CC BY
72
ПОВЫШЕНИЕ ТУМОРОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛЕТОК РАКА ОБОДОЧНОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ НСТ116 ЗА СЧЕТ УВЕЛИЧЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ РАКОВЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ ПОДАВЛЕНИИ ЭКСПРЕССИИ Е-КАДГЕРИНА
М.Д. Фармаковская, Н.В. Хромова, Б.П. Копнин, П. Б. Копнин
ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Павел Борисович Копнин pbkopnin@mail.ru
Введение. Для многих злокачественных новообразований человека характерна аберрантная экспрессия или утрата Е-кадге-рина, что является пусковым механизмом для эпителиально-мезенхимального перехода. Прохождение эпителиально-мезен-химального перехода, в свою очередь, может способствовать приобретению трансформированными клетками свойств так называемых раковых стволовых клеток (РСК).
Цель исследования — изучение влияния экспрессии Е-кадгерина на долю РСК в популяции клеток аденокарциномы толстой кишки человека НСТ116.
Материалы и методы. Созданы сублинии клеток НСТ116 с повышенной и подавленной экспрессией Е-кадгерина, в которых мы оценивали долю РСК с помощью тестов на минимальную прививочную дозу, колониеобразование в полужидкой среде, а также определяли профиль экспрессии маркеров плюрипотентности.
Результаты и выводы. Мы показали, что доля РСК в популяции клеток аденокарциномы толстой кишки человека НСТ116 зависит от уровня экспрессии Е-кадгерина. Подавление продукции этого белка приводит к повышенной экспрессии генов, ответственных за плюрипотентное состояние клетки, и увеличению доли РСК через активацию сигнального пути Wnt/ß-катенин. Гиперэкспрессия Е-кадгерина имеет противоположный эффект и снижает количество РСК в популяции клеток НСТ116. Таким образом, в противоопухолевой терапии колоректальногорака могут быть перспективными терапевтические подходы, восстанавливающие экспрессию Е-кадгерина.
Ключевые слова: раковые стволовые клетки, эпителиально-мезенхимальный переход, Е-кадгерин, колоректальный рак
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-3-06-14
E-CADHERIN EXPRESSION DOWNREGULATION ELEVATES TUMOROGENIC POTENTIAL OF HUMAN COLON CANCER CELL LINE HCT116 VIA INCREASE IN CANCER STEM CELLS AMOUNT
M.D. Farmakovskaya, N. V. Khromova, B.P. Kopnin, P.B. Kopnin
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow, 115478, Russia
Introduction. E-cadherin aberrant expression or complete loss is common for a number of human malignant neoplasms, and can be a launching mechanism of an epithelial-mesenchymal transition. Passing through epithelial-mesenchymal transition could in turn promote to the acquisition of so called cancer stem cellphenotype by the transformed cells.
The objective of the present study is to reveal the influence of E-cadherin expression level on the amount of cancer stem cells in human colon cancer cell line HCT116.
Materials and methods. We have created cell sublines with E-cadherin up- and downregulation and assessed the percentage of cancer stem cells using tumor formation assay, clonogenic assay; we also evaluated profile of cell pluripotency markers. Results and conclusion. We have shown that the proportion of cancer stem cells in human colon adenocarcinoma cell line HCT116 depends on the E-cadherin expression level. E-cadherin expression downregulation results in elevated expression of pluripotency genes and in the increase of proportion of cancer stem cells via activation of Wnt/ft -signalling pathway. E-cadherin upregulation has a reverse effect and decreases the amount of HCT116 cancer stem cells. Thus, E-cadherin expression restoration seems prospective in colorectal anticancer therapy.
Key words: cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition, E-cadherin, colorectal cancer
Оригинальные статьи 7
Введение Более того, известно, что подавление экспрессии Е-кадгерин является трансмембранной кальций- Е-кадгерина увеличивает туморогенность трансфор-зависимой адгезионной молекулой, характерной мированных эпителиальных клеток молочной желе-для большинства эпителиальных клеток. Он играет зы HMLER и клеток аденокарциномы легкого А549 важную роль в эмбриогенезе и поддержании эпители- [20]. Однако есть работы, показывающие, что только альных тканей взрослого организма, и его утрата или Е-кадгерин-положительные клетки аденокарциномы нарушение функций может приводить к развитию предстательной железы имеют фенотип РСК и уве-новообразований [1, 2]. Для многих злокачественных личение экспрессии Е-кадгерина приводит к увели -новообразований человека показано снижение или чению доли РСК [21]. Ранее нами было показано, что отсутствие экспрессии Е-кадгерина в результате му- ингибирование фактора роста эндотелия сосудов таций в его гене CDH1, эпигенетической или транс- VEGF-C приводит к увеличению экспрессии Е-кад-крипционной регуляции, что позволяет рассматривать герина и уменьшает долю РСК в популяции клеток данный белок в качестве опухолевого супрессора [3]. аденокарциномы