CC BY
68
Заключение. Таким образом, результаты проведённого исследования свидетельствуют о способности антиоксиданта а-токоферола оказывать психомодулирующее воздействие в условиях экспериментальной гипокинезии, устраняя депрессивноподобные нарушения в поведении животных.
Литература
1. Воронина, Т.А. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ /Т.А. Воронина, С.Б. Середенин // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.- М.: ИИА «Ремедиум», 2000.-С.126-130.
2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц.- М.: Практика, 1999.- 459 с.
3. Калуев, А.В. Принципы экспериментального моделирования тревожно-депрессивного патогенеза / А.В. Калуев // Нейронауки.- 2006.- №1.- С. 46-56.
4. Пшенникова, М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии / М.Г. Пшенникова // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 2000.- № 2.- С. 24-31.
5. Miguel, Z.De. Behavioral coping strategies in response to social stress are associated with distinct neuroendocrine, monoaminergic and immune response profiles in mice / Z.De Miguel, O.Vegas, L.Garmendia// Be-hav. Brain Res.- 2011.- № 8.- Р. 12.
УДК 576.32I36.577.4
ВЛИЯНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОКАПСУЛ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ФАГОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭНДОТОКСИНОВ
О.Ю. КОЧЕТКОВА*, М.М. ЮРИНСКАЯ*, Л.И. ШАБАРЧИНА**, С.А. ТИХОНЕНКО**, М.Б. ЕВГЕНЬЕВ***,
С.В. ГРАЧЕВ****, М.Г. ВИНОКУРОВ*
'ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, ул. Институтская, 3, г.Пущино, 142290 "ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, ул. Институтская, 3, г. Пущино, 142290 '"ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, ул. Вавилова, д. 32, Москва, 119991 ""ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, г. Москва, 119991
Аннотация: было исследовано влияние инкапсулированного в полиэлектролитные микрокапсулы белка теплового шока на фагоцитоз и продукцию активных форм кислорода клетками RAW264. Показано, что при взаимодействии микрокапсул (с белком теплового шока) с клетками RAW264 снижается продукция активных форм кислорода.
Ключевые слова: белки теплового шока, полиэлектролитные микрокапсулы.
EFFECT OF POLYELECTROLYTE MICROCAPSULES ON FUNCTIONAL PROPERTIES OF MAMMALS
PHAGOCYTES AT ENDOTOXIN ACTION
O.YU. KOCHETKOVA*, M.M. YURINSKAYA*, L.I. SHABARCHINA**, S.A. TIKHONENKO**, M.B. EVGENOV***,
S.V. GRACHEV ****, M.G. VINOKUROV*
'Institute of of Cell Biophysics Russian Academy of Science, Pushchino "Institute of of Theoretical and Experimental Biophysics Russian Academy of Science, Pushchino '''Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences, Moscow ""I.M. Sechenov First Moscow State Medical University
Abstract: the effect of encapsulated in polyelectrolyte microcapsules heat shock protein on production of reactive oxygen species (ROS) by RAW264 was investigated. It is shown that the interaction of microcapsules (with Hsp70) with RAW264 there is a decrease ROS production.
Key words: heat shock proteins, polyelectrolyte microcapsules.
Фагоциты играют важную роль в ответе организма человека на действие эндотоксинов (липополи-сахариды - LPS) - компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий. LPS участвуют в различных патологических процессах в организме мле-
копитающих при грамотрицательном сепсисе и других заболеваниях [1]. В распознавании эндотоксинов клетками врожденного иммунитета участвуют Tool -подобные рецепторы (TLR4). При действии LPS происходит формирование гетеродимерного рецепторно-
го комплекса (TLR4- LPS-MD-2) в мембране клеток-мишеней [2]. Затем сигнал передается от рецептора к факторам транскрипции клеток-мишеней и развивается клеточный ответ, включающий синтез про-воспалительных цитокинов, увеличение активности НАДФН-оксидазы [3].
При воспалительных заболеваниях наблюдается увеличение экспрессии белков теплового шока (БТШ). Эндотоксины увеличивают синтез и накопление БТШ в различных миелоидных клетках, в частности БТШ70, играющего важную роль в механизмах защиты организма от теплового и других видов стресса [4]. В последнее время было показано, что экзогенный БТШ70 оказывает защитное действие на клеточные культуры и увеличивает выживаемость животных в модели сепсиса [5,6].
