CC BY
52
УДК 616.24+616.348]-006.6:611.13/.16
Н.В. Хромова1, П.Б. Копнин2, Е.В. Степанова1, Б.П. Копнин1
ВЛИЯНИЕ ПОДАВЛЕНИЯ СИНТЕЗА VEGF-C В КЛЕТКАХ РАКА ЛЕГКОГО
И ОБОДОЧНОЙ кишки человека на их рост,
МИГРАЦИОННУЮ И АНГИОГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ
:РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва
Контактная информация:
Хромова Наталья Викторовна, научный сотрудник лаборатории цитогенетики НИИ канцерогенеза.
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-57-22; моб. +7(916)700-88-60
e-mail: nakhromova@yandex.ru
Статья поступила: 04.05.2009 г., принята к печати: 23.09.2009 г.
Резюме
VEGF-C играет важную роль в процессах канцерогенеза, регулируя опухолевый лимфангиогенез и, в меньшей степени, гемангиогенез. Кроме того, он обладает способностью стимулировать пролиферацию и миграцию опухолевых клеток. В настоящей работе исследована возможность ингибирования опухолевого роста путем подавления экспрессии VEGF-C. С этой целью создана лентивирусная конструкция, экспрессирующая siVEGF-C. Обнаружено, что трансдукция этой конструкции в клетки рака толстой кишки (линия НСТ116) и рака легкого (линия А549) человека, значительно понижающая содержание в них мРНК VEGF-C, уменьшает скорость прироста числа клеток и миграционную активность клеток in vitro, ингибирует образование кровеносных и лимфатических сосудов в их ксенографтах у бестимусных мышей и, как следствие, замедляет скорость опухолевого роста. Полученные данные указывают на то, что VEGF-C может представлять собой новую перспективную мишень для таргетной противоопухолевой терапии.
Ключевые слова: рак, VEGF-C, VEGFR-3, ангиогенез, лимфангиогенез.
N.V. Khromova1, P.B. Kopnin2, E.V. Stepanova1, B.P. Kopnin1 EFFECT OF SUPPRESSION VEGF-C SYNTHESIS IN HUMAN LUNG AND COLON CARCINOMA CELLS ON THEIR GROWTH, MIGRATORY AND ANGIOGENIC ACTIVITY
'N.M. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Moscow
Abstract
VEGF-C plays an important role in oncogenesis, regulating tumor lymphangiogenesis and, to a lesser degree, hemangiogenesis. In addition, it is able to stimulate proliferation and migration of tumor cells. In the present study possibility of inhibition of tumor growth by suppression of VEGF-C expression was investigated. For this purpose we created lentiviral vector expressing siVEGF-C. It was found that transduction of this construct into human colon (НСТ116) and lung ^549) carcinoma cells, considerably reduced content of mRNA VEGF-C, decreased cell proliferation and migration in vitro, inhibited formation of blood and lymphatic microvessels in tumor xenografts, and, as a result, diminished tumor growth rate. These data suggest that VEGF-C may be novel perspective target for anticancer therapy.
Key words: cancer, VEGF-C, VEGFR-3, angiogenesis, lymphangiogenesis.
Введение
УЕвР-С, представитель семейства гепарин-связывающих факторов роста, может играть важную роль в процессах канцерогенеза [11; 16; 17]. Его взаимодействие с рецепторами VEGFR3 и \eGfr2 (\EGFR3 связывает УЕвР-С со значительно большей аффинностью, чем VEGFR2) активирует ряд внутриклеточных сигнальных путей (Ras-MAPK и др.), регулирующих размножение и миграцию клеток [5; 8; 16; 19; 20]. Основная мишень VEGF-C - VEGFR3 присутствует на поверхности эндотелиальных клеток лимфатических сосудов, некоторых других типах нормальных клеток (остеокласты, тимоциты, субпопуляция моноцитов периферической крови) и многих типах опухолевых клеток [16]. VEGFR2, главным образом, экспрессируются в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и, в меньших количествах, в их предшественниках [1; 13]. Интересно, что в опухолевых сосудах экспрессия
VEGFR2 в 3-5 раз выше, чем в сосудах нормальных тканей. Другие клетки опухолевых тканей (неопластические и стромальные), как правило, содержат значительно меньшие количества VEGFR2 [16; 17]. При этом аффинность VEGFR2 к VEGF-C существенно ниже, чем к VEGF-A, играющему ключевую роль в регуляции роста кровеносных сосудов в нормальных и опухолевых тканях. Это дало основание рассматривать VEGF-C как фактор, регулирующий, в первую очередь, лимфангиогенез. Подобно гемангиогенезу, опухоли могут индуцировать формирование собственной сети лимфатических сосудов, соединяющейся с окружающими лимфатическими сосудами. Перемещение опухолевых клеток по лимфатическим сосудам представляет собой один из способов метастазирования. Считается, что увеличение продукции лимфангиогенных факторов может стимулировать формирование дополнительных лимфатических сосудов, таким образом, обеспечивая распространение опухолевых клеток.
