CC BY
78
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ВМР4 С МИНЕРАЛЬНОЙ ПЛОТНОСТЬЮ КОСТНОЙ ТКАНИ И МАРКЕРАМИ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА
А'.А Маслова, М.Ю. Крылов, Н.В.. Торопцова» О,А Никитинская, Т.А Короткова, Е.Е. Михайлов, В. А. Мякоткин, Л. К Беневоленская ГУ Институт ревматологии РАМН, Москва
Резюме
Ген, кодирующий костный морфогенный белок 4 (ВМР4), принимает важное участие в костном метаболизме и регулирует костную массу.
Цель. Изучить влияние полиморфизмов гена ВМР4 на минеральную плотность костной ткани (МГТКТ) и маркеры костного ремоделирования в группах здоровых постменопаузальных женщин и имеющих остеопороз (ОП).
Материал и методы. 272 жительницы Москвы и Московской области, разделенные на две группы по показателям МПКТ, согласно критериям ВОЗ: группа ОП и группа здорового контроля.
Результаты. Обнаружена значимая ассоциация 6007С->Т полиморфизма 4 экзона с МПКТ поясничного отдела позвоночника и маркерами костного ремоделирования. Обнаружено накопление гомозиготного генотипа АА в группе больных ОП, а также достоверно более низкие значения МПКТ позвоночника у носителей данного генотипа по сравнению с носителями генотипа АУ В здоровом контроле такой закономерности не выявлено, также как и в отношении средних показателей МПКТ шейки бедра среди больных ОП и женщин контрольной группы. Отмечено существенное снижение средних значений МПКТ позвоночника и шейки бедра (в среднем на 26%) среди носителей каждого из трех генотипов у больных ОП по сравнению с контролем (р=0,001). Носители генотипа АА в целом характеризовались более низким средним значением щелочной фосфатазы и более высоким средним значением сгс^арз (фрагменты С-телопептидов, продукты деградации коллагена I типа).
Заключение. 6007С-УГ полиморфизм гена ВМР4 приводит к замене аминокислоты аланин (при наличии аллеля С) на валин (при наличии аллеля Т) в полипептидной последовательности белка ВМР4, которая влияет на его функциональную активность. Данный полиморфизм ассоциирован с МПКТ поясничного отдела позвоночника и уровнем костного ремоделирования у женщин в постменопаузе.
Ключевые слова: остеопороз^ полиморфизм\ ВМР4, минеральная плотность костной ткани.
Остеопороз (ОП) — системное заболевание скелета из группы метаболических остеопатий, характеризующееся снижением минеральной плотности костной ткани (МПКТ) и нарушением ее микроархитектоники, приводящими к снижению прочности кости и повышенному риску переломов. Эпидемиологические исследования населения в возрасте 50 лет и старше во многих странах показали, что частота ОП среди женщин составляет в среднем около 30%, среди мужчин около 20%. В развитых
Адрес: 115522 Москва, Каширское шоссе, 34а ГУ Институт ревматологии РАМН.
Тел.: (495) 114-42-80 E-mail: [email protected]
странах с увеличением продолжительности жизни ОП становится важной причиной потери здоровья и смерти наряду с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями.
Одним из главных фенотипических признаков заболевания, входящих в диагностические критерии ВОЗ, является сниженая МПКТ. Многочисленные семейные, близнецовые и популяционные исследования показали, что вариабельность МПКТ среди взрослых индивидумов на 60-80% детерминируется генетическими факторами. Исследования последних лет установили комбинированный эффект многих функционально связанных между собой генов на развитие ОП, таких как гены кальцие-
вого обмена, гормонального статуса, гены костного ремоделирования, гены компонентов внеклеточного матрикса и многие другие.
Костная ткань обладает способностью к постоянной регенерации — ремоделированию, осуществляемому остеобластами и остеокластами. Остеобласты синтезируют новый костный матрикс с последующей его минерализацией, остеокласты осуществляют резорбцию старой костной ткани. Процессы остеобласто- и остеокластогенеза, а также костного ремоделирования в целом находятся под контролем большого числа белковых макромолекул, кодируемых различными генами, образующими между собой функциональные взаимосвязи. Изучение аллельного полиморфизма сети генов костного ремоделирования является перспективным направлением для выявления генотипов предрасположенности к ОП.
