CC BY
83
УДК616.127-005.8:575.174.015.3
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ TNF - Б (G30 8 A) И IL-10 (G-1082A) ПРИ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА НА ЭКСПРЕССИЮ ПРО - И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ
В. С. Голышко1, В. А. Снежицкий1, М.В. Ершова2, О. Е. Кузнецов2
Х-УО «Гродненский государственный медицинский университет» 2-УЗ «Гродненская областная клиническая больница»
Значительное количество исследований посвящено поиску генетических факторов, предрасполагающих к неблагоприятному течению коронарной болезни сердца. Одно из главных направлений в этих исследованиях — изучение полиморфизма генов про- и противовоспалительных цитокинов. В статье приводятся результаты исследований по изучению ассоциаций полиморфизма генов TNF-6( G-308A) и IL-10(G-1082A) с инфарктом миокарда, и влияние данных полиморфизмов на экспрессию цитокинов.
Ключевые слова: инфаркт миокарда, ДНК-полиморфизм, цитокины
В последние годы произошла переоценка ключевых положений патогенеза коронарной болезни сердца с позиций развития иммунного воспаления в сосудистой стенке. Установлено, что атеросклероз по многим признакам подобен хроническому воспалительному процессу с участием медиаторов воспаления, активно продуцируемых в зонах формирования атеросклеротической бляшки и очаге ишемии при инфаркте миокарда (ИМ). С целью поиска причин прогрессирования атеросклероза коронарных артерий и выявления лиц с высокой степенью риска ИМ представляется оправданным поиск новых эффективных профилактических мероприятий [ 1, 3 ].
Один из подходов к профилактике ИМ - изучение генов, обусловливающих предрасположенность к заболеванию. Генетические ассоциативные исследования и анализ генов-кандидатов позволили выявить ряд полиморфизмов, предрасполагающих к развитию острых коронарных событий [6, 8, 15, 20].
Гены цитокинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, причем количество участков этого полиморфизма в одном гене может достигать нескольких десятков. Другими словами, наличие аллельного полиморфизма в промоторных участках генов обеспечивает разнообразие индивидов по степени продукции ци-токинов при формировании клеточных реакций, в том числе и при ИМ [1].
Для исследования выбраны 2 гена-кандидата, которые, согласно международным базам данных, ассоциируются с ИБС и ИМ: фактор некроза опухолей-б (ТМР-б) и противовоспалительный интерлейкин-10 (ГЬ-10).
Уровень Т№-б повышен в крови пациентов с острым коронарным синдромом по сравнению с больными со стабильной стенокардией и здоровыми лицами. Более того, риск коронарной смерти и развития ИМ имеет прямую корреляцию с уровнем этих показателей [19]. Установлено, что связывание ТОТ-б с соответствующими рецепторами приводит к активации факторов, кодирующих транскрипцию 1Ь-6, Ю, факторов роста и индуцирующих апоптоз [8]. Несмотря на множество описанных возможных полиморфизмов гена ТОТ-б, лишь замена в позиции в -308А влияет на изменение транскрипции и продукции цитокина [13]. Учитывая множественность эффектов ЮТ-б, изучение полиморфизма в-308А гена Т№-б проводилось при многих заболеваниях: мутация в-308А гена ТОТа (генотип АА) предрасполагает к развитию нефросклероза при пиелонефрите у детей, установлена зависимость между наличием аллеля А-308А и предрасположенностью к септическому шоку и смерт-
ности от него [2, 8, 30].
Другой ген-кандидат в нашем исследовании - ген IL10, кодирующий интерлейкин, который относится к противовоспалительным цитокинам [21,27]. Считается, что повышение его уровня обеспечивает защитный эффект при развитии атеросклероза. Данный цитокин с условно противовоспалительной активностью тормозит экспрессию тканевого фактора, вызывая гипокоагуляцию, подавляет действие 1Ь-1в, IL-6 и TNF6 на эндотелиальные клетки и макрофаги. Известно, что у пациентов с сердечнососудистыми заболеваниями (ССЗ) уровень IL10 снижен по сравнению со средним уровнем [25]. В ряде исследований сообщалось об ассоциации между определенными генетическими вариантами гена IL10 и повышенным синтезом мРНК гена IL10, а также и собственно цитокина [16,17]. На основании этих данных был выбран полиморфный маркер (G-1082A) гена IL-10, который расположен в промоторе гена и, возможно, ассоциирован с уровнем синтеза интерлейкина [23].
