CC BY
70
—-----------------------—
Menzikov S.A., Karpova M.N., Kalinina M.V.
Institute of General Pathology and Phathophysiology of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia. E-mail: menzikov@mail.ru
EFFECT OF GLUCOSE AND MG2+-ATP ON THE GABAa-COUPLED CL-, HCO3--ACTIVATED MG2+-ATPASE ACTIVITY OF THE PLASMA MEMBRANE FROM RAT BRAIN IN VITRO EXPERIENCES
Effect of the glucose and Mg2+-ATP on the couplied with GABAA-receptor Cl-, HCO3--activated Mg2+-ATPase of the plasma membranes from rat brain involving from «basal» Mg2+-ATPase which it is activated by Cl"+HCO3" ions it was investigated. The glucose (1-10 mM) decreased the «basal» Mg2+-ATPase activity on 17 % and completely eliminated the enzyme activation by iomM Cl-+2mM HCO3- ions. The differential effect of the glucose and Mg2+-ATP on the activation of the «basal» Mg2+-ATPase by variety concentrations of anions it was established. So it was found that in the presence Mg2+-ATP in the incubation medium >1 mM the enzyme activation by 10 mM Cl-+2 mM HCO3- ions not appear. However, in the presence of the glucose (10 mM) the inhibiting effect of the Mg2+-ATP on the enzyme is disapperes and Cl-, HCO3--ATPase activity is restored. While, in the presence of the high concentrations 40 mM Cl-+8 mM HCO3- in the incubation medium the inhibiting effect of the glucose and Mg2+-ATP it was negligible (~ 20°%). It was conclusion about direct involvement of the glucose and Mg2+-ATP in the regulation of the coupled with GABAA-receptor Cl-, HCO3--ATPase activity of the neuronal membrane under different concentration anions in the incubation medium. Key words: glucose, Mg2+-ATP, Mg2+-ATPase, plasma membranes from rat brain, Cl-, НСО3-
Мензиков С.А., Карпова М.Н., Калинина М.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8. E-mail: menzikov@mail.ru
ВЛИЯНИЕ ГЛЮКОЗЫ И MG2+-ATФ НА АКТИВНОСТЬ ГАМКа СОПРЯЖЕННОЙ ^",НСО3--АТФАЗЫ плазматических мембран мозга крыс в экспериментах in vitro
Исследовано влияние глюкозы и Мд2+-АТФ на сопряженную с ГАМКА-рецепторами Cl, НСО3-АТФазу плазматических мембран мозга крыс, состоящей из «базальной» Мд2+-АТФазы, активируемой ионами Cl' и НСО3~ при соотношении как 5:1. Установлено, что глюкоза (1-10 мкМ) снижает активность «базальной» Мд2+-АТФазы на 17 % и полностью устраняет активацию фермента 10 мМ Cl+2 мМ НСО3. В тоже время установлен дифференциальный эффект глюкозы и Мд2+-АТФ на активацию фермента различными концентрациями ионов СГ+НСО3~. Показано, что в диапазоне высоких концентраций (>1 мМ) субстрата (Мд2+-АТФ) активирование фермента низкими концентрациями 10 мМ Cl' +2 мМ НСО3 не происходит. Однако, в присутствии глюкозы (10 мМ) ингибирующий эффект субстрата на фермент нивелируется, т.е. активность CT ,НСО3-АТФазы восстанавливается. В тоже время, в присутствии высоких концентраций 40 мМ Cl +2 мМ НСО3~ в среде инкубации ингибирующий эффект глюкозы и Мд2+-АТФ на активность фермента незначителен (~ 20 %). Делается вывод о прямом вовлечении глюкозы и Мд2+-АТФ в регуляцию ГАМКА-сопряженной Cl', НСО3 -АТФазной активности нейрональных мембран при различных концентрациях анионов в среде инкубации.
Ключевые слова: глюкоза, Мд2+-АТФ, Мд2+-АТФаза, плазматические мембраны мозга крыс, Cl', НСО3
В плазматических мембранах нейронов мозга крыс существует ГАМКа-сопряженная СГ,НСО3"-АТФаза, которая состоит из «базальной» Mg2+-
АТФазы, активируемой одновременно ионами С1-и НСО3- при их соотношении как 5:1, и участвующая в ГАМКА-индуцируемых С1-/НСО3--обменных
процессах [1,2]. Также было обнаружено, что фермент вовлекается в конвульсант-
индуцируемую судорожную активность мозга крыс [3]. Известно, что патогенез судорожных состояний и эпилепсии зависит не только от нарушения функционирования ГАМКА-рецепторов, но и от энергетического состояния мозга, и в первую очередь, от метаболизма глюкозы [4, 5]. Кроме того, показано, что функциональная активность транспортных АТФаз, а также «базальной» Mg2+-АТФазы нейрональных мембран находится под контролем гликолитического АТФ [6, 7]. В связи с изложенным представлялось целесообразным выяснить как влияет глюкоза на активность «базальной» Mg2+-ATФазы в отсутствие и в присутствии анионов в экспериментах in vitro.
