,01
Соединение Время инкубации, часы
Ex tempore 2 24
Лтах,НМ IF4103, усл.ед. Лтах,НМ IF4103, усл.ед. лтах,НМ IF4103, усл.ед.
1** 675 198,0±1,7 675 195,0±2,5 675 195,0±3,0
2** 670 139,0±1,9 670 137,0±0,8 670 136,0±0,8
3** 670 150,0±2,8 670 147,0±4,2 670 149,0±1,8
4** 670 230,0±3,5 670 227,0±4,2 670 228,0±2,7
5** 670 110,0±0,7 670 99,0±3,4 670 100,0±1,2
6** 670 83,0±4,0 670 80,0±0,9 670 82,0±2,6
7** 662 143,0±2,9 662 140,0±3,8 662 141,0±3,2
*концентрация ФС 15 мкМ; **концентрация ФС в растворе 2 мкМ.
Таблица 3
Устойчивость пирофеофорбида а и его производных при воздействии светом в бесклеточной среде. Концентрация ФС в растворах 2 мкМ_
ФС Доза света, Дж/см2
до облучения 5 10
лтах,НМ IF4103, усл.ед. лтах,нМ IF4103, усл. ед. лтах,нМ IF4103, усл.ед.
1 675 200,0±2,8 675 82,0±3,7 675 74,0±0,8
2 670 137,0±2,0 670 70,0±2,8 670 58,0±1,9
3 670 154,0±3,2 670 63,0±4,3 670 55,0±2,5
4 670 220,0±1,5 670 108,0±4,2 670 87,0±2,8
5 670 107,0±3,0 670 45,0±5,1 670 37,0±3,5
6 670 80,0±2,7 670 38,0±2,5 670 25,0±4,1
7 662 140,0±1,6 662 68,0±3,0 662 54,0±3,3
Таблица 4
Производные хлорина е6
Заместители
R1 R2
-OCH3 -CH2
-OCH3 OH OH OH
OH OH OH -CH2
OH .OH NH OH -CH2
ФС
Тип макроцикла
10
H НзС
11
"'"/Н Г
/ ™ ^ COR, MeO2C MeO2C
8
R
2
9
Таблица 5
Стабильность растворов гликозилированных производныз хлорина е6 в среде Игла, содержащей 7 %ЭТС
ФС Время инкубации, часы
ex tempore 2 4 24
X, нм OD, усл.ед X, нм OD, усл.ед X, нм OD, усл.ед X, нм OD, усл.ед
8* 665 0,75±0,03 665 0,75±0,04 665 0,72±0,03 664 0,57±0,04
9* 667 0,88±0,03 667 0,86±0,04 667 0,84±0,03 667 0,77±0,02
10* 667 0,37±0,02 667 0,36±0,02 667 0,37±0,03 667 0,38±0,02
11* 667 0,85±0,03 667 0,82±0,03 667 0,81±0,04 667 0,78±0,04
Время инкубации, часы
ФС ex tempore 2 4 24
X, нм IF4103, усл.ед X, нм IF4103, усл.ед X, нм IF4103, усл.ед X, нм IF4103, усл.ед
8** 670 116,0±10,8 670 110,0±13,8 670 99±2,9 670 89±3,4
9** 670 222,0±8,2 670 224,0±3,5 670 221,0±2,1 670 219,0±1,7
10** 660 80,0±2,1 660 75,0±1,4 660 71,0±1,9 660 76,0±0,7
11** 670 168,0±4,2 670 156,0±4,3 670 156,0±1,7 670 160,0±4,2
*концентрация ФС в растворе 25 мкМ; **концентрация ФС в растворе 0,5 мкМ.