VEGF-C индуцирует не только внутриопу-холевый лимфангиогенез, но и количество лимфатических сосудов вокруг опухоли. Считается, что именно эти периферические лимфатические сосуды принимают участие в лимфогенном метастазирова-нии [18; 21].
До недавнего времени исследования цитоки-нов семейства VEGF были сосредоточены на их функциях как паракринных стимуляторах ангиогенеза и лимфангиогенеза. VEGF-А и его рецепторы VEGFR-1/2 коэкспрессируются в ряде опухолей, включая рак молочной железы, рак простаты, толстой кишки, поджелудочной железы, указывая на то, что VEGF-А может непосредственно влиять на рост опухолевых клеток через аутокринный механизм [2; 4; 14].
Недавно было обнаружено, что VEGF-С, подобно VEGF-А, может принимать участие не только в паракринной, но и в аутокринной регуляции размножения и миграции неопластических клеток при раке желудка [9].
На многих экспериментальных моделях было показано, что гемангиогенез в основном стимулируется за счет взаимодействия VEGF-А и VEGF-В с VEGFR-1/2, тогда как VEGF-C/VEGFR-3 - сигнализация является ключевым регулятором опухолевого лимфангиогенеза.
Таким образом, разрушение взаимодействия ростовой фактор/рецептор является современной стратегией для развития изучения противоопухолевых препаратов.
В последние годы убедительно продемонстрировано, что подавление функции VEGF-A с помощью терапевтического антитела (бевацизумаб) препятствует образованию в опухолях кровеносных сосудов и, как следствие, замедляет прогрессию новообразований [6; 12].
Это дало основание рассматривать такой подход как один из наиболее перспективных в т.н. таргетной (направленной) противоопухолевой терапии. В то же время возможный терапевтический потенциал ингибирования УБвР-С пока практически не изучен.
В настоящей работе исследованы возможные последствия для опухолевого роста подавления продукции УБвБ-С. Для ингибирования синтеза УБвБ-С нами был создан лентивирусный вектор, экспрессирующий специфичную шпилечную РНК. В качестве экспериментальной модели использованы человеческие клетки рака легкого А549 и рака ободочной кишки линии НСТ116. Полученные данные показывают, что подавление продукции УБвБ-С может замедлять рост и прогрессию опухолей как за счет блокирования аутокринной регуляции размножения и миграции неопластических клеток, так и в результате прерывания паракринной стимуляции гемангиогенеза и лимфангиогенеза. Очевидно, УБвБ-С представляет собой еще одну перспективную молекулярную мишень, подавление функции которой может найти применение в лечении онкологических больных.
Материалы и методы
Клеточные линии
Использованы линия клеток аденокарциномы легкого человека А549 (АТСС #ССЬ-185), линия клеток рака ободочной кишки человека НСТ116, (р53+/+, АТСС #ССЬ-247) и ее сублиния НСТ116/р53-/-с гомозиготным нокаутом гена р53.
Клетки культивировали в среде БМБМ с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллина/стрептомицина при 37 °С и 5%-ным содержанием СО 2.