толстой кишки человека НСТ116 Показано, что существует взаимосвязь между экспрес- [22]. Принимая во внимание, что утрата Е-кадгерина сией Е-кадгерина и неблагоприятным течением забо- в адгезионных контактах является основным собы-левания. Так, в отношении злокачественных новообра- тием, запускающим ЭМП, а трансформированные зований молочной железы, желудка, поджелудочной клетки, прошедшие ЭМП, могут приобретать свой-железы известно, что утрата экспрессии Е-кадгерина ства РСК, в настоящей работе мы изучили влияние приводила к переходу от хорошо дифференцированной непосредственных изменений экспрессии Е-кадге-B-клеточной аденомы поджелудочной железы к инва- рина на проявление свойств и долю РСК в популя-зивной карциноме [4]; для колоректальных опухолей ции клеток HCT116. Полученные данные показывают, показано, что утрата Е-кадгерина ассоциирована что подавление экспрессии Е-кадгерина в клетках с агрессивным ростом и метастазированием [5]. линии аденокарциномы толстой кишки человека Известно, что утрата экспрессии Е-кадгерина НСТ116 приводит к прохождению клетками ЭМП трансформированными клетками может приводить и увеличению доли РСК в популяции, в то время как к эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) увеличение экспрессии Е-кадгерина, наоборот, спо-[6, 7]. В последнее время появляется все больше дан- собствует снижению доли РСК. ных, указывающих на связь между прохождением клеток через ЭМП и приобретением ими свойств Материалы и методы раковых стволовых клеток (РСК) [8, 9]. РСК — не- Клеточные линии большая популяция трансформированных клеток, В работе использовали клеточную линию адено-обладающая туморогенным потенциалом. Предпо- карциномы толстой кишки человека HCT116 (АТСС# лагают, что РСК возникают из нормальных стволовых CCL-247) и ее сублинии с измененной экспрессией клеток организма и обладают рядом свойств, позво- гена Е-кадгерина (CDH1). Клетки культивировали ляющих выделить их из основной массы злокаче- в среде DMEM с добавлением 10 % эмбриональной ственных клеток [10, 11]. Одним из таких свойств телячьей сыворотки и пенициллина/стрептомицина является профиль поверхностных маркеров. Так, для при 37 °С и 5 % СО2. РСК толстой кишки человека описаны поверхностные антигены CD133, CD44, ALCAM или фермент Создание конструкций, экспрессирующих CDH1 альдегиддегидрогеназа ALDH1 [12]. Согласно совре- и миРНК к гену CDH1 менным представлениям именно РСК являются при- При создании конструкции, экспрессирующей чиной устойчивости к терапии и рецидивирования CDH1, кДНК данного гена (синтезированная и лю-заболевания [13]. Таким образом, РСК представля- безно предоставленная проф. М.С. Трояновским [23]) ются перспективной мишенью для таргетной терапии была клонирована в лентивирусный вектор pLenti6 злокачественных новообразований, однако накапли- (Invitrogen, США). При создании конструкции, экс-ваются данные, указывающие на существование слож- прессирующей малую интерферирующую РНК гена ных механизмов поддержания определенной доли CDH1, мы использовали лентивирусный вектор pLКО РСК, возможно, за счет взаимного перехода транс- 1-puro (Sigma, Германия). На основе библиотеки формированных клеток между «стволовым» и «не- MISSION shRNA Library (Sigma-Aldrich, Германия) стволовым» состояниями [14, 15]. были выбраны 5 малых интерферирующих РНК, Пути приобретения опухолевыми клетками фе- гомологичных мРНК (ref NM_004360.3) человечес-нотипа РСК изучены недостаточно, но известно, что кого гена Е-кадгерина (CDH1): изменения экспрессии ряда генов (TAZ, WNT, SHH, № 13' - CCAGTGAACAACGATGGCATT—5' (го-DKK-1, PTEN, BMI-1) могут приводить к изменению мологичная 1409-1429 нуклеотидной последова-доли РСК в популяции опухолевых клеток [16-19]. тельности мРНК гена CDH1),
3'2016 ТОМ 15 | VOL. 15 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY
№ 23' - CGATTCAAAGTGGGCACAGAT—5' (344-364 нт),
№ 33' - GCAGAAATTATTGGGCTCTTT-5' (3858-3878 нт),
№ 43' - CCAAGCAGAATTGCTCACATT-5' (529-549 нт),
№ 53' - CCAACCCAAGAATCTATCATT-5' (2057-2077 нт),
и протестированы на линии клеток НСТ116; наиболее эффективно подавляли экспрессию Е-кадгерина две из них (№ 1, 2).
Для получения вектора, стабильно экспресси-рующего shCDHl, были синтезированы олигону-клеотиды (Evrogen, Россия): для shCDH1№ 1 - 5'-CCGGCCAGTGAA CAA CGA TGGCA TTC TCGAGAA T GGCATCGTTCACTGGTTTTTG-3', для shCDH1№ 2 -5- CCGGCGATTCAAAGTGGGCACAGATCTCGAGATC-TGTGCCCACTTTGAATCGTTTTTG-3', а также последовательности, комплементарные им. Образованный в результате гибридизации комплементарных олиго-нуклетидов фрагмент двуцепочечной ДНК, в состав которого была включена повторенная через шпилечную структуру последовательность shCDH1 (выделена жирным курсивом), гомологичная участку человеческой мРНК CDH1, был клонирован в вектор рЬКО. 1-puro по сайтам рестрикции эндонуклеаз AgeI и EcoRI. Из двух полученных конструкций для дальнейших исследований была отобрана pLKO. 1-shCDH1№ 1, наиболее эффективно подавляющая экспрессию гена Е-кадгерина.