Таблица 6
Сравнительная фотоиндуцированная активность Радахлорина, триметилового эфира хлорина е6 и его производных
ФС ИК50, нМ
НЕр2 А549 НТ29
Радахлорин 5500±300 6100±450 7500±550
Триметиловый эфир хлорина е6 (8) 200±25 150±48 400±43
Триметиловый эфир хлорина е6 с галактозой в пирроле А (9) 15±8 70±19 34±16
Триметиловый эфир хлорина е6 с галактозой в пирроле С (10) 200±55 700±47 400±27
Триметиловый эфир хлорина е6 с галактозой и триазолом в пирроле С (11) 400±35 700±41 600±38
Таблица 7
Фотоиндуцированная активность гликоконъюгатов в зависимости от их присутствия в среде во время облучения
ФС Облучение в присутствии ФС Облучение без ФС в среде инкубации
ИК50 нМ
Триметиловый эфир хлорина е6 (8) 240±50 260±32
Триметиловый эфир хлорина е6 с галактозой в пирроле А (9) 27±7 29±13
Триметиловый эфир хлорина е6 с галактозой в пирроле С (10) 290±25 320±20
Триметиловый эфирс галактозой и триазолом в пирроле С (11) 450±32 550±41
Таблица 8
Хлорина р6 и его производные__
ФС Тип макроцикла Заместители
R1 R2 R3
14 R1 H3C R3O O O | R2 -CH=CH2 -(CH2)3OH H
15 -CH=CH2 -(CH2)2OH H
16 -CH=CH2 -OCOCH3 H
17 -CH=CH2 -OH CH3
18 -CH=CH2 -CH2COOH CH3
19 -CH=CH2 -(CH2)2COOH CH3
20 -CHO -(CH2)3OH H
21 -CH=CH2 -OCH3 CH3
22 -CH=NOH -OCH3 CH3
23 -CHO -OCH3 CH3
Таблица 9
Стабильность хлорина р6и его производных в среде Игла, содержащей 7%ЭТС. Концентрация ФС в растворе 15 мкМ
ФС Время инкубации, часы
Ex tempore 2 24
Лтах,НМ OD, усл.ед. Лтах,НМ OD, усл.ед. Лтах,НМ OD, усл.ед.
1 2 3 4 5 6 7
12* 665 0,34±0,03 665 0,32±0,04 665 0,30±0,03
13* 665 0,29±0,02 665 0,25±0,01 665 0,22±0,01
14* 716 0,37±0,02 716 0,36±0,01 716 0,35±0,02
15* 712 0,41±0,02 712 0,42±0,02 712 0,4±0,02
16* 712 0,45±0,02 712 0,47±0,02 712 0,46±0,02
17* 715 0,62±0,02 715 0,63±0,03 715 0,61±0,01
18* 708 0,33±0,02 708 0,32±0,01 708 0,33±0,01
19* 708 0,35±0,01 708 0,36±0,02 708 0,35±0,01
1 2 3 4 5 6 7
20* 746 0,31±0,02 746 0,32±0,03 746 0,31±0,02
21* 710 0,41±0,02 710 0,43±0,03 710 0,42±0,01
22* 720 0,37±0,02 720 0,36±0,01 720 0,35±0,02
23* 740 0,26±0,02 740 0,25±0,04 740 0,22±0,03
Лтах,НМ IF4103, усл.ед. Лтах,НМ IF4103, усл.ед. Лтах,НМ IF4103, усл.ед.
12** 670 150,0±5,8 670 145,0±5,1 670 144,0±2,8
13** 670 145,0±4,7 670 140,0±6,1 670 142,0±2,1
17** 720 182±3 720 174,0±5,5 720 175,0±4,1
19** 725 210,0±2,9 725 200,0±4,7 725 201,0±4,5
20** 755 190,0±5,1 755 187,0±2,2 755 188,0±2,4
22** 730 192,0±2,3 730 189,0±1,8 730 188,0±3,3
23** 750 187,0±3,9 750 179,0±2,0 750 180,0±5,1
*концентрация ФС 15 мкМ; **концентрация ФС 1 мкМ.
Таблица 10
Устойчивость циклоимидных производных хлорина р6 при воздействии светом в культуральной среде. Концентрация ФС в растворах 1 мкМ._
ФС Доза света, Дж/см2
до облучения 5 10
лтах,нм ШЧШ3, усл.ед. лтах,нм ШЧШ3, усл.ед. лтах,нм ШЧЮ3, усл.ед.
