Влияние полиморфизма гена aldh7a1 на минеральную плотность костной ткани и развитие остеопороза у женщин Казахстана Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.71+577.21

1 А.М. Айткулова, 12 А.Р. Акильжанова, 2 Ж.М. Абилова, 3 З.С. Жуматова, 4 Г.А. Акильжанова

1РГП «Национальный центр биотехнологии» г. Астана,

2 АО «Назарбаев Университет» г. Астана, 3№1 Городская поликлиника, г. Павлодар, 4Центр перинатологии, г. Павлодар

ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ALDH7A1 НА МИНЕРАЛЬНУЮ ПЛОТНОСТЬ КОСТНОЙ ТКАНИ И РАЗВИТИЕ ОСТЕОПОРОЗА У ЖЕНЩИН КАЗАХСТАНА

Аннотация

Остеопороз (ОП) характеризуется прогрессивным снижением количества костного вещества в единице объема кости. Ацетальдегиддегидрогеназа может ингибировать пролиферацию остеобластов и снижать формирование костной ткани. В связи с этим несомненный интерес представляет изучение ассоциации полиморфизма гена ALDH7A1 с ОП среди женщин Казахстана. В исследование были включены 419 женщин в возрасте 21-84 лет, проходивших обследование в поликлиниках г. Павлодара и клинике КазНМУ имени С.Д. Асфендиярова, г. Алматы. Всем участницам проведено определение минеральной плотности костей методом DEXA. Геномную ДНК выделяли из цельной крови. Генотипирование проводили с методом Real-time PCR с использованием специфических зондов TaqMan® SNP Genotyping Assay. По результатам МПКТ женщины были разделены на 2 группы: с низкой МПКТ (группа 153 остеопении и 76 остеопороз) и нормальной МПКТ (группа контроля, n=190). Анализ данных ге-нотипирования показал достоверную ассоциацию (OR=1.7,C.I.=[1.57-5.02], p=0.0004) с риском развития ОП среди казашек, также выявил преобладание мутантного-29.2% генотипа в группе с ОП среди русских женщин, что говорит о связи с низкой МПКТ в данной группе. Таким образом, можно предположить, что ALDH7A1 является потенциальным генетическим маркером, способствующим риску развитию ОП и низкой МПКТ среди женщин Казахстана.

Ключевые слова: остеопороз, минеральная плотность костной ткани, генетический полиморфизм, ген ALDH7A1, женщины.

Введение

Хорошо известно, что остеопороз представляет большую социальную и медицинскую проблему для общества, потому что до появления первых переломов у больных не бывает почти никаких симптомов заболевания или боли. Социальная значимость изучения проблемы остеопороза определяется высокой частотой встречаемости данного заболевания и тяжестью его протекания.

Остеопороз по данным Всемирной Организации Здравоохранения вышел по значимости на четвёртое место среди неинфекционных заболеваний после сердечно-сосудистой, онкологической патологии и диабета. В среднем до 40% женщин постменопаузального периода переносят, по крайней мере, один остеопорозный перелом [1]. В течение года после наиболее тяжёлых переломов, например, шейки бедра, умирает каждый пятый больной, а из оставшихся в живых 50% пациентов становятся инвалидами.

В результате многочисленных эпидемиологических исследований было показано, что патогенез остеопоро-за на 15-25% обусловлен воздействием факторов окружающей среды и на 75-85% генетической предрасположенностью [2,3].

В ходе исследований, посвященных выяснению наследственных причин остеопороза, был идентифицирован ряд генов-кандидатов, которые можно разделить на пять основных категорий: (1) гены ответственные за гомеостаз кальция; (2) гены, мутации в которых приводят к гормональной дисфункции; (3) гены, белковые продукты которых входят в матрикс костной ткани; (4) гены ответственные за липопротеиновый обмен и (5) гены ответственные за метаболизм и регуляцию остеобластов и остеокластов [4].

Предполагается, что низкая минеральная плотность костей (МПКТ) и развитие остеопороза вызывается недостаточной или несбалансированной работой этих генов, число которых на данный момент исчисляется более чем тремя десятками, однако роль каждого гена в этиологии заболевания определена недостаточно четко [3,5]. Одним из таких генов является ген фермента аце-тальдегиддегидрогеназы 1 типа (ALDH7A1).