Получение клеточных сублиний с различной экспрессией Е-кадгерина
Для получения инфекционных лентивирусных частиц pLKO.1-shGFP (контроль), pLKO. 1-shCDH1, pLenti6-CDH1 использовали клетки-упаковщики HEK293FT (Invitrogen, США) и реагент ExGen 500 (Fermentas, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Сбор вирусных частиц проводили каждые 12 ч в течение 72 ч, затем инфицировали клетки HCT116. Селекцию клеток, экспрессирующих pLKO. 1 -shGFP и pLKO.1-shCDH1, проводили с использованием пуромицина (1мкг/мл), клеток, экспрессирующих pLenti6-CDH1, - с использованием бластицидина (1мкг/мл) в течение 5 дней.
Определение уровня экспрессии генов
Тотальную мРНК выделяли с помощью TRI Reagent (Sigma, Германия). Реакцию обратной транскрипции проводили, как описано ранее [24]. Для определения уровней экспрессии мРНК использовали праймеры:
Е-кадгерин: прямой 5' -GTCTGTAGGAAGGCA-CAGCC-3', обратный 5'-TGCAACGTCGTTAC-GAGTCA-3';
c-Myc: прямой 5'- GCTTCTCAGAGGCTTGGC-GGGAAA-3', обратный 5'- CCTGGGGGATCAAG-CGGGAGG-3';
Нестин: прямой 5'- GCGGCTGCGGGCTACT-GAAA-3', обратный 5'- ATCCAAGACGCCGGCC-CTCT-3';
Sox2: прямой 5'- TGGACAGTTACGCGCACAT-3', обратный 5'- CGAGTAGGACATGCTGTAGGT-3';
Oct3/4: прямой 5'- GTGTTCAGCCAAAAGAC-CATCT-3', обратный 5'- GGCCTGCATGAGGGT-TTCT-3';
Wntl: прямой 5'- AGGCAGGCCGTACGACCG-TA-3', обратный 5'- CGGGTGGGCGAATAACCG-
GG-3';
а-тубулин: прямой 5'-GTTGGTCTGGAATTCT-GTCAG-3', обратный 5'-AAGAAGTCCAAGCTG-GAGTTC-3'.
Использовали для выравнивания образцов кДНК.
Вестерн-блот-гибридизация
Для приготовления тотальных белковых лиза-тов клетки лизировали в RIPA буфере. Пробы нормализовали по методу Бредфорда. Белки разделяли в 8-12 % полиакриламидном геле и переносили их на PVDF-мембрану (Millipore, Германия). Для выявления белков использовали антитела к Е-кадгерину (M126, TaKaRa), к р-катенину (610154, BD Transduction Laboratories, США), в качестве контроля количества нанесенного белка детектировали а-тубулин (sc-23948, Santa Cruz Biotechnology, США), использовали вторичные Alexa488-конъюгированные антитела (Invitrogen, США). Детекцию флуоресценции проводили на приборе Typhoon 9410 (GE Healthcare, США).
Иммунофлуоресцентная микроскопия
Клетки на покровном стекле фиксировали на 4-й день после посева 1 % раствором парафор-мальдегида в течение 15 мин и метанолом в течение 5 мин при -20 °C. Клетки инкубировали с первичными антителами (см. раздел «Вестерн-блот-гибриди-зация») и вторичными антителами, конъюгирован-ными с AlexaFluor594- или Alexa488-флуорохромами (Invitrogen, США). Изображения получены с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения Axio-Vision (Carl Zeiss Imaging Systems).
Определение уровня активности
люциферазы
Для определения TCF/LEF-транскрипционной активности использовали коммерчески доступную люциферазную лентивирусную TCF/LEF-зависимую репортерную конструкцию (Cignal Lenti TCF/LEF Reporter (luc) Kit: CLS-018L, Qiagen, Германия) и си-
стему Steady-Glo Luciferase Assay System (E2510, Pro-mega, США) согласно протоколу производителя, полученные значения нормализовали относительно содержания общего количества белка в образцах.
Определение миграционной активности клеток
В лунки 24-луночной плашки вставляли камеру Бойдена с диаметром пор S мкм, внутрь которой сеяли 50 000 клеток. Через 24 ч клетки, оставшиеся сверху в камере, убирали. Мигрировавшие клетки фиксировали и окрашивали трипановым синим. Миграционную активность определяли подсчетом числа клеток на нижней поверхности мембраны в 10 полях зрения (п. з.) при 200-кратном увеличении.
Определение количества клеток, исключающих
краситель Rhodamin 123
106 клеток/мл ресуспендировали в теплом растворе HBSS c добавлением 2 % эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки сначала инкубировали с 1 мг/мл красителя Rhodamine 123 (RS004, Sigma), затем добавляли 10 мг/мл красителя Propidium Iodide (P4170, Sigma). Окрашивание Rhodamine 123 детектировали с помощью проточного BD FACSCanto II (BD, США), использовали фильтры 530/30 (BP) для красителя Rhodamine 123 и 630/22 BP для красителя Propidium Iodide. В каждом эксперименте оценивали 107 событий. Дальнейший анализ проводили с помощью программ BD FACSDiva Software (BD, США) and WinMDI (Joseph Trotter, США).