Согласно последним данным, одним из важнейших сигнальных путей, участвующих в регуляции остеобластогенеза, является Wnt-путь, который также играет ключевую роль в эмбриогенезе, онтогенезе, дифференциации и росте различного рода клеток. Взаимодействие белков Wnt с мембранным рецептором Frizzled, связанным с трансмембранным белком LRP5, приводит к накоплению в клетке р-катенина, который проникает в ядро и активирует транскрипцию генов-мишеней Wnt-пути, в число которых входит ген ВМР4 (КМБ4, костный морфогенный белок 4). Ген ВМР4 был выбран нами для изучения.
ВМР4 относится к суперсемейству трансформирующих факторов роста (ТФР-0) и является чрезвычайно важным регуляторным белком, участвующим в индукции мезодермы, развитии зубов и конечностей. В настоящее время идентифицировано 9 BMP - 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 13, 14, и все они втой или иной степени задействованы в процессах хряще- и костеобразования. Исключительно важную роль белок гена ВМР4 играет в костеобразовании и репарации переломов. Показано, что ВМР4 и ВМР2 являются единственными медиаторами, способными инициировать процесс остеобластогенеза из не-коммитированных предшественников, а также вызывать остеогенную трансформацию различного типа клеток (мезенхимальных стромальных клеток, миобластов др.), стимулируя транскрипцию генов, кодирующих специфичные для остеобластов факторы транскрипции, а именно: остеобласт-специ-фичный фактор транскрипции 2 (osf2) и связывающийся с кором фактор al (cbfal), которые, в свою очередь, активируют в остеобластах транскрипцию генов остепонтина, костного сиалопротеина, коллагена 1 типа, остеокальцина, щелочной фосфатазы 11,2].
Гиперэкспрессия гена ВМР4 наблюдается у больных прогрессирующей оссифицирующей дисплазией, заболеванием, характеризующимся
интермиттирующей прогрессирующей эктопической оссификацией, задержкой умственного развития, глухотой и др. [3].
Ген картирован на длинном плече хромосомы 14, сегменты 22-23 (14ц22-23), содержит 5 экзонов и по меньшей мере 2 функциональных промотора, работающих клеточно-специфично. Наиболее изученным полиморфизмом ВМР4 является С-УГ замена оснований в позиции 6007 4 экзона, которая приводит к замене аминокислоты аланин на валин. Генотип АА имеет сниженную функциональную активность (т.е. продукцию) белка ВМР4 по сравнению с генотипами АУ и УУ
С целью изучения роли гена ВМР4 в качестве кандидатного гена предрасположенности к ОП нами было проведено исследование ассоциации С—>Т полиморфизма гена с МПК и маркерами костной резорбции в группе российских женщин. В российской популяции подобное исследование проведено впервые.
Материал и методы
В исследовании приняли участие 272 жительницы г. Москвы и Московской области, разделенные на две группы по показателям МПКТ согласно критериям ВОЗ: постменопаузальные женщины, страдающие ОП (п=122), и группа обобщенного контроля, состоящая из постменопаузальных женщин (п=63) и девочек-подростков (п=87) с нормальными показателями МПКТ, согласно критериям ВОЗ.