17 720 179,0±3,4 720 79,0±1,5 720 65,0±0,7
19 725 199,0±3,5 725 94,0±2,8 725 85,0±2,8
20 755 187,0±4,1 755 120,0±3,5 755 100,0±2,2
22 730 181,0±1,8 730 87,0±3,4 730 75,0±3,3
23 750 190,0±2,3 750 130,0±2,4 750 108,0±1,8
Рис. 1. Фото- и цитотоксичность гликозильного (4, 1) и галактозильного производного пирофеофорбида а (7, 2).
Рис. 2. Фотоиндуцированная активность пирофе-офорбида а и его производных. Культура клеток А549. Время инкубации 4 часа.
Рис. 3. Фотоиндуцированная активность триметилового эфира хлорина е6 (8, 1) гликоконьюгата с галактозой в пирроле А (9, 2) в зависимости от времени инкубации
5000 -| -
4500- Т 2500- \
4000- А \
3500- 2000- т \
30002 г 2500- \Ч I 1500- хч
z гио - 15W-1W0- ио- T^i— А54Э -i НТ29 JC 500 - А 549 -£ НТ29
0- 1 2 3 4 & € Время инкубации, часы НЕр2 ...... ■ 1 ■ 1 ■ 1 1 2 3 4 & 6 Время инкубации, часы
Рис. 4. Фотоиндуцированная активность гликоконьюгата с галактозой в пирроле С (10, 1) и с галактозой и триа-золом в пирроле С (11, 2) в зависимости от времени инкубации.
Рис. 5. Фотоиндуцированная активность хлорина р6 и его циклоимидных производных. Время инкубации 2 часа. 12-3400±45 нМ; 13 - 5500±55 нМ; 14 -90±20 нМ; 15 - 170±20 нМ; 16 - 250±30 нМ; 17 - 35±10 нМ; 18 - 130±26 нМ; 19 -130±30 нМ; 20 - 140±30 нМ; 21 - 70±10 нМ; 22 - 65±15 нМ; 23 - 63±10 нМ.
Как видно из данных, представленных на рис. 5, наибольшая активность выявлена у ФС с гидроксиль-ной группой в экзоцикле (17; величина ИК50 составляла 35±10 нМ); удлинение углеводородной цепи в этом положении (соединения 18 и 19) существенно снижало фотоиндуцированную активность (ИК50 - 130±26 нМ и 127±30 нМ соответственно). Соединения с ярко выраженными липофильными свойствами (21-23), характеризовались более высокой активностью: величина ИК50 в среднем составляла 67±15 нМ. В ряду соединений 14-16 активность, напротив, убывала с укорочением алкильного радикала в экзоцикле Е (величина ИК50 -90±15 нМ, 170±18 нМ и 250±23 нМ соответственно). Полученные результаты показывают, что, варьируя структуру боковых заместителей и их положение в макроцикле, можно в значительной степени влиять на эффективность ФС при ФДВ. Отмечено, что временной интервал, при котором соединения проявляли максимальную фотоиндуцированную цитоток-сичность, составлял 2 ч, все красители проникали в клетки и накапливались в них.
Заключение
Таким образом, при оценке физико-химически и фотофизических свойств производных пиро-феофорбида а показано, что соединения характеризовались стабильностью в растворах без воздействия светом, но оказались неустойчивыми при облучении. Пирофеофорбид а (1) и его гидроксипроиз-водное (2) имели высокую фотоиндуцированную активность относительно опухолевых клеток в культуре (величина ИК50 составляла 160±30 нМ и 200±25 нМ, соответственно).
Присоединение углеводного фрагмента к пиррольному кольцу А увеличивало эффективность соединений 3; 4 и 6 в 2-5 раз по сравнению как с исходным пирофеофорбидом (1), так и с его гидро-ксилированным производным (2). Однако, несмотря на высокую активность большинства соединений, ФС данного класса не были отобраны для дальнейшего изучения. К недостаткам гликоконью-гатов следует отнести трудоемкий и дорогостоящий синтез, а также наличие максимума поглощения при лтах=660 - 665 нм.
Оценка физико-химических и фотофизических свойств производных хлорина е6 (8-11) показала, что все представленные ФС стабильны в растворах без облучения и подвергались фотовыцветанию при воздействии светом.