Анализ колониеобразования
в неприкрепленных условиях
200 клеток ресуспендировали в 2-кратной среде DMEM, содержащей 10 % эмбриональную телячью сыворотку с 1,3 % метилцеллюлозой (Fluka, Германия ), помещали на неадгезивные чашки Петри и культивировали в течение 14 дней, окрашивали кристаллическим фиолетовым. Подсчет колоний производили с помощью программы TotalLab v. 2.01, модуля Colony Counter (Nonlinear Dynamics).
Анализ скорости роста in vitro
Клетки рассевали в 6-луночные чашки 25 000 на каждую лунку. Для определения скорости роста проводили подсчет количества клеток в камере Горяева каждые 4S ч в течение S дней.
Анализ прививаемости опухолевых клеток
В работе использовали самок бестимусных мышей линии D2 X J [24] в возрасте 6—S нед. Каждому животному подкожно прививали по 4 опухоли: 2 X 106, 106, 0,5 X 106, 0,25 X 106 клеток, суспендированных в 100 мкл физиологического раствора. Через 21 день после инъекции путем пальпации определя-
ли наличие опухоли под кожей. Эксперименты проводили трижды для подтверждения результатов.
Анализ скорости роста in vivo
Размер ксенографтов измеряли каждые 3 дня, их объем высчитывали по формуле: (ширина)2 х (длина) х 0,5.
Продолжительность эксперимента составила 21 день, сформировавшиеся опухоли использовали для иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания.
Иммуногистохимическое окрашивание
Ксенографты фиксировали в 4 % формальдегиде в течение 24 ч и заключали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм подвергали депарафинированию, затем обрабатывали в цитратном буфере для демаскировки антигена pH6.0 (Dako, S1699) при 94 °С 40 мин. Активность эндогенной пероксидазы ингибировали 3 % Н2О2 10 мин. После этого срезы инкубировали с первичными антителами крысы к CD34 (BD Pharmingen, 553731), в течение 1 ч, затем со вторичными антителами, меченными биотином (BD Pharmingen, 559286) в течение 30 мин, далее 15 мин со стрептавидин-HRP-проявочной системой (Dako, К0690). Визуализацию окрашивания проводили, используя систему DAB+ (Dako, К3468) согласно протоколу фирмы. После этого препараты докрашивали гематоксилином Май-ера (Glycergel, Dako). После демаскировки все инкубации проводили при комнатной температуре.
Подсчет CD34+ капилляров
Препараты опухолевых тканей использовали для проведения морфометрического анализа присутствия кровеносных капилляров, выявляемых с помощью ИГХ-окрашивания на CD34. CD34+-структуры с просветами, длина которых >100 мкм, подсчитывали при 100-кратном увеличении, их плотность на срезе опухоли оценивали по среднему количеству. Анализировали по 3—7 п. з. для каждой опухоли в экспериментальной группе.
Статистика
Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего по результатам как минимум 3 независимых экспериментов. Для статистической оценки результаты были проанализированы с помощью t-теста Стьюдента. Значения считали статистически достоверными приp < 0,05. Все эксперименты были проведены не менее 3 раз.
Результаты и обсуждение
Чтобы изучить влияние изменений экспрессии Е-кадгерина на свойства клеток аденокарциномы толстой кишки человека и его роль в формировании фенотипа РСК, мы создали сублинии клеток НСТ116
с повышенной и подавленной экспрессией Е-кадге-рина (CDH1). Для создания сублинии с гиперэкспрессией CDH1 последовательность гена CDH1 человека была клонирована в лентивирусный вектор рЬепИб, содержащий СМУ-промотор, обеспечивающий постоянную экспрессию целевого гена, и ген устойчивости к бластицидину для селекции инфицированных клеток (рис. 1а). Последовательности малых интерферирующих РНК к мРНК гена CDH1 человека были клонированы в лентивирусный вектор рЬКО.1, экспрессия которого стабильно подавляла продукцию Е-кадгерина в клетках НСТ116. Мы отметили, что клетки с подавленной экспрессией Е-кадгерина утрачивали часть эпителиальных и приобретали некоторые мезенхимальные черты: наблюдалось ослабление межклеточных контактов, уменьшение количества р-катенина (см. рис. 1а) и его частичная транслокация в ядро (рис. 1б). Клетки приобретали веретеновидную форму и повышенную миграционную активность (рис. 1в). Сублиния клеток с гиперэкспрессией Е-кадгерина и контрольная линия сохраняли исходный фенотип при более выраженных межклеточных контактах в клетках с повышенной экспрессией Е-кадгерина. Таким образом, мы предположили, что клетки с подавленной экспрессией Е-кадгерина могли приобретать некоторые черты ЭМП. Известно, что утрата экспрессии Е-кад-герина (в результате мутаций, репрессии транскрипции и т. д.) трансформированными клетками приводит к прохождению ЭМП [25]. Ранее на модели аденокарциномы поджелудочной железы было показано, что переход между неинвазивной аденомой и ин-вазивной карциномой ассоциирован с утратой экспрессии Е-кадгерина и прохождением ЭПМ, кроме того, было показано, что утрата мембранного р-ка-тенина коррелировала с инвазивным фенотипом и агрессивным течением некоторых типов колорек-тального рака [25, 26].