Создание конструкции, экспрессирующей siVEGF-C
При создании конструкции, экспрессирующей siVEGF-C, мы использовали лентивирусный вектор рЬКО.1-риго (Sigma). Для получения вектора, стабильно экспрессирующего siVEGF-C, были синтезированы олигонуклеотиды (Evrogen): во-первых, для shVEGF-C №1 -
CCGGCGCGACAAACACCTTCTTTAACTCGAGTTAAAGAAGGTGTTTGTCGCGTTTTTG; для shVEGF-C №2 - CCGGCCCACAAAGAACTAGACAGAACTCGAGTTCTGTCTAGTTCTTTGTGGGTTTTTG и, во-вторых, комплементарная им последовательность ДНК. Образованный в результате гибридизации указанных олигонуклетидов фрагмент двуцепочечной ДНК, в состав которого была включена дважды повторяющаяся последовательность shVEGF-C (выделена жирным курсивом), гомологичная участку человеческой мРНК гена VEGF-C, была клонирована в вектор рЬКО.1-рито по сайтам рестрикции эндонуклеаз AgeI и EcoRI.
Получение клеточных линий, экспрессирующих siVEGF-C
Для липофекции эукариотических клеток был использован реагент ExGen 500 (Fermentas). ДНК (pLKO.1-shVEGF-C), хелперные плазмиды dR 8,2 и pVSV-G, 150мМ NaCl и ExGen 500 смешивали согласно протоколу фирмы производителя и по каплям добавляли к клеткам-упаковщикам 293Т, выращенным до состояния 70% монослоя. Через 12 часов культуральная среда заменялась свежей.
Последующее заражение линии А549 и сублиний НСТ116 рекомбинантными вирионами, полученными через 24; 48; 72 ч после липофекции, проводили, используя супернатант культур пакующих клеток. Селекция проводилась с использованием пуромицина в течение 5 дней.
Определение уровня экспрессии VEGF-C методом ОТ-ПЦР
Тотальную мРНК выделяли с помощью TRI Reagent (Sigma). Реакцию обратной транскрипции проводили, как описано ранее [10]. Для определения уровня экспрессии VEGF-C использовали праймеры: прямой 5’- CAGTTACGGTCTGTGTCCAGTGTAG -3’, обратный 5’- GGACACACATGGAGGTTTAAAGAAG -3’; уровень экспрессии VEGFR-3 определяли, используя праймеры: прямой 5’- CTTGTCGGTACCGGCGTCATC -3’ и обратный 5’- GAGGATCTTGAGCTCCGACATCAG -3’; для выравнивания к-ДНК использовали праймеры к а-тубулину: прямой 5’- GTTGGTCTGGAATTCTGTCAG -3’, обратный 5’- AAGAAGTCCAAGCTGGAGTTC -3’.
Определение скорости роста клеточных культур
Клетки А549 и сублиний НСТ116 рассевали в 6-луночные плашки по 50 000 и 25 000 соответственно. Для определения скорости роста проводился подсчет количества клеток в культуре в камере Горяева с интервалом в 2 сут. Счет продолжался до момента образования монослоя.
Определение миграционной активности клеток
Проводилось как описано ранее [15]. В лунки 24-луночной плашки вставляли камеру Бойдена с диаметром пор 8 мкм, внутрь которой сеяли 50 тысяч клеток. Инкубировали 24 часа при 37 Си 5%-ном содержании СО2 в среде БМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки, оставшиеся сверху в камере, убирали ватной палочкой, мигрировавшие клетки фиксировали метанолом и окрашивали трипановым синим. Миграционная активность определялась подсчетом числа клеток на нижней поверхности мембраны в 10 полях зрения, используя объектив 20*.
Анализ роста опухолевых ксенографтов
В работе использовались самки бестимусных мышей линии Б2*1 в возрасте 6-8 недель. Каждому животному подкожно прививалось по 2 опухоли (106 клеток, суспендированных в 100 мкл физиологического раствора). Размер опухолей измерялся каждые 3 дня, их объем высчитывался по формуле:
(ширина)2 х (длина) *0,5
Продолжительность эксперимента составляла 3 нед. для роста ксенографтов НСТ116 и 5-6 нед. для роста ксенографтов А549.
Иммуногистохимический анализ препаратов тканей опухолей
Проводили, как описано ранее [7]. Ткани опухолей фиксировались в 4%-ном формалине в течение 24 ч и заключались в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивались антителами к СБ34 (550537, ББ РИагш^еп) и ЬУУЕ-1(103-РЛ508, ЯеНаТееЬ вшЬН). Связывание первичных антител детектировалось с помощью проявочной системы ЕпУ1зюп-НКР (Бако). После этого препараты окрашивали гематоксилином.
Подсчет СБ34-позитивных кровеносных сосудов и капилляров проводился под микроскопом при увеличении *100.