При оценке фотоиндуцированной противоопухолевой активности отмечено, что эффективность триметилового эфира хлорина е6 превышала активность Радахлорина в 20-40 раз. Введение заместителей в пиррол С приводило к снижению активности красителей, как по сравнению с неконью-гированным аналогом (8), так и с гликоконьюгатом (9). А введение галактозного остатка в пиррол А макроцикла значительно повышало эффективность производных хлорина е6, по сравнению с пирофео-форбидом а (величина ИК50 составляла 15±8 нМ и 2о0±25 нМ, соответственно). Однако, несмотря на положительные результаты в биологических тестах in vitro, наличие у этих соединений максимума поглощения при 665 нм, где отсутствует глубокое проникновение света в ткани, а также сложность и трудоемкость их химического синтеза делают дальнейшее изучение данной группы ФС нецелесообразным.
При изучении физико-химических свойств хлорина р6 и его производных показано, что все ФС характеризовались стабильностью в растворах и относительной устойчивостью при воздействии светом. Внутримолекулярная циклизация и введение ряда электроноакцепторных заместителей в макроцикл хлорина р6 (лтах=660 нм) в значительной степени смещала максимум поглощения его модифицированных производных в более длинноволно-
вую область спектра (лтах=710-740 нм) и увеличивала фотоиндуцированную активность ФС по сравнение с хлорином р6 и его формильным производным. Так, эффективность хлорина р6 и его фор-мильного производного была в 100-150 раз ниже, чем у наиболее активного циклоимидного производных хлорина р6 (величина ИК50 составляла 35±10 нМ), который был выбран для дальнейшего изучения в системе in vivo.
Литература
1. Аксенов А.А., Себякин Ю.Л., Миронов А.Ф. Синтез и изучение свойств О- и S- гликозилированных производных пирофеофорбида all Биоорганическая химия. - 2001. - 27(2). - P. 145-50.
2. Назарова А.И., Феофанов А.В., Кармакова Т.А. и др. Влияние заместителей на фотохимические и биологические свойства 13,15-Ы-циклоимидных производных хлорина р6 ll Биоорганическая химия. - 2005. - 31(5). - С. 535-48.
3. Рузиев Р.Д. Синтез и изучение свойств гидроксилсодержащих циклоимидных производных хлорина р6. Дисс. ...к.х.н. - M., 2005.
4. Feofanov A., Sharonov G., Grichine A. et. al. Comparative study of photodynamic properties of 13,15-N-cycloimide derivatives of chlorin p6 ll Photochem. Photobiol. - 2004. - 79(2). - P. 172-88.
5. Grin M.A., Lonin I.S., Makarov A.I. et.al. Synthesis of chlorin-carbohydrate conjugates by «click chemistry» ll Mendeleev Commun. - 2008. - 3(18). - P. 135-7.
6. Hajri A, Wack S, Meyer C. et. al. In vitro and in vivo efficacy of photofrin and pheophorbide a, a bacterio-chlorin, in photodynamic therapy of colonic cancer cells ll Photochem Photobiol. - 2002. - 75(2). - P. 1408.
7. Luo T., Wilson B.C., Lu Q.B. Evaluation of one- and two-photon activated photodynamic therapy with pyro-pheophorbide-a methyl ester in human cervical, lung and ovarian cancer cells ll J. Photochem Photobiol B. -2014. - 5(132). - P. 102-10.
8. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survivals: application to proliferation and cy-totoxity assay ll Journal of Immunological Methods. - 1983. - 65. - P. 55-63.
9. Wu D., Liu Z., Fu Y., Zhang Y. et al. Efficacy of 2-(1-hexyloxyethyl)-2-devinyl pyropheophorbide-a in photodynamic therapy of human esophageal squamous cancer cells ll Oncol Lett. - 2013. - 6(4). - P. 11119.
10. Zhang M., Zhang Z., Blessington D. et al. Pyropheophorbide 2-deoxyglucosamide: a new photosensitizer targeting glucose transporters ll Bioconjugate Chem. - 2003. - 14(4). - P. 709-14.