Поскольку мы наблюдали транслокацию р-кате-нина в ядро при подавлении экспрессии Е-кадгери-на, мы проверили, будет ли при этом активироваться сигнальный путь ^П;/р-катенин. Во-первых, мы обнаружили многократное увеличение экспрессии Wnt1, а также одного из эффекторов данного сигнального каскада — онкогена c-Myc (рис. 1г). Во-вторых, с помощью люциферазного анализа ТСБ/ЬеГ-репортера мы показали, что подавление Е-кадгерина при экспрессии бИСВШ действительно приводит к увеличению ТСБ/Ье^зависимой транскрипционной активности (рис. 1д) и активации сигнального каскада ^Ы/р-катенин в клетках ЫСТ116.
Известно, что данный сигнальный каскад может регулировать плюрипотентность стволовых клеток в ходе развития, мы проанализировали уровни мРНК некоторых генов плюрипотентности. Мы отметили
повышенную экспрессию генов Нестин, OCT3/4, SOX2 в сублинии клеток НСТ116 с подавленным Е-кадгерином (рис. 2). Полагаем, что утрата экспрессии Е-кадгерина может способствовать повышению экспрессии транскрипционных факторов OCT3/4 и SOX2, отвечающих за поддержание состояния «стволовости», что, в свою очередь, приводит к приобретению свойств РСК. Так, в работе N. Oshima и соавт. показано, что, если в клетках карциномы толстой кишки гиперэкспрессировать транскрипционные факторы OCT3/4, SOX2 и KLF4, такие клетки приобретут свойства РСК [27]. Более того, в ряде исследований показано, что экспрессия генов SOX2 и OCT3/4 ассоциируется с более агрессивным фенотипом опухоли и неблагоприятным прогнозом как для злокачественных опухолей толстой кишки и желудка, так и для злокачественных опухолей других локализаций [28—30].
Принимая во внимание, что повышенная экспрессия данных генов характерна не только для «нормальных» стволовых клеток, но и для РСК, мы решили проверить, как изменения экспрессии Е-кадгерина будут влиять на долю клеток со свойствами РСК в популяции НСТ116 (рис. 3). Для этого мы провели ряд тестов, считающихся «золотым стандартом» для выявления РСК. Сначала мы проверили активность АВС-транспортеров в сублиниях НСТ116 с повышенной и пониженной экспрессией Е-кадгерина, для чего изучили содержание в клетках красителя Rhodamine 123 с помощью проточного цитофлуори-метра. Согласно современным представлениям РСК являются основной причиной устойчивости опухолей к химиотерапии за счет феномена, названного множественной лекарственной устойчивостью, причина которого, в свою очередь, заключается в повышенной активности АВС-транспортеров [31], являющейся важнейшей характеристикой РСК. Мы показали, что количество неокрашенных клеток было в 1,8 раза выше в сублинии с пониженной экспрессией и в 1,6 раза ниже в сублинии с повышенной экспрессией Е-кадгерина (рис. 3а).
Способность расти в неприкрепленных условиях является еще одним важным свойством РСК, используемым в некоторых работах для получения популяции, обогащенной РСК [32], поэтому мы протестировали способность полученных нами сублиний НСТ116 формировать колонии в полужидкой среде. Клетки с подавленной экспрессией Е-кадгерина формировали в 2,5 раза большее число колоний по сравнению с контрольной сублинией (рис. 36), а количество колоний, сформированных клетками с увеличенной экспрессией Е-кадгерина, было меньше. Главным свойством, позволяющим считать опухолевую клетку РСК, является способность этой клетки формировать новую опухоль при инъекции животному с иммунодефици-
и
2
Q
U
Q. U-
и
Q
U
Е-кадгерин
Р-катенин
а-тубулин
о
¡S §
-Q -О '
ин1
U CQ 1
0 s
1 и
° S 0,5 н
Е-кадгерин р-катенин
CDH1
shGFP
shCDH1
Е-кадгерин
Р-катенин
DAPI
а щ 10 аи
ш I
о £ рр
ре гл s о S 1=
о ш 5
Относительная интенсивность полос
400.