Г емангиогенез в опухолях оценивался по среднему суммарному количеству сосудов с просветами, относительно крупных (>100 мкм) сосудов, и недоразвитых сосудов как описано нами ранее [7]. Подсчет внутриопухолевых ЬУУЕ-1-позитивных лимфатических сосудов проводился при увеличении *200. В каждой экспериментальной группе исследовали срезы 8-12 опухолей, для каждой опухоли анализировали 20 полей зрения.
Результаты и обсуждение
Схема получения лентивирусных конструкций, экспрессирующих $\УЕОЕ-С представлена подробно описана в разделе «Материалы и методы».
Для проверки работы конструкций рЬКО.1-бИУЕОР-С мы провели инфекцию линий А549, НСТ116 и ее сублинии НСТ116 р53—/— с гомозиготным нокаутом р53. В качестве контроля опухолевые клетки инфицировались вектором, экспрессирующим ъЮЕР.
Полуколичественный метод ОТ-ПЦР показал, что введение обеих конструкций риКО.1-$ЬУЕОЕ-С приводит к существенному снижению уровня мРНК УЕОЕ-С в клетках линии А549 и сублиний НСТ116.
Интересно, что подавление экспрессии ¥ЕОЕ-С приводило к существенному снижению уровня мРНК гена УЕОЕЯЗ, кодирующего (рис. 1) рецептор УЕвБ-С (механизмы такой регуляции пока неясны).
VEGF-C VEGFR-3 а-тубулин
А549 НСТ116 НСТ116 р53-/~
Рис. 1. Трансдукция лентивирусной конструкции pLKO.1-shVEGF-C приводит к снижению содержания мРНК VEGF-C и VEGFR-3 в клетках A549, HCT116 и HCT116/p53-/- (анализ содержания мРНК а-тубулина использован для контроля количества нанесенных образцов). Представлены типичные данные одного из трех экспериментов.
А)
Ъ 250
0 200
1
о 150
ЕЗ
р 100
о
50
о
Б)
250
Ь
—1 200
¡аГ
0
1 150
н 100
(U
о 50 О
1 3 5 7 9 11
Дни инкубации
Рис. 2. Влияние подавления экспрессии VEGF-C на скорость размножения культивируемых in vitro клеток HCT116 (А) и А549 (Б): Клетки рассевали в 6-луночные плашки и подсчитывали их количество каждые 2 дня, как описано в разделе Материалы и методы. Каждая точка - средние величины для 3 лунок; представлены типичные данные одного из трех экспериментов.
Эти результаты дали основание для дальнейших исследований последствий ингибирования сигнализации VEGF-C/VEGFR-3 для роста и миграции опухолевых клеток.
Во-первых, мы исследовали изменения поведения клеток с подавленной экспрессией VEGF-C в культурах in vitro. Оказалось, что снижение экспрессии VEGF-C тормозит скорость размножения как р53-позитивных (A549, HCT116), так и р53-дефицитных (рис. 2) клеток (НСТ116 р53-/-).
Кроме того, ингибирование экспрессии VEGF-C приводит к двукратному снижению миграционной активности р53-позитивных клеток линий А549 и НСТ116, тогда как клетки НСТ116/р53-/-, экспрессирующие siVEGF-C, не демонстрировали достоверного подавления миграционной способности (рис. 3).
Возможно, это связано с тем, что р53-негативные клетки характеризуются исходно низкой миграционной активностью, и подавление VEGF-C уже не может оказать существенного дополнительного влияния на их миграцию.
В целом результаты экспериментов in vitro указывают на существенную роль VEGF-C в ауток-ринной регуляции размножения и миграционной активности клеток рака легкого и рака ободочной кишки человека.
Рис. 3. Влияние подавления экспрессии ¥ЕОЕ-С на миграционную способность НСТ116 (А) и А549 (Б):
Клетки рассевали в камеры Бойдена с диаметром пор 8 мкм, миграция оценивалась подсчетом клеток, прошедших через поры, как описано в разделе «Материалы и методы». Представлены типичные данные одного из трех экспериментов.