Ген ALDH7A1 кодирует фермент суперсемейства ацетальдегид дегидрогеназы, который катализирует окисление различных альдегидов и субстратов. Эти ферменты играют особенно важную роль в защите клеток от токсичных веществ, о чем свидетельствует тот факт, что мутации и полиморфизмы в гене ALDH приводят к нарушениям процесса метаболизма альдегида и являются молекулярной основой предрасположенности к некоторым заболеваниям и нарушению обмена веществ [6,7]. Ацетальдегид, как было показано, инги-бирует пролиферацию остеобластов и уменьшает образование костной ткани [8]. Имеются работы, где выявлена взаимосвязь ALDH7A1 с метастозом костей при раке. В работе предполагается, что ALDH7A1 влияет на процессы костной колонизации в процесск остеогенеза [9]. Кроме того, предыдущие исследования выявили, что полиморфизм гена ALDH2, другой член семейства ацетальдегид дегидрогеназы в значительной степени связан с остеопорозом [10]. Также полногеномный анализ ассоциации 11 568 лиц китайской и кавказской популяций, выявил что не смотря на межэтнические и межпопуляционные различия полиморфизм ^13182402 гена ALDH7A1, связан с переломом бедра остеопорозом и низкой МПКТ [11].

Поскольку ген ALDH7А1 является относительно новым маркером остеопороза, несомненный интерес

представляет изучение ассоциации полиморфизма гена ALDH7A1 с ОП среди женщин Казахстана.

Материалы и методы

Исследование было проведено с согласия Локальной этической комисии РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК (выписка из протокола №2 от 12.03.12 г.). В исследование были включены 419 практически здоровых женщин в возрасте 21-84 лет, проходившие обследование в поликлиниках г. Павлодара -339 женщин и клинике КазНМУ имени С.Д. Асфендия-рова, г.Алматы - 80 женщин. Всем участницам объяснялись цель и задачи планируемого исследования, после чего они подписывали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Для оценки влияния факторов образа жизни разработаны специальные карты - анкеты, по которым все участницы были опрошены. Критерием исключения из исследования являлась сопутствующая патология, приводящая к развитию вторичного ОП.

Всем участникам проводилось определение минеральной плотности костей (МПКТ) методом DEXA -двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия. Исследования МПКТ поясничного отдела позвоночника были выполнены на двухэнергетическом рентгеновском денситометре QDR-4500/C (Hologic, США) на базе Областного диагностического центра г.Павлодара и на аппарате Compact-Diagnost фирмы Phillips на базе клиники КазНМУ имени С.Д. Асфендиярова, г.Алматы. Диагностику остеодефицитных состояний осуществляли согласно рекомендациям ВОЗ по Т-критерию. Результаты денситометрии выявили здоровых (Т-критерий>-1), женщин с остеопенией Т-критерий {-1;-2}, женщины с остеопорозом Т-критерий {-2;-3}.

По результатам МПКТ женщины были разделены на 2 группы: с низкой МПКТ (группа исследования 153 женщин с остеопенией и 76 с остеопорозом) и нормальной МПКТ (группа контроля, 190 женщин).

Забор крови производился в количестве 9 мл в специальные стерильные пробирки-вакутайнеры. Плазму и сыворотку крови отделяли для последующих биохимических исследований и хранили при (-80 °С) до анализа.

ДНК была веделена из венозной крови с использованием Wizard® Genomic DNA Purification kit (Promega, USA) в соответствии с протоколами

производителя с некоторой модификацией. Выделенную ДНК хранили в холодильной камере при температуре (-80 °С) до анализа. Количественно концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop1000.

Генотипирование проводили с методом Real-time PCR с использованием специфических зондов TaqMan® SNP Genotyping Assay.

Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводился с использованием пакета программ BioRad CFX Manager и TaqMan Genotyper Software.