Целью данной работы было изучение влияния полиморфизма генов TGF-б (G-308A) и IL-10 (G-1082A) при ИМ на экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов.
Материалы и методы
Обследовано 87 пациентов с установленным, согласно критериям Европейского общества кардиологов на основании клинических, электрокардиологических и эн-зимологических данных, диагнозом инфаркт миокарда. Из них 72 мужчины и 15 женщин, в возрасте от 34 до 78 лет (средний возраст: 56,6 ± 9,64 лет). Все пациенты находились на лечении в учреждении здравоохранения «Гродненский областной клинический кардиологический центр». При проведении анализа частотных характеристик генотипов у больных ИБС в качестве контроля выступали 12 практически здоровых доноров. Генотипирова-ние промоторных участков цитокинов проводили на основании данных о нуклеотидной последовательности иссл едуем ых г енов из ба з ы да нны х GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) с использованием регистрационных номеров IL-10 G-1082A (rs1800896), TNF6 G-308A (rs1800629). Определение полиморфизмов генов IL-10 (G-1082A), TNF6 (G-308A) осуществляли методом real- time PCR (ПЦР в режиме реального времени, анализатор Rotor-Gene 6000) с аллель-специфичными праймерами, синтезированными в НПФ «Литех», Россия. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов цельной крови. Исследование выполнялось на базе клинико-диагностической ла-
боратории учреждения здравоохранения «Гродненская областная клиническая больница».
Оценку соответствия распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) проводили с использованием критерия ч2 (Пирсона), применяя online тест программы www.tufts.edu/~mcourt01/documents/ court%20lab%20%20hw%20calculator.xls, при p<0,05 равновесие выполняется. Оценку достоверности различий по частотам генотипов между исследованными выборками проводили по критерию ч2 с помощью статистической программы Statistica 6.0 (при p<0,05 результаты считались достоверно значимыми).
Результаты исследования
В ходе анализа выполненных молекулярно-генетичес-ких исследований установлено, что частота генетического полиморфизма IL10 (G-1082A) у 3 (25,0%) резидентов контрольной группы наблюдалось GG - состояние аллелей, расцененное как нормальная гомозигота, у 9 (75,0%) резидентов - GA, гетерозигота. Среди исследуемой группы 55 (65,22%) резидентов выявлено GG-состояние аллелей, у 32 (36,78%) - гетерозиготное состояние аллелей. У обследованных резидентов двух групп мутантного состояния аллелей АА выявлено не было. При определении полиморфизма TNF(G-308A) в контрольной группе состояние аллеля GG (нормальная гомозигота) наблюдалось у 11(91,67%), гетерозиготное состояние у 1 (8,33%) резидента. Среди больных ИМ 69 (79,31%) определен генотип GG, у 18 (20,69%)-гетерозиготное состояние аллелей. Мутантное состояние аллелей также не было обнаружено ни в одной из групп (таблица 1). Нами не выявлено различий между группой с исследуемой патологией по сравнению со здоровыми при анализе полиморфизма G-308A гена TNF-б, что соответствует данным исследования по оценке полиморфизма в данной позиции на развитие ИМ у европейцев и другой сердечно-сосудистой патологии [4, 11, 18].
Таблица 1.Частота генотипов по полиморфизмам TGF-a (G-308A) и IL-10 (G-1082A). Группа 1 (пациенты с установленным ИМ) и
Примечание: * отмечено статистически достоверное различие, р<0,05
Как видно из представленных данных, у больных ИМ наблюдалось накопление генотипа вв локуса ГЬ10 (в-1082А), ч2 = 19,3; р <0,04. В то же время встречаемость генотипа вА рассматриваемого локуса в группе больных ИМ была более чем в 2 раза ниже в сравнении с группой практически здоровых резидентов.
В целях поиска конкретных механизмов реализации генетической предрасположенности или устойчивости индивидуума к развитию атеросклеротического процесса в коронарных сосудах и возникновению острых состояний у пациентов с ИБС проведен анализ уровня воспа-
лительных и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с фенотипическими маркерами предрасположенности к инициации ИБС.
