CC BY
55
ВЛИЯНИЕ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛА НА ГАМКа- СОПРЯЖЕННУЮ Cl', НСОз--АКТИВИРУЕМУЮ Mg^-АТФазную АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНАЛЬНЫХ МЕМБРАН МОЗГА КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO Мензиков С.А., Карпова М.Н., Калинина М.В.
Учреждение РАМН Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН, г. Москва
К настоящему времени убедительно доказано вовлечение ГАМКА-ергической системы в патохимию ряда заболеваний центральной нервной системы, в частности, эпилепсии [1-3]. Патогенез судорожных состояний и эпилепсии, в отличие от многих других психических болезней, тесно связан не только с нарушением функции ГАМКА-рецепторов, но и с изменениями энергетических процессов в нейронах [4] . Так, энергопродукция ^i/мин/г) резко возрастает при судорогах, моделирующих эпилептический припадок и снижается при фенобарбиталовом наркозе [5, 6]. В плазматических мембранах нейронов мозга крыс существует ГАМКА-сопряженная О-,НС03--АТФаза, которая состоит из активности «базальной» Mg2+-АТФазы, активируемой ионами Cl- и Cl- +НСО 3- при их соотношении как 5:1, и вовлечена в ГАМКА-индуцируемые ClTHCO3--обменные процессы [7, 8]. В связи с изложенным представлялось важным выяснить будут ли происходить изменения активности
фермента при действии конвульсанта пентилентетразола (ПТЗ) на активность «базальной»
2+
Mg -ATФазы в отсутствие и в присутствии анионов в экспериментах in vitro и в условиях острых генерализованных судорог, вызванных внутрибрюшинным введением ПТЗ в дозе 65 мг/кг крысам самцам Вистар (170 г).
Исследования in vitro: Для определения активности фермента микросомальный препарат (~20 мкг) вносили в 0.5 мл среды инкубации, содержащей 10 мМ Hepes-Tris буфер, рН 7.3, 1.0 мМ MgSO4, 1.0 мМ Tris-АТФ, 40 мМ NaCl + 8 мМ NaHCO3, а при исследовании влияния ПТЗ (1-100 мкМ) его преинкубировали с белком в течение 15 мин при 30о С. Удельную АТФазную активность оценивали по приросту неорганического фосфора (Ф i) в
0.5 мл инкубационной среды при 30о С в течение 30 мин, останавливали добавлением в среду инкубации 1,8 мл 30%-ной H2SO4, определяли содержание фосфора в пробах методом Чена и выражали в мкмоль Ф i/ч на 1 мг белка.
Исследования in vivo: Контрольных (введение физиологического раствора) и опытных
животных с тяжестью судорог в 5 баллов декапитировали. Мозг быстро извлекали и отмывали охлажденным 10 мМ Hepes-tris буфером (рН 7,4), содержащим 0,125 мМ ЭДТА. Фракцию микросом, обогащенных плазматическими мембранами из мозга контрольных и
опытных животных получали по стандартной методике [8].
2+
В экспериментах in vitro активность «базальной» Mg -ATФазы плазматических мембран
мозга крыс составила 6,8 мкмоль Фi/ч на 1 мг белка и она активировалась Cl- (Таб.1).
2+
Однако, максимальная активация «базальной» Mg -АТФазы наблюдалась в присутствии в среде инкубации одновременно ионов Cl-+HCO 3- и ее активность составила 10,0 мкмоль Ф i /ч на 1 мг белка.
Таблица 1. Влияние анионов на «базальную» Mg2+-АТРазную активность в отсутствие и в присутствии 50 мкМ пентилентетразола
Вносимая соль, мМ «базальная» Mg -АТРазная активность мкмоль Фi/ч на 1 мг белка
В отсутствие ПТЗ В присутствии ПТЗ
Контроль 6,8 ± 0,7 9,1 ± 0,6
40 мМ Cl 7,8 ± 0,4 9,5 ± 0,8
10 мМ Cl- + 2 мМ HCO3- 10,0 ± 0,7 * 10,2 ± 0,5
* - р < 0.05 достоверные отличия от значений активности фермента в контроле
2+
ПТЗ (1-100 мкМ) увеличивал (~ 30 %) активность «базальной» -АТФазы и ингибировал активирующий эффект ионов С1- и С1-+НСОз-. Так, в диапазоне концентраций 5-25 мкМ он снижал активирующий эффект анионов на фермент, а в концентрациях 50-100 мкМ полностью устранял его. В условиях ПТЗ-индуцируемой судорожной активности в
плазматических мембранах мозга крыс также наблюдалось увеличение (~ 40 %) активности
2+
«базальной» М§ -АТФазы и не происходило ее активации ионами С1" и СГ+НСО3".
2+
Эффект ПТЗ в отсутствие анионов также сходен с их действием на «базальную» М§ -АТФазу (Таб.2).
Таблица 2. «Базальная» М§2+-АТРазная активность нейрональной фракции, выделенной из коры головного мозга крыс в контроле и на пике судорожной активности (5 баллов) после введения пентилентетразола.