Статистический анализ был проведен с помощью программы SPSS v.19.0. С помощью критерия x2 было определено соответствие частот встречаемости аллелей закону Харди-Вайнберга. Оценку достоверности различий по частотам генотипов между группами проводили по критерию x2. Статистически значимыми считали различия при p< 0,05. Для описания относительного риска развития заболевания online калькулятором http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl. рассчитывали отношение шансов (OR). Как отсутствие ассоциации рассматривали OR=1, как положительную ассоциацию - OR>1 и OR<1- как отрицательную ассоциацию ал-леля или генотипа с заболеванием (пониженный риск развития патологии). Доверительный интервал (CI) представляет собой интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение OR.

Результаты и обсуждение

В ходе обследования всех женщин по данным ден-ситометрии сформированы две группы: группа с низкой МПКТ - 153 женщин с остеопенией, 76 женщин - c остеопорозом (средний возраст 57.3 ± 9.8 года), и женщины с нормальной МПКТ - группа контроля 190 человек, (средний возраст 42,5 ± 13.4 года).

Исследуемая и контрольная группы существенно отличались друг от друга по этническому происхождению (р<0,01): 60.7% случаев имели азиатское и 39.3% имели европейское происхождения, в то время как в контрольной группе 42.3% имели азиатское происхождение и 57.7% - европейское происхождение. По сравнению с контрольной группой, группа женщин с осте-опенией имела более высокое количество родов. В этой группе возраст наступления менархе и менопаузы был старше.

Таблица 1.

Клинико-лабораторная характеристика обследованных групп

Параметры

Группа исследования,

N = 229 __

Контроль, N= 190

n (%)

p- значение

Возраст (лет)

57.3 ± 9.8 a

42,5 ± 13.4

<0.001

Этническое происхождение Азиатское

139 (60.7)

80 (42.3)

<0.01

Европейское

90 (39.3)

110 (57.7)

<0.01

Вес (kg)

66.7 ± 13.3

73.8 ± 13.6

0.34

Рост (m)

162.7 ± 6.2

160.4 ± 6.8

0.40

ИМТ/BMI (kg/m2)

28.6 ± 5.2

25.3 ± 5.1

0.94

Курение Да

27 (8.6)

41 (6.8)

0.397

Нет

288 (91.4)

563 (93.2)

Алкоголь Да

14 (4.4)

35 (5.8)

0.387

Нет

301 (95.6)

569 (94.2)

Возраст наступления менархе

13.0 ± 1.0

12.8 ± 0.9

0.001

Количество родов

4.2 ± 2.6

3.0 ± 2.4

0.001

Возраст наступления менопаузы

48.2 ± 4.6

47.4 ± 5.0

0.03

Группа остеопении имела менее высокий вес и индекс массы тела относительно группы контроля, но разница была не значительной. Значительные различия существовали между исследуемой и контрольной группами по следующим характеристикам: возраст наступления менархе (13,0±1,0 лет по сравнению с 12,8±0,9 лет), количество родов (4,2±2,6 по сравнению с 3,0±2,4), а также возраст наступления менопаузы (48,2±4.6 лет по сравнению с 47,4±5.0 лет). Никаких существенных различий не было

Как и ожидалось, значительно низкие уровни альбумина и более высокие уровни креатинина и С реактивного белка были обнаружены в группе остеопении по сравнению с контрольной группой, тогда как уровень витамин B12 и кальция значительно не различались в обеих группах. Отмечался дефицит фолиевой кислоты в обеих группах и гипергомоцистеинемия в группе исследования.

Липидный профиль показал значительно более низкие уровни HDL-C, и высокие ТСЛ-^ и LDL/HDL соотношения, несмотря на снижение уровня общего холестерина в исследуемой группе по сравнению с контрольной группой. Отмечались относительно высокие уровни триглицеридов, но эти различия не были статистически значимыми. Никаких различий не было отмечено по уровням лептина и адипонектина между двумя группами.

Исследование полиморфизма гв13182402 гена ALDH7A1 среди казахстанских женщин показало, что в общей группе обследованых женщин мутантный аллель

найдено между исследуемой и контрольной группами с точки зрения пропорции женщин употребляющих алкоголь (4,4% против 5,8%), курение (8,6% против 6,8%).

Биохимические исследования были проведены в лаборатории Университета г. Нагасаки (Япония).