Так, Т№-б является ключевым медиатором формирования и прогрессирования атеросклероза сосудов и одним из главных факторов ИБС, а повышение его продукции рассматривают как одну из важных причин дестабилизации ИБС [5]. Концентрация в плазме Т№-б ассоциирована со степенью развития раннего атеросклероза и коррелирует с метаболическими изменениями, считающимися важными для васкулярных процессов. Повышение продукции Т№-б - раннее и центральное событие в атерогенезе [22]. В независимо проведенных исследованиях анализа 8КР-полиморфизма в позициях-308 выявлена корреляция с уровнем транскрипционной активности промоторного гена ЮТ-б, а, следовательно, с уровнем продукции цитокина [15]. Однако определение генетических маркеров может отражать подверженность предполагаемому фактору риска в течение всей жизни пациента лучше, чем определение его концентрации в плазме, результаты которого могут изменяться со временем. Сопоставление показателей в зависимости от генотипа ТМР(в-308А) представлено на рис. 1.
Рис. 1. Уровень фактора некроза опухолей-б в зависимости от генотипа ТМЕ-б (0-308А)
Как видно, увеличение исходных значений цитокина в группе больных с фенотипом по сравнению с группой в\А -поз ит ивны х индивидуум ов дост ов ерно (р<0,0009): 13,7 (7,8; 20,0) пг/мл и 3,5 (6,0; 8,2), соответственно.
Эти данные подтверждает и то, что Шевченко с соавторами выявили снижение риска развития ИБС и ИМ у носителей гетерозиготного варианта в позиции-308 гена Т№-б по сравнению с таковыми у здоровых лиц. Вероятно, именно наличие мутантного и дикого аллелей в генотипе является фактором физиологической стабильности экспрессии гена [1].
ГЬ-10 секретируется активированными макрофагами и Т- хелперами второго типа. Он выполняет множество противовоспалительных функций. Множество исследований показало, что изменение уровня ГЬ-10 не только смягчает развитие атеросклероза, но и снижает повреждение тканей. Производство ГЬ-10 в организме человека генетически детерминировано [9, 12, 17]. Результаты показателей ГЬ-10 генотипа в\А и в\в представлены на рис. 2.
Как видно, при сопоставлении показателей ГЬ-10 у резидентов с генотипом в\А определялась увеличенная продукция цитокина: при наличии нормального гомозиготного генотипа в\вуровень ГЬ-10 составил 4,7 (3,0; 10,0) пг/мл, против 9,6 (4,0;16,6) пг/мл, (р<0,02) у пациентов с гетерозиготным носительством в\А аллелей. Полимор-
2 (практически здоровые)
Полиморфизм Генотипы 1 (пациенты с ИМ) n =87 2 (здоровые) N =12 Критерий Пирсона, Х2
n частота n частота
TNF-a G-308A G/G 69 79,31% 11 91,67%
G/A 18 20,69% 1 8,33% 0,59506
A/A 0 0,00 0 0,00%
равновесие Харди-Вайнберга, P-значение 0,2818 0,8803
IL-10 G-1082A G/G 55 65,22% 3 25,00%
G/A 32 36,78% 9 75,00% 0,04183*
A/A 0 0,00% 0 0,00%
равновесие Харди-Вайнберга, P-значение 0,0356* 0,0377*
Рис. 2. Уровень интерлейкина-10 в зависимости от генотипа IL-10 (G-1082A)
фный маркер (G-1082A) гена IL-10, видимо, ассоциирован с регуляцией экспрессии гена IL-10, так как нуклео-тид в положении-1082 входит в состав участка связывания фактора PU. 1 - репрессора транскрипции гена IL-10, приводит к более или менее выраженной воспалительной реакции, которая влияет на течение ИБС [12, 24].
Полученные нами результаты перекликаются с работой L. Rees et al. в том , что аллель А дает в два раза увеличение транскрипционной активности IL-10 по сравнению с аллелем G, а повышение уровня IL10, связанного с улучшением прогноза у больных с ИМ, обладает протекторным свойством: генотип GА локуса IL-10(G-1082A) [12, 25, 28].