Работу проводили на крысах самцах Вистар массой 160-180 г. Животных содержали в обычных условиях вивария на стандартном пищевом рационе.
Получение фракции микросом: Для получе-
ния фракции микросом, обогащенной плазматическими мембранами, животных декапитирова-ли, извлекали кору мозга и гомогенизировали при 40 С в соотношении 1:8 в 10 мМ Hepes-Tris буфере, рН 7.2, содержащем 0.125 мМ ЭДТА, 0.1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и центрифугировали на ультрацентрифуге Beckman (США) в ба-кет-роторе (SW-28) при 10 000 g в течение 20 мин при 4° С. Полученный супернатант центрифугировали при 100 000 g в течение 1 ч при 4о С. Полученную в осадке микросомальную фракцию суспендировали 10 мМ Hepes-Tris буфере, рН 7.2 и использовали для определения АТФазной активности.
Исследования, in vitro: Для определения ак-
тивности фермента, микросомальный препарат (-20 мкг) вносили в 0.5 мл среды инкубации, содержащей 10 мМ Hepes-Tris буфер, рН 7.2, 0.7-3 мМ MgSO4, 0.7-3 мМ tris-АТФ, 10 мМ Nad+2 мМ №НСО3 или 40 мМ Nad +8 мМ №НСО3, и глюкозу (1-10 мМ). Удельную АТФазную активность оценивали по приросту неорганического фосфора (Фі) в 0.5 мл инкубационной среды при 30о С в течение 30 мин, останавливали добавлением в среду инкубации 1,8 мл 30%-ной H2SO4, определяли содержание фосфора в пробах методом Чена и выражали в мкмоль Фі/ч на 1 мг белка [1]. «Базальную» Mg2+-АТФазную активность рассчитывали
Рис.1. Влияние глюкозы на активность Cl-, HCO (10 мМ Nad+2 мМ №НСО3) анионов (M+m).
как разность активностей в присутствии и в отсутствие MgSO4. Активность СГ,НСО3"-активируемой Mg2+-АТФазы (СГ, НСО3"-АТФазы) оценивали по разности между Мg2+-АТФазными активностями в присутствии и в отсутствие ЫаС1+ЫаНСО3. На рисунках представлены средние арифметические величины активности фермента, полученные по результатам не менее четырех измерений. Ошибка средней арифметической величины - не более 10%. Достоверность различий оценивали с помощью ^критерия Стьюдента при р< 0.05.
Для выяснения специфичности действия глюкозы на ферментативную активность исследовали ее эффект на «базальную» Mg2+-АТФазную активность и активирующий эффект анионов на фермент. Результаты исследования показали, что в исследуемой фракции плазматических мембран из мозга крыс активность «базальной» Mg2+-АТФазы микросом мозга крыс составляет 7,8 мкмоль Фі/ч на і мг белка. В присутствии 10 мМ СГ+2 мМ НСО3" активность СГ, НСО3"-АТФазы составила 3,2 мкмоль Фі/ч на і мг белка. Глюкоза в диапазоне концентраций 1-10 мМ сни-
жает активность «базальной» Mg2+-АТФазы на 17 % и полностью устраняет активацию фермента анионами.
Результаты ранее проведенных исследований показали, что фермент активируется как низкими (~ю мМ С1 + ~2 мМ НСО3), так и высокими (-40 мМ С1 + ~8 мМ НСО3) концентрациями анионов и вовлечен в ГАМКА-индуцируемые С1/НСО3-обменные процессы [2]. Кроме того, было установлено, что активация фермента низкими, в отличие от высоких, концентраций анионов, ингибируется в присутствии субстрата Mg2+-АТФ в среде инкубации >1 мМ. Поскольку полученные данные показали чувствительность СГ,НСО3"-АТФазной активности к глюкозе, представлялось важным исследовать ее влияние на фермент при его активации различными концентрациями анионов. Из результатов, представленных в рис. 1., видно, что С1", НСО3"-АТФазная активность, выявляемая при низких концентрациях анионов, ингибируется концентрациями Mg2+-АТФ выше 1 мМ. Однако, в присутствии 10 мМ глюкозы ингибирующий эффект Mg2+-АТФ на фермент нивелируется.