При введении БТШ70 в кровяное русло происходит быстрое снижение его свободной концентрации в кровяном русле из-за его связывания с различными клетками и компонентами крови. Одним из путей решения этой проблемы может стать адресная доставка БТШ70 и других соединений в клетки с помощью полиэлектролитных микрокапсул. Это позволит существенно повысить эффективность действия лекарственных препаратов и значительно уменьшить их общую концентрацию в организме и, как результат, снизить побочные эффекты от их применения.
Цель исследования - изучение влияния поли-электролитных микрокапсул на функциональные свойства фагоцитов млекопитающих.
Материалы и методы исследования. В работе были использованы реактивы фирмы Sigma (USA).
Клетки RAW264 (клеточная линия макрофагов мыши, получена из коллекции ATCC, USA), культивировали в 4-луночных планшетах (Nunc) по 1х106 клеток на лунку в 1 мл в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка, 1% L-глютамина, 1% стрептомицина, 100 ед. пенициллина при 37°С, 5%С02 в течение 24 часов [7]. Затем культуральную среду удаляли, лунки с клетками промывали, добавляли в лунку по 1 мл свежей культуральной среды с 1 мкг/мл LPS, культивировали 24 часа. Затем добавляли капсулы в соотношении клетки: капсулы = 1:2 и культивировали еще 24 часа.
Полиэлектролитные микрокапсулы формировали методом послойной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов (ПЭ) декстран сульфата (DS) и полиаргинина (P. arg ) на CaCO3 микрочастицах диаметром 3,5-5 мкм, которые получали копреципитацией эквивалентных объемов растворов CaCl2 и Na2CO3 с концентрациями 0,33 М [8]. Для нанесения первого ПЭ слоя CaCO3 микрочастицы рес-спендировали в водном растворе полианиона DS (2 мг/мл), содержащем 0,5 М NaCl, и инкубировали при интенсивном перемешивании на шейкере в течение 15 мин, затем центрифугированием частицы отделяли от супернатанта и осадок трижды промы-
вали раствором 0,5 М NaCl от несвязавшегося полиэлектролита. Далее проводили нанесение поликатиона P. arg в тех же условиях. После нанесения необходимого числа ПЭ слоев карбонатную матрицу растворяли в 0,2 М растворе ЭДТА (рН 7,0). Полученные микрокапсулы трижды промывали водой и хранили в виде суспензии при 40С. В работе были использованы микрокапсулы с архитектурой (DS/ P. arg)3., в которых наружный слой был заряжен либо положительно, либо отрицательно [8]. В последнем слое использовали полиаргинин, меченый флуорес-цеином изотиоцианатом (FITC). Встраивание БТШ70 в микрокапсулы проводили на стадии формирования карбонатного ядра.
Фагоцитоз определяли методом флуоресцентной микроскопии (микроскоп Keyence BZ 8100E). Клетки культивировали в культуральной среде в течение 24 час с полиэлектролитными микрокапсулами в соотношении (1:2) в присутствии и отсутствии LPS. Фагоцитоз регистрировали при культивировании клеток в течение 60 мин в присутствии 1% три-панового синего (для контроля жизнеспособности клеток и достоверного определения фагоцитоза (т.к. трипановый синий тушит флуоресценцию FITC и таким образом позволяет различать фагоцитированные и не фагоцитированные микрокапсулы)).
Праймирование нейтрофилов проводили по [5] с некоторыми модификациями. RAW264 в HBSS (1х106 клеток/мл) были праймированы 1 мкг /мл LPS в течение 30 мин при 370С. Образцы помещали в люминометр 1250 LKB (Швеция). Клетки были стимулированы с 200 нМ форбол 12-миристат 13-ацетата в присутствии 35 мкМ люминола. Хемилю-минесценцию (ХЛ) регистрировали в течение 15 мин.
Экспериментальные данные анализировали с помощью программ Image J и SigmaPlot.
Lid
Рис. 1. Фагоцитоз микрокапсул клетками ИАШ264 в отсутствие (1) и присутствие 1 мкг/мл LPS. а - отрицательно заряженные микрокапсулы, б - положительно заряженные микрокапсулы. Сравнивали между собой данные фагоцитоза в отсутствие LPS (1) с данными фагоцитоза в присутствие LPS (р=0,001; п=8)
Результаты и их обсуждение. Исследование фагоцитоза клетками КАШ264 микрокапсул показало, что эти клетки в отсутствии липополисахарида фагоцитировали положительно- и отрицательнозаряженные микрокапсулы примерно на одинаковом
60
50
30
20
10
уровне (20-25%). При добавлении ЪРБ процент фагоцитирующих клеток увеличивался до 43% и практически не зависел от заряда микрокапсул (рис. 1).