А)
HCT116-shVEGF-C
-и- р53 +/+ shGFP -А- р53 +/+ shVEGF-C 1 -#-р53+/+ shVEGF-C 2 -Н- р53 -/- shGFP -А-р53 -/- shVEGF-C 1 -©- р53 -/- shVEGF-C 2
Б)
16 19 22
Дни после прививки A549-sh VEGF-С
Дни после прививки
Рис. 4. Влияние подавления экспрессии УЕОЕ-С на скорость роста подкожных ксенографтов клеток НСТ116 (А) и А549 (Б) в бестимусных мышах: Прививку опухолевых клеток и измерение размеров опухолей проводили, как описано в разделе «Материалы и методы». Приведены типичные данные, полученные при анализе 8-12 опухолей в каждом из трех экспериментов.
Ингибирование скорости роста опухолевых клеток с подавленной экспрессией VEGF-C наблюдалось не только в культурах in vitro, но и in vivo при подкожной прививке иммунодефицитным мышам. При этом существенное торможение опухолевого роста обнаруживалось во всех исследованных линиях клеток вне зависимости от сохранения в них активности опухолевого супрессора р53 (рис. 4).
А)
shGFP
sh VEGF-C
ov
ТГ
in
<
ш mm
V tía. : *. '
Рис. 5. Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей НСТ116 и А549 антителами на СБ34 (А) и ЬУУЕ-1 (Б). Представлены типичные поля зрения.
Замедление опухолевого роста могло быть связано не только с прерыванием аутокринной стимуляции пролиферации неопластических клеток, но и с ингибированием образования в опухолях кровеносных сосудов вследствие способности УЕвБ-С к низкоаффинным взаимодействиям с УЕвБЯ-2 [16]. Для проверки этого предположения был проведен анализ срезов опухолей, окрашенных антителами на СБ34 -маркер кровеносного эндотелия (см. рис. 5А).
Мы обнаружили, что подавление экспрессии VEGF-C не оказывает достоверного эффекта на содержание кровеносных сосудов в опухолях, формируемых р53+ клетками A549 и НСТ116, тогда как в р53- опухолях НСТ116/р53-/-, в которых уровень экспрессии VEGF-C исходно ниже (см. выше), дополнительное ингибирование VEGF-C приводит к уменьшению количества крупных сосудов и сосудов с просветами (см. табл.). Таким образом, не исключено, что при невысоком уровне продукции VEGF-C подавление его синтеза/функции может тормозить опухолевый рост как за счет ингибирования аутокринной стимуляции пролиферации неопластических клеток, так и за счет уменьшения их гемангиогенной активности.
Согласно общепринятым представлениям основная функция VEGF-C заключается в индукции лимфангиогенеза.
Мы решили проверить, влияет ли подавление синтеза VEGF-C на лимфангиогенную активность опухолевых клеток.
При иммуногистохимическом окрашивании антителами против LYVE-1 - маркера лимфатического эндотелия - мы обнаружили, что в опухолях, формируемых клетками линии НСТ116, лимфатические сосуды не образуются. Поэтому на таких опухолях влияние инактивации VEGF-C на лимфангиогенез оценено быть не могло. Следует заметить, что на клеточной линии рака толстой кишки LoVo была продемонстрирована способность siVEGF-C ингибировать опухолевый лимфангиогенез [3].
С другой стороны, в подкожных ксенографтах клеток А549 присутствуют внутриопухолевые лимфатические сосуды. Их подсчет показал, что подавление экспрессии VEGF-C приводит к существенному ингибированию образования внутриопухолевых лимфатических сосудов (см. рис. 5Б, 6). Очевидно, что такой эффект ингибирования функции VEGF-C должен уменьшить вероятность лимфогенного метастазирова-ния опухолевых клеток. Это предположение проходит в настоящее время экспериментальную проверку.
shGFP shVEGF-C 1 shVEGF-C 2 Рис. 6. Влияние подавления экспрессии VEGF-C на лимфангиогенез в подкожных ксенографтах, формируемых клетками линии А549. Подсчет числа LYVE-1-позитивных лимфатических сосудов проводился, как описано в «Материалах и методах».
Заключение
Полученные результаты показывают, что культивируемые in vitro клетки рака легкого линии А549 и рака ободочной кишки линии, НСТ116 экспрессируют мРНК и VEGF-C, и его рецептора VEGFR-3. Подавление экспрессии VEGF-C в этих клетках, ингибируя аутокринный и паракринный механизмы регуляции, уменьшает их миграционную способность in vitro, скорость роста in vitro и in vivo, гемангиогенную и лимфангиогенную активность in vivo. Вероятно, VEGF-C может быть перспективной молекулярной мишенью для таргетной терапии рака легкого и рака ободочной кишки человека.