Таблица 1
ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУПП ОБСЛЕДОВАННЫХ ЖЕНЩИН
Группа ОП, п Группа обобщенного контроля (п=150)
Постменопаузальные женщины, п Девочки- подростки, п
Количество, человек 122 63 87
Средний возраст, лет 67,3±8,896 68,5+6,724 16,2+0,897
ИМТ <кг/м!) 26,1 ±4,208 31,8±5,616 21,11 ±3,696
ЬБВМО (г/см;) 0,726+0,078 1,033±0,086 0,942±0,100
ЖВМЭ (г/см1) 0,619±0.079 0,837+0,065 0,840±0,109
Время после наступления менопаузы, лет 18,09±8,725 21,6±9,633
Примечание:
ИМТ — индекс массы тела
ВМЭ — МПКТ поясничного отдела позвоночника БМ ВМЭ - МПКТ шейки бедра
Анализ частотного распределения генотипов гена ВМР4 и генотипических средних значений МПК позвоночника и шейки бедра в контрольной
группе девочек-подростков (п=87) и в выборке постменопаузальных женщин (п=63) не выявил достоверных различий между ними (табл. 2,3). Таким образом, эти показатели не зависят от возраста, а различия между группой больных ОП и группой обобщенного контроля ассоциированы с самим заболеванием.
Таблица 2
ЧАСТОТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОТИПОВ В ГРУППЕ КОНТРОЛЯ
Генотипы Девочки-подростки S - Постменопаузальные женщины (п—63)
АА 27,6% (п=24) 26,9% (п=17)
AV 49,4% (п=43) 60,3% (п=38)
W 22,9% (п=20) 12,7% (п=8)
Между двумя контролями значимых различий по частоте встречаемости генотипов нет (Хи-квадрат равен 2,6 при с!Г=2; р=0,28).
Таблица 3
МПКТ ПОЯСНИЧНОГО ОТДЕЛА ПОЗВОНОЧНИКА И ШЕЙКИ БЕДРА В ГРУППЕ КОНТРОЛЯ (Г/СМ1)
Девочки-подростки (11=87) Постменопаузальные женщины (п=63)
МПКТ LM МПКТ Neck МПКТ 1-.. МПКТ Neck
АА 0,946±0,13 0,861±0,13 1,02+0,08 0,837±0,09
AV 0,933±0,08 0,838±0,09 1,04±0,07 0,835±0,05
W 0,950+0.10 0,846+0,09 1,01±0,12 0,822±0,09
Значимых различий по частотам и средним значениям МПКТ поясничного отдела позвоночника и шейки бедра между двумя выборками не была, их можно было объединить в одну обобщенную группу контроля.
Участницы исследования прошли анкетирование, включавшее антропометрические и гинекологические данные, факторы риска, данные о переломах в анамнезе. Проводились биохимический анализ крови (кальций, фосфор, щелочная фосфатаза), заготовка сывороток для последующего определения маркеров костного метаболизма, выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови с последующим определением полиморфизма гена ВМР4 при помощи ПЦР с соответствующими оли-гонуклеотидными праймерами. Измерение МПКТ осуществлялось с помощью DEXA денситометра (Hologic). Статистический анализ результатов проводился с помощью пакета программ Statistica 6.0.
Результаты
Частотное распределение генотипов> Распределение АА, АУ и W генотипов гена ВМР4 (табл. 4) в группе больных ОП значимо отличалось от такового в контрольной группе в сторону накопления гомозиготного генотипа АА (44,2% vs 27,3%; р=0,002) и уменьшения числа гетерозигот АУ (39,3% vs
54,0%; р=0,014). Риск заболеть ОП для носителей гомозиготного генотипа превышал априорный в 2,3 раза (011=2,3 для носителей генотипа АА против носителей генотипа АУ).
Таблица 4
ЧАСТОТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОТИПОВ (%)
Генотип Группа ОП (п=122) Г руппа контроля (п=150)
АА 44,2% (п=54) 27,3% (п=41)
AV 39,3% (п=48) 54.0% (п=81)
W 16,4% (п=20) 18,7% (п=28)
Критерий Хи-квадрат между больными ОП и контролем равен 8,8 при ёГ=2 и р=0,01.
Ассоциации с МПКТ. Отмечается существенное снижение средних значений МПКТ позвоночника и шейки бедра (в среднем на 26%) среди носителей каждого из трех генотипов у больных ОП по сравнению с контролем (р<0,001).