Изучение влияния «пустых» микрокапсул и микрокапсул со встроенным белком БТШ70 на фагоцитоз показало, что поглощение клетками КЛШ264 капсул с белком и без белка практически не различается (данные не приведены).
Исследование влияния встроенного в микрокапсулы БТШ70 на продукцию активных форм кислорода макрофагами показало, что наиболее активирующим продукцию АФК действием на клетки КЛШ264 обладали микрокапсулы без белка, активация составляла примерно 400% (рис. 2). В то же время белоксодержащие капсулы активировали клетки примерно на 200%. Это может свидетельствовать о том, что инкапсулированный БТШ70 обладает защитными свойствами, т.к. продукция активных форм кислорода клетками в его присутствии уменьшается. Некоторое увеличение продукции АФК клетками при фагоцитозе всех видов капсул (по сравнению с контролем) связано, по-видимому, с некоторой активацией клеток вследствие фагоцитоза, т.к. для фагоцитов известна взаимосвязь сигнальных путей увеличения экспрессии факторов адгезии и активности НАДФН-оксидазы [9].
JL
11
Рис. 2. Влияние микрокапсул на продукцию активных форм кислорода клетками RAW264. ХЛ - хемилюминесценция (в % от контроля). 1 - микрокапсулы с нейтрофилами с БТШ70; 2 - микрокапсулы с нейтрофилами без БТШ70. а - отрицательно заряженные микрокапсулы, б - положительно заряженные микрокапсулы. Сравнивали между собой данные ХЛ для микрокапсул с белком БТШ70 для отрицательно и положительно заряженных капсул с данными ХЛ микрокапсул без белка: 1а и 2а (р=0,001; п=5) и 1б и 2б (р=0,001; п=5)
Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют как о возможном основном механизме действия внеклеточного белка БТШ70 - его воздействие на семейство Тоо1-подобных рецепторов. Вместе с тем известно, что внеклеточный белок может проникать через клеточную мембрану внутрь клеток. Исследо-
вания, выполненные нами ранее, показали, что этот белок значительно снижает активацию различных фагоцитов под действием эндотоксинов, в частности, происходит снижение продукции АФК нейтрофи-лами и моноцитами [5], уменьшается секреция TNFa при действии LPS и липотейхоевой кислоты [6]. Эти результаты не позволяют однозначно судить о механизме действия белка.
Полученные результаты по действию встроенного белка БТШ70 в микрокапсулы показывают, что защитное действие этого белка от активации фагоцитов эндотоксином может реализовываться через внутриклеточный механизм.
Литература
1. Bacterial sensing, cell signaling, and modulation of the immune response during sepsis / R. Salomao [et al.].- Shock.- 2012.- Vol. 38 (3).- P. 227-242.
2. The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex / B.S. Park [et al].-Nature.- 2009.- Vol. 458 (7242).- P. 1191-1195.
3. LPS-induced cytokine production in human monocytes and macrophages / M. Rossol [et al.].- Crit Rev Immunol.- 2011.- Vol. 31 (5).- P. 379-446.
4. Tsan, M.F. Heat shock proteins and immune system / M.F. Tsan, B. Gao // J Leukoc Biol.- 2009.- Vol. 85 (6).- P. 905-910.
5. Exogenous mammalian extracellular HSP70 reduces endotoxin manifestations at the cellular and organism levels / E. Rozhkova [et al.]// Annals of the New York Academy of Sciences.- 2010.- Vol. 1197.- P. 94-107.
6. Recombinant human Hsp70 protects against lipo-teichoic acid-induced inflammation manifestations at the cellular and organismal levels / M. Vinokurov [et al.].-Cell Stress Chaperones.- 2012.- Vol. 17 (1).- P. 89-101.
7. Ampelopsin reduces endotoxic inflammation via repressing ROS-mediated activation of PI3K/Akt/NF-KB signaling pathways / S. Qi [et al].- Int Immunopharma-col.- 2012.- Vol. 12 (1).- P. 278-287.
8. She, Z. Mechanism of protein release from polyelectrolyte multilayer microcapsules / Z. She, M.N. Antipina, J. Li, G.B. Sukhorukov // Biomacromolecules.-2010.- Vol. 11 (5).- P.1241-1247.
9. Винокуров, М.Г. Регуляция апоптоза нейтро-филов при действии липополисахаридов / М.Г. Винокуров, М.М. Юринская // Биологические мембраны.- 2010.- Т.27.- №1.- С. 18-27.