Работа поддержана грантами Российского Федерального Агентства по науке и инновациям (контракты № 02.512.11.2102 и № 02.512.11.2195), РФФИ, и Программы поддержки фундаментальных работ по онкологии Центра внедрения ПРОТЕК.
Таблица
Влияние подавления экспрессии VEGF-C на ангиогенную активность клеток линии А549 и сублиний HCT116
Ксенографты Крупные (>100мкм) сосуды Сосуды с просветами СБ34+ структуры без просветов
A549-shGFP A549-shVEGF-C 1 A549-shVEGF-C 2 4,7 ± 0,3 10,7 ± 1,5 8,7 ± 2,1
3,4 ± 0,5 8,6 ± 2,0 10,9 ± 1,9
3,8 ± 0,4 8,7 ± 1,8 14 ± 1,8
HCT116-shGFP HC T116-shVEGF-C 1 HCT116-shVEGF-C 2 1,6 ± 0,5 8,9 ± 2,0 10 ± 3,2
2,3 ±0.3 9,5 ± 1,5 10,2 ± 2,2
2,0 ± 0,4 8,5 ± 1,8 16 ± 2,8
HCT116(p53 -/-)-shGFP HCT116(p53 -/-)-shVEGF-C 1 HCT116(p53 -/-)-shVEGF-C 2 4,2 ± 0,2 15 ± 1,1 10 ± 2,9
3,3 ± 0,3 10,4 ± 1,4 8,5 ± 2,5
2,2 ± 0,5 9,1 ± 1,5 11,2 ± 2,0
Литература
1. Asahara T., Takahashi T., Masuda H. et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells // EMBO J. - 1999. - Vol. 18. - P. 3964-72.
2. Bachelder R.E., WendtM.A., Mercurio A.M. Vascular endothelial growth factor promotes breast carcinoma invasion in an autocrine manner by regulating the chemokine receptor CXCR4//Cancer Res. - 2002. - Vol. 62. - P. 7203-6.
3. He X., Yu X., Liu T. et al. Vector-based RNA interference against vascular endothelial growth factor-C inhibits tumor lymphangiogenesis and growth of colorectal cancer in vivo in mice // Chinese Medical J. - 2008. - Vol. 121. - P. 439-44.
4. Jackson M.W., Roberts J.S., Heckford S.E. et al. A potential autocrine role for vascular endothelial growth factor in prostate cancer // Cancer Res. - 2002. - Vol. 62. - P. 854-9.
5. Ji R.C. Lymphatic endothelial cells, tumor lymphangiogenesis and metastasis: new insights into intratumoral
and peritumoral lymphatics // Cancer Metastasis Rev. - 2006. - Vol. 25. - P. 677-94.
6. Kamba T., McDonald D.M. Mechanisms of adverse effects of anti-VEGF therapy for cancer // Br J Cancer. -2007. - Vol. 96. - P. 1788-95.
7. Khromova N., Kopnin P., Stepanova E. et al. p53 hot-spot mutants increase tumor vascularization via ROSmediated activation of the HlF-1/VEGF-A pathway // Cancer Lett. - 2009. - Vol. 276. - P. 143-51.
8. Kobayashi S., Kishimoto T, Kamata S. et al. Rapamycin, a specific inhibitor of the mammalian target of rapamycin, suppresses lymphangiogenesis and lymphatic metastasis // Cancer Sci. - 2007. - Vol. 98. - P. 726-33.
9. Kodama M., Kitadai Y., Tanaka M. Vascular endothelial growth factor C stimulates progression of human gastric
cancer via both autocrine and paracrine mechanisms // Clin Cancer Res. - 2008. - Vol. 14. - P. 7205-14.
10. Kopnin P.B., Agapova L.S., Kopnin B.P. et al. Repression of sestrin family genes contributes to oncogenic Ras-induced reactive oxygen species up-regulation and genetic instability//Cancer Res. - 2007. - Vol. 67. - P. 4671-8.
11. Laakkonen P., Waltari M., Holopainen T. et al. Vascular endothelial growth factor receptor 3 is involved in tumor angiogenesis and growth // Cancer Res. - 2007. - Vol. 67. - P. 593-9.