Выводы
1. Не показано ассоциации полиморфизма G-308A гена TNF-б c развитием ИМ в выборке населения Гродненской области. Установлено, что генотип G/G полиморфного маркера G(-308)A гена TNF-б связан с более высокой продукцией фактора некроза опухолей по сравнению с генотипом G/A.
2. Установленные различия в распределении генотипов между больными и контрольной группой полиморфного варианта G-1083A гена IL-10 (преобладание генотипа GG) свидетельствуют о вкладе данного полиморфизма в развитие ИМ у населения Гродненской области, при этом носительство данного генотипа сопровождается меньшей продукцией данного цитокина, а генотип GА локуса IL-10 (G-1082A) обладает протекторным свойством.
Список использованной литературы
1. Аллельный полиморфизм генов про- и противовоспалительных цитокинов при инфаркте миокарда в европеоидной популяции мужчин / В.И. Коненков [и др.] // Бюллетень СО РАМН. - 2006. - №2(120). - С. 56-62.
2. Анализ полиморфизма трех позиций промоторно-го региона гена TNF-б у пациентов с ишемической болезнью сердца, нестабильной стенокардией и инфарктом миокарда / А.В. Шевченко [и др.] // Кардиология. -2010. - №2. -
С. 9-14.
3. Ассоциация полиморфных маркеров генов иммунной системы с количественными признаками патогенетически значимыми для хронического вирусного гепатита / И. А. Гончарова [ и др.] // Молекулярноая биология.
- 2008. - №2. - С. 242-246.
4. Allele frequencies of polymophisms of TNFA, IL-6, IL-10 and IFNG in an Italian Caucasian risk of population / F. Poll [et al.] //Eur. J. Immunogen. -2002. - Vol. 29. - P. 237-240.
5. Altman, R. Risk factors in coronary atherosclerosis ather o-inflammation:the mitting point / R. Altman // Thrombosis J. - 2003. - Vol. 1. - P. 4-14.
6. Arnett, D.K. Relevance of genetics and genomics for
prevention and treatment of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart association Council on epidemiology and prevention, the Stroke Council, and Fun ction al genomics and Tran slation al biology interdisciplinary working group / D.K. Arnett, A.E Baird, R.A. Barkley// Circulation. - 2007. - Vol. 115. - P. 2878-2901.
7. Association of gene polymorphisms with myocardial infarction in individuals with or without conventional coronary studies/ K. Nishihama [et al.] // Ann Hum Genet. -2006. -Vol. 70. - P. 145-169.
8. Association of TNF-a Promoter Polymorphism, With Septic Shock Susceptibility and Mortality / J.P. Mira [et al.] // J. Am- Med. Assoc. - 1999. -Vol. 282. - P. 561-568.
9. Attenuation of atherogenesis by systemic and local adenovirus mediated gene transfer of interleukin 10 in LDLr/ mice. / J.H. Von Der Thusen [et al.] // FASEB J. - 2001. - Vol. 15. - P. 2730-2732.
10. Candidate gene genotypes, along with conventional risk factor assessment? Improve estimation of coronary heart disease risk in healthy UK men / S.E. Humphries [et al.] // Clin Chem. - 2007. - Vol. 53. -P. 8-16.
11. Das, U.N. Free radicals, cytokines and nitric oxide in cardiac failure and myocardial infarction / U.N. Das // Mol. Cell Biochem. - 2000. - Vol. 215. - P. 145-152.
12. Differential regulation of IL-10 production by genetic and environmental factors—a twin study / E. Reuss [et al.] / / Genes Immun. - 2002. - Vol. 3. - P. 407-413.
13. Excessive fat accumulation is associated with the TNFa -308G/A promoter polymorphism in women but not in men / J. Hoffstedt [et al.] // Diabetologia. - 2000. - Vol. 43. - P. 117-120.
14. Gene polymorphism in the TNF locus and the Myocardial infarction / J.Q Padovani [et al.] // Thrombosis Research. - 2000. - Vol. 100. - P. 263-269.
15. Hollegaard, M.V. Cutokine gene polymorphism in human disease: on-line databases, Sup, 3 / M.V. Hollegaard, J.L. Bigwell // Gen immune. - 2006. - Vol. 7. - P. 269-276.