Диетический и метаболический статус исследуемых групп анализировали путем определения уровня витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина, альбумина, креатинина, CRP, и кальция (таблица 2).

АА наиболее часто встречался в группе с остеопенией и остеопорозом - среди казашек и русских - 37.5% и 29.2%, когда в группе с нормальной МПКТ 18.4% и 20.5% соответственно. В третей группе куда вошли украинки, немки, татарки, азербайджанка, еврейка, авар, таджичка, болгарка, полька и башкирка - в группе с остеопенией и остеопорозом -27.3% по сравнению с группой здоровых лиц - 25%.

Геторозиготный генотип СА встречался чаще у русских женщин с остеопенией и ОП, чем в группе здоровых русских. Среди казашек в группах с О+Оп и здоровых, достоверных различий в распределении частот гетерозиготного генотипа СА не выявлено (таблица 4).

Поскольку по данным литературы установлена роль мутантного АА и гетероготного СА аллелей в остеогенезе и нарушении костного метаболизма, эти данные показывают ассоциацию мутантного генотипа АА с низкой МПКТ у всех 3 исследованных групп женщин и гетерозиготного генотипа СА с низкой МПКТ у русских женщин.

Таблица 2.

Биохимические данные._

Биохимические данные b Группа исследования, N = 229 n (%) Контроль, N= 190 n (%) p-значение

Альбумин ( g/dL) 4,3 4,6 0.004

Креатинин (mg/dL) 0,8 0,5 0.000

HDL-C (mg/dL) 44,0 54,0 0.000

LDL-C (mg/dL) 81,0 87,0 0.928

TG (mg/dL) 85,0 81,5 0.733

logTG 1,9 1,9 0.754

Ca (mg/dL) 9,1 9,5 0.808

HCY (nmol/mL) 16,2 14,5 0.011

VB12 (pg/mL) 301,0 323,0 0.076

FA (ng/mL) 2,8 2,9 0.019

CRP (mg/dL) 0,2 0,1 0.002

Лептин (ng/mL) 13,1 11,4 0.142

Адипонектин^^) 11,9 11,6 0.621

TC (mg/dL) 148,2 160,5 0.004

TC/HDL 3,6 3,0 <0.001

LDL/HDL 2,1 1,6 <0.001

Примечания:

1. b Все значения являются медианой.

2. Различия между случай-контроль парами по средним значениям были рассчитаны с помощью парного ¿-критерия Стьюдента. 3. Различия между случай-контроль парами по медианным значениям были рассчитаны с помощью и теста Манна-Уитни.

4. Различия между случай-контроль парами по дискретным переменным были рассчитаны

с помощью теста х2.

Таблица 4.

Данные по частоте полиморфизмов гена АЮН7А1 среди ^ разных групп обследования.

Название полиморфизма Казаш n=2 абс ики, 90 %) Русские, n=92 абс (%) Другие, n=27 абс (%)

ALDH7A1 rs13182402 Норма О+ОП Норма О+ОП Норма О+ОП

Wild-type GG 66.6% 48.3% 63.6% 54.2% 65.2% 72.7%

GA 14.9% 14.2% 15.9% 16.6% 12.5% 0%

Mutant AA 18.4% 37.5% 20.5% 29.2% 25% 27,3%

Примечание - О - остеопения, ОП - остеопороз

Таблица 5.

Ассоциация полиморфизма гэ13182402 гена АЮН7А1 с риском развития остеопороза среди женщин Казахстана.

Группа Генотип G>A Контроль n (%) Исследуемая группа n (%) OR X2 P value

казашки GG GA AA n = 114 76( 66.6) 17 (14.9) 21(18.4) n = 176 85 (48.3) 25 (14.2) 66 (37.5) 1.7 12.28 p=0.0004

русские GG GA AA n = 44 28 (63.6) 7 (15.9) 9(20.5) n = 48 26(54.2) 8(16.6) 14(29.2) 1.3 1.05 p=0.3

другие GG GA AA n = 16 10(62.5) 2(12.5) 4 (25) n = 11 8(72.7) 0 3(27.3) 0.9 0.05 p=0.8

Так же выявлена достоверная ассоциация гена ALDH7A1 с риском развития остеопороза среди казашек OR =1.7, х2=12.28, CI [1.57-5.02], p=0.0004.