H D C F G h s D C h s 2,0 * 12 10 Г 2,0
Е-кадгерин 1,5 1,5
8
Wnt1 6
1,0 1,0
c-Myc 4
0,5 1*. , 0,5
а-тубулин 2
0,0 _ 0 щ L 0,0
Е-кадгерин
Wnt1
c-Myc
shGFP
shCDH1
Рис. 1. Влияние изменения экспрессии Е-кадгерина на морфологические характеристики и активацию сигнального каскада Ж^/р-катенин в клетках НСТ116: а — вестерн-блот-анализ экспрессии Е-кадгерина ир-катенина, а-тубулин использован для контроля количества нанесенных образцов. Слева представлены репрезентативные блоты, справа — относительная интенсивность полос; б — иммунофлуоресцентное окрашивание сублиний НСТ116антителами к Е-кадгерину ир-катенину. Отрезок — 5мкм; в — миграционная активность сублиний НСТ116 в камере Бойдена; г — анализ экспрессии генов и с-Мус. Слева — результаты одного из репрезентативных анализов полимеразной цепной реакции; а-тубулин использован для контроля количества нанесенных образцов. Справа — количественный анализ экспрессии генов; д — активность люциферазы в сублиниях НСТ116 с введенной репортерной конструкцией, экспрессирующей ген люциферазы под контролем промотора ТС¥/Ьг/. Различия между значениями контрольной (ъЬОТР) и экспериментальных групп, достоверные по критерию Стьюдента (р < 0,05), отмечены звездочкой
том. Для того чтобы оценить туморогенность полученных сублиний НСТ116, мы определяли минимальную прививочную дозу, вызывающую подкожный рост новой опухоли у бестимусных мышей. Оказалось, что минимальная прививочная доза для линии с повышенной экспрессией Е-кадгерина была выше, а для сублинии с подавленным Е-кадгерином — ниже по сравнению с контрольной линией (см. таблицу). Проведенные
эксперименты указывают на то, что доля РСК в популяции клеток аденокарциномы толстой кишки человека НСТ116 зависит от уровня экспрессии Е-кадгерина.
Параллельно с оценкой туморогенности сублиний НСТ116 мы исследовали скорость роста их ксено-графтов. Оказалось, что как увеличение, так и подавление Е-кадгерина приводит к торможению опухолевого роста (рис. 4б). Такой эффект объясняется,
а
0
б
в
д
г
Е-кадгерин
Нестин SOX2 Oct 3/4 а-тубулин
Е-кадгерин Нестин SOX2 Oct 3/4
CDH1 shGFP shCDHI
Рис. 2. Влияние изменения экспрессии Е-кадгерина на экспрессию генов плюрипотентности в клетках НСТ116. а — результаты одного из репрезентативных анализов полимеразной цепной реакции; а-тубулин использован для контроля количества нанесенных образцов. б — количественный анализ экспрессии генов. Различия между значениями контрольной (¡ИОТР) и экспериментальных групп, достоверные по критерию Стьюдента (р < 0,05), отмечены звездочкой
б
CDH1
104 103 "102 101 100
e^j; fc;.
104 103 102 101
400
300
200
100
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 10
Родамин 123
CDH1
shGFP
shCDH1
Рис. 3. Влияние изменения экспрессии Е-кадгерина на долю клеток со свойствами РСК в линии НСТ116: а — активность АВС-транспорте-ров. Слева — гистограммы проточной цитометрии (нижний левый квадрат — живые клетки, исключающие краситель Якоёат1пг 123). Двойная окраска: КИо123 — Якоёат1пг 123, Р1 — пропидий йодид. Справа — количественный анализ доли клеток, исключающих краситель; б — количественный анализ клоногенной активности клеток НСТ116. Различия между значениями контрольной (¡ИОТР) и экспериментальных групп, достоверные по критерию Стьюдента (р < 0,05), отмечены звездочкой
Влияние изменения экспрессии Е-кадгерина на минимальную прививочную дозу клеток НСТ116
Сублиния НСТ116 Прививаемость, %
2 x 106 1 x 106 0,5 x 106 0,25 x 106
CDH1 100 75 40 0
shGFP 100 80 50 0
shCDH1 100 100 100 0
■
■
во-первых, замедленной пролиферацией in vitro клеток НСТ116 с измененной экспрессией Е-кадгерина (рис. 4а) и, во-вторых, сниженной плотностью кровеносных капилляров в ксенографтах (рис. 4в), так как васкуляризация является одним из лимитирующих факторов роста опухоли. Плотность капилляров (СВ34+-структур) в ксенографтах НСТ116 составляла 2,8 ± 0,4 на п. з., а при изменении экспрессии Е-кад-герина уменьшалась до 1,5 ± 0,3.
Таким образом, подавление Е-кадгерина в клетках НСТ116 стимулирует опухолевую прогрессию за счет индукции ЭМП, приобретения клетками свойств РСК и поддержания их доли в популяции, но не за счет пролиферативной активности клеток и их способности индуцировать васкуляризацию опухолевой ткани. Однако ранее нами было показано, что пониженная экспрессия Е-кадгерина в клетках линии аденокар-циномы легкого человека А549 способствует не только
а
а
0
35 3G 25
4GG
g 2G
1s
1G
s
G
ф CDH1 ■ shGFP ^ shCDHi
л о
X
у
п о
е ъ б О
3GG
2GG
1GG
^ CDH1 ■ shGFP ^ shCDHi
2 4 б
День инкубации
11 14 17
День после инъекции
о
21
CDH1
shGFP
shCDHi
О
CDH1
shGFP
shCDHi
Рис. 4. Влияние изменения экспрессии Е-кадгерина на скорость роста клеток НСТ116 in vitro и in vivo и васкуляризацию ксенографтов: а — кинетика роста клеток in vitro. Каждая точка — средние величины для 3 лунок; представлены типичные данные одного из 3 экспериментов; б — кинетика роста подкожных ксенографтов после прививки бестимусным мышам. Приведены типичные данные, полученные при анализе 8—12 опухолей в каждом из 3 экспериментов; в — васкуляризация ксенографтов НСТ116 с измененной экспрессией Е-кадгерина. Слева — ИГХ-окрашивание срезов ксенографтов на CD34. Представлены типичные п. з. для каждой экспериментальной группы. Стрелками показаны CD34+ капилляры > 100мкм. Отрезок — 5 мкм. Справа — количественный анализ CD34+ капилляров длиной > 100мкм. Для каждой экспериментальной группы проанализировано не менее 25 п. з. Различия между значениями контрольной (shGFP) и экспериментальных групп, достоверные по критерию Стьюдента (р < 0,05), отмечены звездочкой
б
а
G
в
в
в
приобретению ими свойств РСК, но и увеличению скорости роста in vivo и способности стимулировать ангиогенез в опухоли [20]. По-видимому, такое различие во влиянии Е-кадгерина на ростовые характеристики неопластических клеток разного гистогене-тического типа имеет различные механизмы, что требует дальнейшего изучения.