16. IL10 and toll-like receptor-4 polymorphisms and the in vivo and ex vivo response to endotoxin / E.F. Schippers [et al.] // Cytokine. -2005. -Vol. 29. - P. 215-228.
17. Interindividual variations in constitutive IL10 messenger RNA and protein levels and their association with genetic polymorphisms / A. Suarez [et al.] // Transplantation. - 2003. -Vol. 75. - P. 711-717.
18. Interleikine-10and tumor necrosis factor gene polymorphism and risk of coronary artery disease and myocardial infarction / P.M. Koch [et al.] // Atherosclerosis. - 2001. -Vol. 98. -P. 435-437.
19. Interleukin-1 receptor antagonist gene роlymorphism in carotid atherosclerosis / B.B. Worral [et al.] // Stroke. -2003. - Vol. 34, № 3. - P. 790-793.
20. I nvestiga ting the genetic determina nts of cardiovascular disease using candidate genes and meta-analysis of association risk factors / J.P. Casas [et al.] // Intern J Molec Med. - 2007. - Vol. 19. - P. 129-41.
21. Li, J. Enhancing antiinflammatory cytokine IL 10 may be beneficial for acute coronary syndrome / J. Li, Y. Guo // Med. Hypoth. - 2005. -Vol. 65. - P. 103-106.
22. Plasma tumor necrosis factor and early carotid atherosclerosis in healthy middle-aged men / T. Skoog [et al.] // Eur. Heart J. - 2002. - Vol. 23. -P. 376-383.
23. Polymorphism in the IL10 promoter region and early markers of atherosclerosis: The cardiovascular risk in young finns study / M. Heiskanen [et al.] //Atherosclerosis. - 2010. -Vol. 208. - P. 190-196.
24. Raised interleukin-10 is an indicator of poor outcome and enhanced systemic inflammation in patients with acute
coronary syndrome / A. Malarstig [et al.] // Heart. - 2008. -Vol. 94. - P. 724-729.
25. Serum level of the antiinflammatory cytokine interleukin-10 is an important prognostic determinant in patients with acute coronary syndromes / C. Heeschen [et al.] // Circulation. - 2003. - Vol. 107. - P. 2109-2114.
26. Serum levels of the antiinflammatory cytokine IL-10 are decreased in patients with unstable angina / D. A. Smith [et al.] // Circulation. - 2001. - Vol. 104. - P. 746-749.
27. Tedgui, A. Antiinflammatory mechanisms in the vascular wall / A.Tedgui, Z. Mallat // Circ. Res. - 2001. -Vol. 88. - P. 877-887.
28. The interleukin-10-1082 G/A polymorphism: allele frequency in different populations and functional significance / L. Rees [et al.] / Cellular And Molecular Life Science. - 2002. - Vol. 59. - P. 560-569.
29. The TNF6 gene g(-308)a polymorphism as a marker for myocardial infarction in type 2 diabetes mellitus / H. Reschner [et al.] // BJMG. - 2008. - №2. - P.11-16.
30. Tumor necrosis factor-a -308 promoter gene polymorphism and increased tumor necrosis factor serum bioactivity in fanner's lung patients / B.M. Schaaf [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2001. -Vol. 163. - P. 379-382.
T HE I NF LUE NC E OF T N F-E ( G -3 0 8 A ) AN D I L- 10 (G - 10 8 2 A) POLYMORPHISM IN MYOCARDIAL INFARCTION ON CYTOKINES
E X P R E S S I O N
V.S.Holyshko1, V.A. Snezhytskij 1r M.V. Ershova2,
O.E. Kuznetsov2 1-Educational Establishment «Grodno State Medical
Un iversity»
2- Public Health Establishment «Grodno Regional Clinical
Hospital»
Numerous investigations are devoted to genetic factors predisposing to unfavorable course of myocardial infarction. One of the main directions in this field is to investigate the polymorphism of pro- and anti-inflammatory cytokines. The present article analyzes the results of investigations devoted to association of TNF-6( G-308A) and IL-W(G-1082A) polymorphism with myocardial infarction and the effects of these polymorphisms on cytokines expression. Key words: myocardial infarction, DNA polymorphism, cytokines.
Поступила 25.09.2012