Таким образом, можно предположить, что ALDH7A1 является потенциальным генетическим маркером, ассоциированный с низкой МПКТ и способствующим риску развитию ОП среди женщин-казашек.

Выводы

В данном исследовании выявлена ассоциация полиморфизма rs13182402 гена ALDH7A1 с остеопо-розом у женщин казахской популяции. Так же выявлена ассоциация данного полиморфизма с низкой МПКТ у женщин, относящихся к европейской популяции, проживающих на территории Казахстана. Полученные данные могут служить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития ОП.

Внедрение в медицинскую практику Республики Казахстан новейшего способа прогнозирования на генетическом уровне остеопороза у носителей мутаций в генах регуляторах позволит проводить генетическое консультирование населения, стратификацию риска развития, прогнозирование и профилактику остеопороза.

Литература:

1. Audi L., Garcia-Ramirez M. & Carrascosa, A. Genetic determinants of Bone Mass // Hormone Research. - 1999. -№ 51. - Р. 105-123.

2. P. Jouanny, F. Guillemin, C. Kuntz et al. Environmental and genetic factors affecting bone mass. Similarity of bone density among members of healthy families // Arthritis. Rheum. - 1995. - Vol. 38, № l. - P. 61-67.

3. Ralston, S.H. The genetics of osteoporosis // Bone. 1999. - Vol. 25, № l. - P. 85-86.

4. Niu T1, Xu X. Candidate genes for osteoporosis. Therapeutic implications // Am J Pharmacogenomics. -2001. - №1. - P. 11-19.

5. Ralston SH. Genetic control of susceptibility to osteoporosis // J Clin Endocrinol Metab. - 2002. - № 87. - P. 2460-6.

6. Satori A Marchitti, Chad Brocker, Dimitrios Stagos, and Vasilis Vasiliou Non-P450 aldehyde oxidizing enzymes: the aldehyde dehydrogenase superfamily // Expert Opin Drug Metab Toxicol. - Jun 2008. - № 4. - P. 697-720.

7. Chad Brocker, Natalie Lassen, Tia Estey, Aglaia Pappa Aldehyde Dehydrogenase 7A1 (ALDH7A1) Is a Novel Enzyme Involved in Cellular Defense against Hyperosmotic Stress* // J Biol Chem. - 2010. - № 285. - P. 18452-18463.

8. Giuliani N., Girasole G., Vescovi P.P. et al. Ethanol and acetaldehyde inhibit the formation of early osteoblast progenitors in murine and human bone marrow cultures. // Alcohol Clin Exp Res. - 199. - №23. - P.381-385.

9. Christel van den Hoogen, Geertje van der Horst, Henry Cheung, Jeroen T. Buijs, Rob C. M. Pelger, and Gabri van der Pluijm The aldehyde dehydrogenase enzyme 7A1 is functionally involved in prostate cancer bone metastasis // Clin Exp Metastasis. - Oct 2011. - № 28. - P. 615625.

10. Yamaguchi J, Hasegawa Y, Kawasaki M, et al. ALDH2 polymorphisms and bone mineral density in an elderly Japanese population // Osteoporos Int.- 2006.- №17.-P. 908-913.

11. Guo Y., Tan L., Lei S.F., Yang T. et al. Genome-wide association study identifies ALDH7A1 as a novel susceptibility gene for osteoporosis // PLoS Genet. - 2010. -№1. - P. 1-8.

Ty^H

КАЗАХСТАН ЭЙЕЛДЕР1НДЕГ1 СYЙЕК ¥ЛПАСЫНЫН МИНЕРАЛДЫ ТЫГЫЗДЫГЫ ЖЭНЕ ОСТЕОПОРОЗ ДАМУЫНА ALDH7A1 ГЕН1 ПОЛИМОРФИЗМ1Н1И ЭСЕР1 1 А.М. Айткулова, 12 А.Р. Акылжанова, 2 Ж.М. Абилова, 3 З.С. Жуматова, 4 Г.А. Акылжанова 1РГП «¥лпъщ биотехнология орталыгы» Астана к, 2 АО «Назарбаев Университету Астана к,