Заключение
Итак, полученные результаты показывают, что подавление экспрессии Е-кадгерина приводит к активации сигнального пути Wnt/ß-катенин, что, с одной стороны, индуцирует ЭМП и может способствовать приобретению клетками свойств РСК. С другой стороны, активация сигнального пути Wnt/ß-катенин увеличивает экс-
прессию генов плюрипотентности и также может способствовать приобретению трансформированными клетками черт РСК. Таким образом, утрата Е-кадгерина может поддерживать долю РСК в популяции клеток аденокарциномы толстой кишки и может быть одним из механизмов перехода трансформированной клетки в «стволовое» стояние. Поскольку именно РСК являются основной причиной рецидивирования и метаста-зирования злокачественных опухолей, представляется перспективной разработка терапевтических походов, способных восстанавливать экспрессию Е-кадгерина и функциональные межклеточные контакты.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (соглашение № 14-15-00467).
ЛИТЕРА
1. Stemmler M.P. Cadherins in development and cancer. Molecular Biosystems 2008;4(8):835-50. http://dx.doi. org/10.1039/b719215k. PMID: 18633485.
ТУРА I R E F
2. van Roy F., Berx G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cellular and Molecular Life Science 2008;65(23):3756-88.
E R E N C E S
http://dx.doi.org/10.1007/ s00018-008-8281-1. PMID: 18726070. 3. Rodriguez F.J., Lewis-Tuffin L.J., Anastasiadis P.Z. E-cadherin's dark side:
14 Оригинальные статьи
possible role in tumor progression. Biochimica and Biophysica Acta 2012;1826(1):23-31. http://dx.doi. org/10.1016/j. bbcan. 2012.03.002. PMID: 22440943.
4. Perl A.K., Wilgenbus P., Dahl U. et al.
A causal role for E-cadherin in the transition from adenoma to carcinoma. Nature 2009;392(6672):190-3. PMID: 9515965.
5. Kim S.A., Inamura K., Yamauchi M.
et al. Loss of CDH1 (E-cadherin) expression is associated with infiltrative tumor growth and lymph nodemetastasis. British Journal of Cancer 2016; 114(2):199-206. http:// dx.doi.org/10.1038/bjc.2015.347. PMID: 26742007.
6. Spaderna S., Schmalhofer O., Hlubek F. et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transitions during cancer progression. Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Pathologie 2007;91:21-8. PMID: 18314592.
7. Фармаковская М.Д., Хромова Н.В., Рыбко В. А., Копнин П. Б. Роль эпители-ально-мезенхимального перехода в регуляции свойств раковых стволовых клеток солидных опухолей. Российский биотерапевтический журнал 2015;4:3-8.
8. Mani S.A., Guo W., Liao M.J. et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell 2008;133(4):704-15. http://dx.doi. org/10.1016/j. cell. 2008.03.027. PMID: 18485877.
9. Polyak K., Weinberg R.A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer 2009;9(4):265-73. http://dx.doi.org/10.1038/nrc2620. PMID: 19262571.
10. Reya T., Morrison S.J., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 2001;414(6859):105-11. http://dx.doi. org/10.1038/35102167. PMID: 11689955.
11. Scheel C., Weinberg R.A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchy-mal transition: concepts and molecular links. Seminars in Cancer Biology 2012;22(5-6): 396-403. http://dx.doi.org/10.1016/j. semcancer. 2012.04.001. PMID:22554795.
12. Kozovska Z., Gabrisova V., Kucerova L. Colon cancer: cancer stem cells markers, drug resistance and treatment. Biomedicine and Pharmacotherapy 2014; 68(8):911-6. http://dx.doi.org/10.1016/j. biopha.2014.10.019. PMID: 25458789.
13. Singh A., Settleman J. EMT, cancer stem cells and drug resistance: an emerging axis of evil in the war on cancer. Oncogene 2010;29(34):4741-51. http://dx.doi. org/10.1038/onc.2010.215. PMID: 20531305.
14. Gupta P.B., Fillmore C.M., Jiang G. et al. Stochastic state transitions give rise to phenotypic equilibrium in populations of cancer cells. Cell 2011;146(4):633-44. http://dx.doi.org/10.1016/j. cell.2011.07.026. PMID: 21854987.