3"-АТФазы, активируемой низкими концентрациями
- р < 0.05 достоверные отличия от значений активности фермента в контроле (n=4)
В тоже время, при активации фермента высокими концентрациями анионов, ингибирующий эффект, как субстрата, так и глюкозы не значите-
лен (рис.2). Так, в присутствии 3 мМ Mg-АТФ в среде инкубации, активность С1-, НСО3--АТФазы ингибируется на ~ 20 %.
Рис. 2 Влияние глюкозы на активность С1-,НС03--АТФазы, активируемой высокими концентрациями (40 мМ ЫаС1 +8 мМ ЫаНСО,) анионов (М+т).
*- р < 0.05 достоверные отличия от значений активности фермента в контроле (n=4)
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о чувствительности исследуемой АТФазы плазматических мембран мозга крыс к глюкозе. Однако ее эффект на ферментативную активность имеет в зависимости от концентрации анионов и субстрата Mg2+-ATФ в среде инкубации дифференциальный характер.
Известно, что торможение нейрона, по сравнению с возбуждением, характеризуется более быстрой и интенсивной активацией энергетического обмена [4, 5]. В частности, метаболизм глюкозы в мозге определяет уровень АТФ в клетке и является жизненно важным для функционирования ЦНС. Кроме того, гипер- или гипогликемия влияют на липидный состав и текучесть плазматических мембран и, как следствие, изменяют функциональную активность мембранносвязанных транспортных АТФаз Р-типа, таких как Ыа+,К+-АТФаза и Са2+-АТФаза, а также «базальной» Mg2+-АТФазы, роль которой в нейрональной мембране окончательно не установлена [6, 7]. Так, показано, что глюкоза в концентрации 1,2 и 3 мМ ингибировала активность Mg2+-АТФазы на 80 %, 50% и 40 %, соответственно [8]. В нашем исследовании глюкоза (5-10 мм) также ингибирует активность «базальной» Mg2+-АТФазы на 17 %. Кроме того, присутствие в среде инкубации 10 мМ глюкозы ингибирует активацию фермента низкими концентрациями (10 мМ С1-+2 мМ НСО3-) и практически не влияет на активацию фермента высокими концентрациями анионов. Эти результаты подтверждают ранее полученные данные о наличии у фермента, в зависимости от концентрации анионов и АТФ [1], два устойчивых состояния и предполагают физиологическое значение влияния глюкозы на активность фермента. В частности, в нейрональных мембранах взрослых животных ГАМК, взаимодействуя с ГАМКа-рецепторами, увеличивает транспорт С1- в нейрон, в результате чего происходит гиперполяризация мембранного потенциала [5]. В тоже время, при увеличении концентрации медиатора или частоты его воздействия на рецептор, наблюдаемое торможение переходит в возбуждение мембранного потенциала [9]. Общепризнана важная роль НСО3- в возникновении ГАМКА-возбуждения, однако, в отношении ионов С1- было предложено несколько гипотез. Так, одни авторы предполагают, что при ГАМКА-индуцируемой деполяризации происходит выход С1- из клетки, тогда как другие полагают, что транспорт С1- направлен внутрь нейрона. Так, интенсивное активирование ГАМ-КА-рецепторов индуцирует СГ/НСО3"-
проводимость, в ходе которой транспорт С1-,
направленный из экстрацеллюлярного пространства в нейрон увеличивает их концентрацию от 10 мМ, а ионы НСО3- транспортируются из нейрона, и их концентрация увеличивается снаружи клетки от 2 мМ [9]. Наряду с этим имеются данные, что при концентрации С1- внутри нейрона выше 40 мМ, полярность двухфазного ГАМКА-индуцируемого тока тоже меняется, т.е. СГ/НСО3"-ток изменяет свою направленность [10]. Такое предположение подтверждается результатами исследований, в которых установлено, что в нейрональной клетке с высоким содержанием ионов С1- не происходит аккумуляции этих анионов, а наоборот, С1- истощается в начальной фазе ГАМКА-индуцируемого постсинаптического тока [11]. Однако известно, что СГ-АТФаза (СГ-насос) в нейрональной клетке препятствует аккумуляции С1- в нейроне, но не его истощению [12]. Эти данные свидетельствуют о том, что в ходе ГАМКА-индуцируемой деполяризации, в отличие от ГАМКА-индуцируемой гиперполяризации, должна вовлекаться сопряженная с тормозными рецепторами АТФ-зависимая система, участвующая в поддержании концентрации внутриклеточного С1-. за счет энергии гидролиза АТФ. Обнаруженная нами С1-, НСО3--АТФаза, которая выявляется как при низких, так и при высоких концентрациях анионов, по-видимому, и является таким ферментом, который гидролизует АТФ и участвует в ГАМКА-индуцируемом С1"/НСО3"-обменном процессе [1, 2]. Однако, как показывают полученные данные, глюкоза регулирует в каком режиме будет работать фермент, т.е. влияние этой энергетической субстанции на активность ГАМКА-сопряженного С1--насоса играет важную физиологическую роль не только потому, что, через процессы гликолиза, обеспечивает тормозные рецепторы энергией, но и потому, что она напрямую регулирует определенное направление потока С1-, которое зависит не только от их концентрации, но и от внутриклеточной концентрации АТФ и ионов НСО3-. Дальнейшее исследование свойств фермента и роли глюкозы в регуляции АТФ-зависимого ГАМКА-индуцируемого транспорта С1-через нейрональную мембрану может иметь важное значение для выяснения патогенеза ряда заболеваний, в частности эпилепсии. Так, выявлена функциональная связь между эпилептогенезом и гипометаболизмом глюкозы в определенных областях мозга [13].