3Павлодар к, №1 поликлиникасы, 4Павлодар к, Перинатология Орталыгы

Остеопороз - сYЙек келемл бiрлiгiнде сYЙек заты мелшерЫщ каркынды твмендеуiмен сипатталатын ауру. Ацетальдегиддегидрогеназа (ALDH) остеобласттар пролиферациясын ингибирлеп, сYЙек улпасыныщ калыптасуын темендете алады. Осыпан байланысты Оп бар Казакстан 8йелдершщ арасында ALDH7A1 генiнiи полиморфизм кауымдастыгын зерттеу сезсiз кызыгушылык тудырады. Зерттеуге Павлодар к-сы емханаларында ж8не Алматы к-сы Асфендияров С.Д. атындагы Каз¥МУ клиникасында тексеруден еткен 21-84 жас аралыгындагы 419 8йел катысты. Барлык катысушылардыщ DEXA 8дiсiмен сYЙектщ минералды тыгыздыгы аныкталды. Акпараттык келiсiм алынган сок биологиялык материал (кан) Yлгiлерiн жинактау жYргiзiлдi, олардан геномдык ДНК белiп алынды. Генотиптеудi арнайы зондтар TaqMan® SNP Genotyping Assay пайдаланып, Real-time PCR 8дiсiмен жYргiзiлдi. СМТТ н8тижелерi бойынша 8йелдер 2 топка белЫдк СМТТ темен (153 остеопения ж8не 76 ОП тобы) ж8не калыпты СМТТ (190 бакылау тобы). Генотиптеу деректерiн талдау казактар арасындагы ОП даму каупi бар сенiмдi кауымдастыкты керсеттi (OR=1.7,C.I.=[1.57-5.02], p=0.0004), сонымен катар орыс 8ЙелдерЫщ арасындагы Оп бар топ генотипУк мутанттылыгы 29.2% асып тYстi, ол осы топтагы СМТТ темендiгiмен байланысты. Осылайша, ALDH7A1 Казакстан 8йелдерiнiк арасындагы ОП даму каупi мен темен СМТТ ыкпал ететiн потенциалды генетикалык меркерлер болып табылады.

Heri3ri сездер: остеопороз, сYЙек улпасыныщ минералды тыгыздыгы, полиморфизм, ALDH7A1 генi, 8йелдер

Summary

EFFECT OF POLYMORPHISM OF ALDH7A1 ON BONE MINERAL DENSITY AND OSTEOPOROSIS IN WOMEN OF KAZAHSTAN 1 А.М. Aitkulova, 12 A.R. Akilzhanova, 2 Zh.M. Abilova, 3 Z.S. Zhumatova, 4 G.A. Akilzhanova 1RSE «National Cnter for biotechnology», Astana, 2 AOE «Nazarbayev University», Astana, 3City Hospital #1, Pavlodar, 4 Perinatal Center, Pavlodar

Osteoporosis is a progressive bone disease that is characterized by a decrease in bone mass and density. Aldehyde dehydrogenase enzyme may inhibit the proliferation of osteoblast formation and decrease bone formation. In this regard study of the association of ALDH7A1 gene polymorphisms and osteoporosis among women in Kazakhstan is of great interest. The study included 419 women aged 21-84 years, undergoing tests in clinics of Pavlodar and KazNMU clinic named after SD Asfendiyarov in Almaty. Bone mineral density was measured in all patients by DEXA. Blood samples were collected and genomic DNA was isolated. Genotyping was performed with real-time PCR using TaqMan probes. According to the density test, women were divided into 2 groups: those with low bone density (153 cases of osteopenia and 76 cases of osteoporosis) and normal density (190 people). Analysis of the genotyping data showed a significant association (OR = 1.7, CI = [1.57-5.02], p = 0.0004) with the risk of osteoporosis in Kazakh women. Predominance of the mutant genotype, 29.2% was also revealed in the group with osteoporosis among Russian women, indicating association with low bone density. Thus we can assume that ALDH7A1 is a potential genetic marker contributing to the risk of osteoporosis and low bone density among women in Kazakhstan.

Key words: osteoporosis, bone mineral density, polymorphism, ALDH7A1 gene, women.