12. Lien S., Lowman H.B. Therapeutic anti-VEGF antibodies//Handb. Exp. Pharmacol. - 2008. - Vol. 181. - P. 131-50.
13. Lyden D., Hattori K., Dias S. et al. Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth // Nat. Med. - 2001. - Vol. 7. - P. 1194-201.
14. vonMarschall Z., CramerT., HockerM. et al. De novo expression of vascular endothelial growth factor in human pancreatic cancer: evidence for an autocrine mitogenic loop // Gastroenterology. - 2000. - Vol. 119. - P. 1358-72.
15. Sablina A.A., Chumakov P.M., Kohnin B.P. Tumor-suppressor p53 and its homologue p73a affect cell migration // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 27362-71.
16. Shibuya M., Claesson-Welsh L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis // Exp. Cell. Res. - 2006. - Vol. 312. - P. 549-60.
17. Shibuya M. Differential roles of vascular endothelial growth factor receptor-1 and receptor-2 in angiogenesis // J. Biochem. Mol. Biol. - 2006. - Vol. 39. - P. 469-78.
18. Su J.L., Yen C.J., Chen P.S. et al. The role of the VEGF-C/VEGFR-3 axis in cancer progression // Br. J. Cancer. - 2007. - Vol. 96. - P. 541-5.
19. Timoshenko A. V., Rastogi S., Lala P.K. Migration-promoting role of VEGF-C and VEGF-C binding receptors in human breast cancer cells // Br. J. Cancer. - 2007. - Vol. 97. - P. 1090-8.
20. Wissmann C., Detmar M. Pathways targeting tumor lymphangiogenesis//Clin. Cancer Res. - 2006. - Vol. 12. -P. 6865-8.
21. Wong S., Haack H., Crowley D. et al. Tumor-secreted vascular endothelial growth factor-C is necessary for prostate cancer lymphangiogenesis, but lymphangiogenesis is unnecessary for lymph node metastasis // Cancer Res. - 2005. - Vol. 65. - P. 9789-98.
Н.В. Плявник, Г.А. Серебренникова
ДИЗАЙН КАТИОННЫХ ЛИПИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ НАНОЧАСТИЦ
МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва
Введение. Одним из подходов к лечению рака является использование липидов с простой эфирной связью. Так, коммерчески доступный зарубежный препарат Эдельфозин, основой которого является липид с короткоцепным заместителем при С-2 атоме глицерина, успешно прошел клинические испытания по ингибированию роста различных видов опухолей. Существенным недостатком Эдельфозина является его способность служить инициатором гемолиза, поэтому актуальной задачей является поиск новых липидов алкильного типа, не проявляющих гемолитической активности и обладающих высокими противоопухолевыми свойствами.
Цель исследования. В результате проведенных исследований планируется получить новые катионные глицеролипиды, содержащие в гидрофобной области полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), которые, как известно, способны оказывать противоопухолевое действие. При попадании подобных липидов в клетку в результате гидролиза сложноэфирной связи образуется свободная ПНЖК и положительно заряженный лизоглицеролипид - бесфосфорный аналог Эдельфозина.
Включение липидов такого типа в липосомальные наночастицы приводит к значительному увеличению времени циркуляции их в русле кровотока и снижению гемолитической активности
Материалы и методы. Создание липидов будет осуществляться на основе функционально ориентированного дизайна, который включает в себя поиск и оптимизацию новых универсальных методов синтеза бесфосфорных положительно заряженных глицеролипидов, содержащих остаток полиненасыщенной жирной кислоты в С(2) положении глицерина.
Результаты. К настоящему времени с выходом 74 % синтезирован rac-1-октадецил-3-(wреw-бутилдифенилсилил)глицерин. Введение остатка ПНЖК в С(2) положении глицерина в условиях реакции Мицунобу и удаление защитной группы приведет к ключевому диглицериду, содержащему длинноцепной алкильный и полиненасыщенный ацильный заместители, на основе которого можно синтезировать противоопухолевые катионные липиды с различными полярными «головками и спейсерными группами».
Выводы. На данном этапе разработан метод получения замещенного диглицерида для селективного введения остатка полинена-сыщенной жирной кислоты в С(2) положение глицеринового скелета.