Таблица 5
МПКТ ПОЯСНИЧНОЮ ОТДЕЛА ПОЗВОНОЧНИКА L1-L4 (Г/СМ1)
Генотип Группа ОП (п=122) Группа контроля (п=150)
АА 0,712±0,07 0,903±0,16
AV 0,742±0,07 0.91810.14
W 0,733±0,09 0.948±0,13
Обнаружена ассоциация генотипа АА с более низкими средними значениями МПКТ поясничного отдела позвоночника по сравнению с носителями генотипа АУ (0,712 ± 0,07 г/см2 уз 0,742 ± 0,07 г/см2; р=0,036; г=0,14). Среди лиц здорового контроля такой закономерности не выявлено.
Статистически значимой ассоциации генотипов и средних показателей МПКТ шейки бедра среди больных ОП и контрольной группы не обнаружено (табл. 6).
Таблица 6
МПКТ ШЕЙКИ БЕДРА (Г/СМ1)
Генотип Группа остеопороза (п=122) Группа контроля (п= 150)
АА 0,626±0,07 0,718±0,4
AV 0,621 ±0,09 0,719±0,4
W 0,591 ±0,08 0,733±0,4
Ассоциации с маркерами костного ремоделирования. Результаты изучения вариабельности концентраций щелочной фосфатазы и сго^арБ (фрагменты С-телопептидов коллагена I типа, продукты деградации коллагена) у больных ОП показывают, что носители генотипа АА в целом характеризуются более низким средним значением щелочной фосфатазы и более высоким средним значением сгазэкрв (табл. 7,8). Эти данные свидетельствуют о более низкой интенсивности процессов костеобразова-
ния и более высокой интенсивности процессов костной резорбции, что хорошо согласуется с данными о накоплении этого генотипа среди больных ОП и в среднем более низких значениях МПКТ позвоночника.
Для полиморфизма гена ВМР4 ассоциаций с уровнями кальция и фосфора не выявлено.
Таблица 7
СРЕДНИЕ ЗНАЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В ГРУППЕ БОЛЬНЫХ ОП (ЕД)
AA 176,1±61,9 (n=53)
AV I76,8±57,9(n=46)
W 204,9±43,9 (n=19)
р между АА и УУ генотипами = 0,03 р между АУ и УУ генотипами = 0,03 Коэффициент корреляции Спирмена г=0,1б (р=0,08)
Таблица S
СРЕДНИЕ ЗНАЧЕНИЯ CROSSLAPS В ГРУППЕ БОЛЬНЫХ ОП (НГ/МЛ)
AA 0,63±0,25 (n=18)
AV 0,54±0.24(n=16)
W 0,43±0,25 (n=10)
р между АА и W генотипами = 0,03 Коэффициент корреляции Спирмена г=0,29 (р=0,056)
Обсуждение
ВМР4 является важным кандидатным геном для изучения генетического регулирования костной массы и костного ремоделирования. Однако к настоящему времени имеется очень ограниченное число исследований, посвященных изучению роли этого генетического маркера в развитии ОП, и представлены противоречивые результаты, которые отчасти могут объясняться малым количеством пациентов в исследованиях, различиями в расовой принадлежности и менопаузальном статусе. В исследовании, проведенном на итальянской популяции постменопаузальных женщин, не было обнару-
ЛИТЕРАТУРА
1. Chen Y., Cheung К., Kung Н. et al. In vivo new bone formation by direct transfer of adenoviral-mediated bone morphogenetic protein-4 gene. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002,298,121127.
2. Cheng H., Jiang W., Phillips F. et al. Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenetic proteins (BMPs). J. Bone Joint Surg.,2003,85-A, 1544-1552.
3. Shafritz A., Shore E., Gannon E et al. Overexpression of an osteogenic morphogen in fibrodysplasia ossificans progressiva. New Eng. J. Med.,1996,335,555-561.
жено никаких ассоциаций данного генетического маркера с ОП [4], тогда как в крупном исследовании, изучившем австралийских постменопаузальных женщин, была обнаружена ассоциация полиморфизмов гена ВМР4 с МПКТ проксимального отдела бедра [5]. Обследование молодых корейцев (20-39 лет) обоих полов также выявило ассоциации между полиморфизмами генов ВМР и МПКТ периферических отделов скелета [6].