Условия опыта Mg -ЛТРазная активность, мкмоль Фі/ч на 1 мг белка
«базальная» в присутствии Cl- в присутствии Cl- + НСО 3-
Контроль 7,3 ± 0,7 8,8 ± 0,9 9,7 ± 0,9
Опыт - пик судорожной активности 1 0,2 ± 0,5 * 10,6 ± 0,8 9,8 ± 1,0
* - р < 0.05 достоверные отличия от значений активности фермента в контроле .
Однако в присутствии анионов этот лиганд, как в экспериментах in vitro, так и in vivo, проявлял свойства ингибитора и устранял их активирующий эффект на фермент, что может свидетельствовать о рецептор-зависимом пути его действия на активность фермента. Кроме
того, результаты нашего исследования подтверждают, ранее высказанное предположение, о
2+
жизненно важной роли Mg -АТФазы в нейрональных мембранах, роль которой
окончательно не установлена [9, 10]. Таким образом, функциональные изменения
- - 2+ активности ГАМКА-сопряженной Cl", НСО3"-активируемой Mg -АТФазы свидетельствуют
о вовлечении фермента в синаптическую передачу в ЦНС и в патогенез ПТЗ-индуцируемой
судорожной активности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Alvarez-Leefmans F.J., Delpire E. Physiology and phatology of chloride transporters and channels in the nervous system : From molecules to diseases Publisher: Academic Press, 2009. -500 P.
2. Palma E., Amici M., Sobrero F. et al. Anomalous levels of Cl--transporters in the hippocampal subiculum from temporal lobe epilepsy patients make GABA excitatory // Proc. Natl. Acad.Sci. USA.-2006.- V.103.- № 22.-P. 8465-8468.
3. Laschet J.J., Kurcewicz I., Minier F. et al. Disfunction /of GABA(A) receptor glycoly- sis-
dependent modulation in human partial epilepsy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2007. - V.
104. -№ 9. -P. 3472-3477.
4. Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко и др. Биохимия мозга.-С-Петербург: С-Петербургский университет. 1999.-328 c.
5. Walton N.Y. et al. Altered residual ATP content in rat brain cortex subcellular fractions following status epilepticus induced by lithium and pilocarpine // J. Mol. Neurosc.-1998.- V. 11.-№ 3.- P. 233-242.
6. Толстухина Т.И., Флеров М.А. АТРазная активность в нейронах и нейроглии при судорогах, вызванных пикротоксином // Вопросы медицинской химии.- 1999.- N.2.- С. 1-3.
7. Мензиков С.А., Карпова М.Н. CF-транспортные механизмы в нейрональных мембранах и
роль АТФ в их функционировании // Патогенез. - 2011. - №1. - С. 4-10.
8. Мензиков С.А., Карпова М.Н., Калинина М.В. Влияние ионов НСОз- на АТФ-зависимый сопряженный с ГАМКА-рецепторами С1--насос плазматических мембран мозга крыс // Бюл. экспер. биол. -2011. - Т. 152. -№7. - С. 43-47.
2+
9. Tsakiris S., Koromilas C., Schulpis K.H. et al. Reduced Mg -ATPase activity in the hypoglycemic adult rat brain // Zeitschrift fur naturforschung C-A. Journal of biosciences.-2001.-V. 56.- № 9-10.- P. 912-914.
10. Villa R.F., Gorini A., Hoyer S. et al. ATPases of synaptic plasma membranes from hippocampus after ischemia and recovery during ageing // Neurochemical research.-2002.-V. 69.-№ 7.-P. 541-547.
EFFECT OF PENTYLENETETRAZOLE ON THE GABAa-COUPLED CL-, HCO3--ACTIVATED MG2+-ATPASE ACTIVITY OF THE PLASMA MEMBRANEFROM RAT BRAIN BOTH IN VITRO AND IN VIVO EXPERIENCES S.A. Menzikov, M.N. Karpova, M.V. Kalinina
Institute of General Pathology and Phathophysiology of Russian Academy of Medical Sciences. Moscow. 125315. Baltiyskaya street. 8.
- - 2+
Effect of the pentylenetetrazole on the couplied with GABAA-receptor Cl", HCO3"-activated Mg -ATPase of the plasma membranes from rat brain it was investigated, both experiences in vitro and
in vivo. It was found in vitro that pentylenetetrazole in range concentrations 20-100
2+ -enchances the activity of the «basal» Mg -ATPase and eliminated the activating effect of Cl"
and Cl-+HCO3- on the enzyme. The under pentylenetetrazole -induced convulsions in the the
2+
plasma membranes from rat brain is observed increase of the «basal» Mg -ATPase activity and
not occurs of the activating it by Cl- and Cl-+HCO3- ions, also. It was conclusion about involved
- - 2+ of the coupled with GABAA-receptor Cl", HCO3"-activated Mg -ATPase of the neuronal
membrane under pentylenetetrazole -induced convulsions.
2+
Key words: pentylenetetrazole, plasma membranes from brain, Mg -ATPase, chloride,
bicarbonate