ЛИТЕРАТУРА
1. Мензиков С. А., Мензикова О. В. Сравнительные свойства чувствительной к ГАМКА-ергическим лигандам Cl-, НСО3--активируемой Mg2+-ATPa3bi плазматических мембран мозга рыб и крыс // Ж.эвол.биохим. и физиол.-2оо7.-Т. 43.- № 3.- С. 246-253.
2. Мензиков С.А., Карпова М.Н., Калинина М.В. Влияние ионов НСОз- на АТФ-зависимый сопряженный с ГАМКд-рецепторами СГ-насос плазматических мембран мозга крыс // Бюл. экспер. биол. 2011. Т. 152. №7. С. 43-47.
3. Мензиков С.А., Карпова М.Н., Калинина М.В. Влияние пикротоксина на ГАМК(А)-сопряженную Cl-, НСО3--активируемую Mg^-АТФазную активность плазматических мембран мозга крыс в экспериментах in vitro и in vivo // Патогенез. 2011. №1 .
С. 31-34.
4. Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко и др. Биохимия мозга.-С-Петербург: С-Петербургский университет, 1999.-328 с.
5. Alvarez-Leefmans F.J., Delpire E. Physiology and
phatology of chloride transporters and channels in the nervous system : From molecules to diseases
Publisher: Academic Press, 2009.500 P.
6. Kamboj S.S., Chopra K. And Sandhir R. Hyperglycemia-induced alterations in synaptosomal membrane fluidity and activity of membrane bound enzymes: beneficial effect of N-acetylcysteine supple-
mentation // Neuroscience. -2009. -V. 162. - № 2.- P.
349-358-
7. Torlinska T., Grochowalska A. Age-related changes of Na+,K+-ATPase, Ca2+ATPase and Mg2+-ATPase activities in rat brain synaptosomes // J. Phys-iol.Pharmacol. -2004. -V. 55. - №2.- P. 457-465.
8. Tsakiris S., Koromilas C., Schulpis K.H. Reduced Mg2+-ATPase activity in the hypoglycemic adult rat brain //J.Naturfosch C. -2001. -V. 56. - № 9-10.- P.
912-914.
9. Staley K.J., Proctor W.R. Modulation of mammalian dendritic GABAa receptor function by the kinetics of Cl- and HCO3- transport // J. Physiol. Lond.-1999.-V. 519.-P. 693-712.
10. Perkins K.L., Wong R.K.S. Ionic basis of the postsynaptic depolarizing GABA response in hippocampal pyramidal celte // J. Neurophysiol. -1996. - V. 76.-P. 3886-3894.
11. Perkins K.L. Cl accumulation does not account for the depolarizing phase
of the synaptic GABA response in hippocampal pyramidal cells // J. Neurophysiol.-1999.-V. 82.-P. 768777.
12. Inagaki C. et al. A Cl--pump in rat-brain neurons // J. Exp.Zool. -1996. -V. 275. - № 4. - P. 262-268.
13. Laschet J.J., Kurcewicz I., Minier F. et al. Disfunction /of GABA(A) receptor glycolysis-dependent modulation in human partial epilepsy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2007. - V. 104. -№ 9. -P. 3472-3477.