В данной работе впервые на российской популяции постменопаузальных женщин проведено исследование ассоциаций полиморфизма гена ВМР4 с МПКТ и маркерами костного ремоделирования.
Анализ частотного распределения генотипов АА, АУ, УУ в группе больных ОП и в группе контроля показал накопление гомозиготного генотипа АА в группе больных и уменьшение среди них числа гетерозигот АУ Риск для носителей гомозиготного генотипа АА заболеть ОП превышал априорный в 2,3 раза. Носители данного генотипа имели более низкие показатели МПКТ в поясничном отделе позвоночника по сравнению с носителями генотипа АУ
Обнаружена ассоциация определенных генотипов с уровнями маркеров костного ремоделирования (щелочной фосфатазой и сигаре): носители генотипа АА имели в целом более низкие значения щелочной фосфатазы и более высокие значения сгс^арэ, что указывает, по-видимому, на большую интенсивность костной резорбции и меньшую интенсивность костеобразования у этих индивидумов. Эти результаты согласуются с данными о накоплении этого генотипа среди больных ОП и в среднем более низких показателях МПКТ позвоночника.
Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что полиморфизмы гена ВМР4 могут оказывать влияние на риск развития ОП, воздействуя на процессы остеобластогенеза и костеобразования. Необходимы дальнейшие крупные популяционные изучения ассоциаций полиморфизмов гена ВМР4 для определения вклада данного генетического маркера в развитие заболевания.
4. Semprini S., Mango R., Brancati F. et al. Absence of correlation between BMP-4 polymorphism and postmenopausal osteoporosis in Italian women. Calc if. Tissue Int.,2000,67(l),93-94.
5. Ramesh Babu L., Wilson S., Dick I. et al. Bone mass effects of a BMP4 gene polymorphism in postmenopausal women. Bone,2005,36(3),555-561.
6. Choi J., Shin C., Hong Y. et al. Single-nucleotide polymorphisms and haplotypes of bone morphogenetic protein genes and peripheral bone mineral density in young Korean men and women. Calcif. Tissue Int.,2006, 78(4),203-211.
Поступила 03.09.06
Abstract
K.A Madova, M.Y. Kr)Uo% N.k Toroptsova, O.A. iMkMnskaya, T.A. Korotkova, E.E. AfihiffloV) V.A. Myakotkin, L.J. Benevolenskaya.
BMP4 gene polymorphisms association with bone mineral density and bone metabolism markers
Objective. To study BMP4 gene polymorphisms effect on bone mineral density (BMD) and bone remodeling markers in healthy postmenopausal women and women with osteoporosis. Material and methods. 272 women were dilivered in 2 groups from BMD: postmenopausal women (control group) and women with osteoporosis
Results. Significant association of exon 4 6007C->T polymorphism with lumbar spine BMD and bone remodeling markers was revealed. This polymorphism encodes amino acid substitution in polypeptide sequence (C allele encodes alanin and T allele — valine). Homozygous AA genotype accumulation was revealed in group of pts with osteoporosis. Carriers of this genotype showed significantly lower spine BMD values in comparison with AV genotype carriers. Healthy control did not have such a relationship. Mean values of femoral neck BMD did not correlate with homozygous AA genotype in pts with osteoporosis and in control group. But mean spine and femoral neck BMD values were significantly lower in carriers of all three genotypes (mean by 26%) than in control (p=0,001). Study of alkaline phosphatase concentration variability and crosslaps in pts with osteoporosis revealed lower alkaline phosphatase mean value and higher crosslaps mean value in genotype AA carriers
Conclusion. Gene BMP4 6007C-VT polymorphism leads to substitution of alanin (in presence of C allele) to valin (in presence of T allele) in BMP4 protein polypeptide sequence what modulates its functional activity. This polymorphism is associated with lumbar spine BMD and bone remodeling level in postmenopausal women.
Key words: osteoporosis, VDR gene polymorphism, bonemineral density.