15. Chaffer C.L., Brueckmann I., Scheel C. et al. Normal and neoplastic nonstem cells can spontaneously convert to a stem-like state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011;108(19):7950-5. http://dx.doi. org/10.1073/pnas. 1102454108. PMID: 21498687.
16. Cordenonsi M., Zanconato F., Azzolin L. et al. The Hippo transducer TAZ confers cancer stem cell-related traits on breast cancer cells. Cell 2011;147(4): 759-72. http://dx.doi. org/10.1016/ j.cell.2011.09.048. PMID: 22078877.
17. Cai C., Zhu X. The Wnt/b-catenin pathway regulates self-renewal of cancer stem-like cells in human gastric cancer. Molecular Medicine Reports 2012;5(5):1191-6. PMID: 22367735.
18. Liu S., Dontu G., Mantle I.D. et al. Hedgehog signaling and Bmi-1 regulate self-renewal of normal and malignant human mammary stem cells. Cancer Research 2006;66(12):6063-71. http://dx.doi. org/10.1158/ 0008-5472. CAN-06-0054. PMID: 16778178.
19. Korkaya H., Paulson A., Charafe-Jauffret E. et al. Regulation of mammary stem/ progenitor cells by PTEN/Akt/beta-catenin signaling. PLoS Biology 2009;7(6):e1000121. http://dx.doi. org/10.1371/journal.pbio.1000121. PMID: 19492080.
20. Farmakovskaya M., Khromova N., Rybko V. et al. E-cadherin repression increases amount of cancer stem cells in human A549 lung adenocarcinoma and stimulates tumor growth. Cell Cycle 2016;15(8):1084-92. http://dx.doi.org/10.1 080/15384101.2016.1156268. PMID: 26940223.
21. Bae K.M., Su Z., Frye C. et al. Expression of pluripotent stem cell reprogramming factors by prostate tumor initiating cells. Journal of Urology 2010; 183(5):2045-53. http://dx.doi. org/10.1016/j.juro.2009.12.092. PMID: 20303530.
22. Khromova N., Kopnin P., Rybko V., Kopnin B.P. Downregulation of VEGF-C expression in lung and colon cancer cells decelerates tumor growth and inhibits metastasis via multiple mechanisms. Oncogene 2012;31(11):1389-97. http://dx.doi.org/ 10.1038/onc.2011.330. PMID: 21804602.
23. Chitaev N.A., Troyanovsky S.M. Adhesive but not lateral E-cadherin
complexes require calcium and catenins for their formation. The Journal of Cell Biology 1998;142(3):837-46. PMID: 9700170.
24. Logunov D.Y., Ilyinskaya G.V., Cherenova L.V. et al. Restoration of p53 tumor-suppressor activity in human tumor cells in vitro and in their xenografts in vivo by recombinant avian adenovirus CELO-p53. Gene Therapy 2004;11:79-84. PMID: 14681700.
25. Steinestel K., Eder S., Schrader A.J., Steinestel J. Clinical significance of epithe-lial-mesenchymal transition. Clinical and Translational Medicine 2014;3:17. http:// dx.doi.org/10.1186/2001-1326-3-17. PMID: 25050175.
26. Kevans D., Wang L.M., Sheahan K. et al. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) protein expression in a cohort
of stage II colorectal cancer patients with characterized tumor budding and mismatch repair protein status. International Journal of Surgical Pathology 2011;19(6):751-60. http://dx.doi.org/10.1177/1066896911414566. PMID: 21791486.
27. Oshima N., Yamada Y., Nagayama S. et al. Induction of cancer stem cell properties in colon cancer cells by defined factors. PLoS One 2014;9(7):e101735. http://dx.doi.org/10.1371/journal. pone. 0101735. PMID: 25006808.
28. Zhang X., Hua R., Wang X. et al. Identification of stem-like cells and clinical significance of candidate stem cell markers in gastric cancer. Oncotarget 2016; 7(9):9815-31. http://dx.doi.org/10.18632/ oncotarget.6890. PMID: 26769843.
29. Talebi A., Kianersi K., Beiraghdar M. Comparison of gene expression of SOX2 and OCT4 in normal tissue, polyps, and colon adenocarcinoma using immunohistochemical staining. Advanced Biomedical Research 2015;4:234. http://dx.doi.org/10.4103/2277-9175.167958. PMID: 26645019.
30. Habu N., Imanishi Y., Kameyama K. et al. Expression of Oct3/4 and Nanog
in the head and neck squamous carcinoma cells and its clinical implications for delayed neck metastasis in stage I/II oral tongue squamous cell carcinoma. BMC Cancer 2015;15:730. http://dx.doi.org/10.1186/ s12885-015-1732-9. PMID: 26483189.
31. Alisi A., Cho W.C., Locatelli F., Fruci D. Multidrug resistance and cancer stem cells in neuroblastoma and hepatoblastoma. International Journal
of Molecular Science 2013;14(12):24706-25; http://dx.doi.org/10.1186/ s12885-015-1732-9. PMID: 26483189.
32. Singh S.K., Clarke I.D., Terasaki M. et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumours. Cancer Research 2003;63(18):5821-8; PMID: 14522905.
