CC BY
69
УДК 617.713-001-08
А.А. СТАДНИКОВ1, В.Н. КАНЮКОВ2, О.М. ТРУБИНА2, Д.В. ОЛЕЙНИК2
1Оренбургский государственный медицинский университет, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6 2Оренбургский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова МЗ РФ, 460047, г. Оренбург, ул. Салмышская, д. 17
Влияние окситоцина на репаративную регенерацию структур роговицы
Стадников Александр Абрамович — доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, тел. (3532) 77-22-75, e-mail: alexander.stadnikov@yandex.ru
Канюков Владимир Николаевич — доктор медицинских наук, профессор, главный научный консультант, тел. (3532) 64-48-18, e-mail: ofmntkmg@esoo.ru
Трубина Ольга Михайловна — кандидат медицинских наук, доцент, заместитель директора по научной работе, тел. (3532) 65-06-82, e-mail: nauka@ofmntk.ru
Олейник Дмитрий Вячеславович — врач-офтальмолог, тел. (3532) 65-06-82, e-mail: wedil@mail.ru
Проведена оценка влияния окситоцина при механической травме роговицы и установлена его роль в лечебной коррекции с позиций репаративных морфогенезов. Сформированы 3 группы экспериментальных животных (6 кроликов).1-й и 2-й группам выполнена эрозия роговицы диаметром 8 мм. 3-я группа контрольная — без повреждения роговицы. 1-й группе (2 кролика) инстиллировали в конъюнктивальный мешок антибиотик ципромед 0,3%; 2-й группе (2 кролика) — окситоцин 5МЕ и ципромед 0,3%. У всех животных взяты образцы (n=18) переднего эпителия и стромы на 4-е и 8-е сутки эксперимента, изготовлены гистопрепараты. Из образцов выделена мРНК, относительное содержание которой оценивали методом электрофореза. Обратной транскрипцией с помощью реактива MMLV получена кДНК. По результатам real-time PCR оценивалась экспрессия изучаемых генов. Уровень экспрессии гена Ki-67 нормализовали относительно гена в-ACTIN. На 4-е сутки наблюдался более высокий уровень экспрессии гена Ki-67 в 1-й группе, а на 8-е сутки — во 2-й группе. Анализ экспрессии гена Ki-67 по сравнению с в-ACTIN позволяет сделать вывод о том, что препарат «Окситоцин» положительно влияет на процессы регенерации роговицы. Ключевые слова: регенерация, роговица, экспрессия генов, окситоцин.
A.A. STADNIKOV1, V.N. KANYUKOV2, O.M. TRUBINA2, D.V. OLEYNIK2
Orenburg State Medical University, 6 Sovetskaya Str., Orenburg, Russian Federation, 460000
2The Orenburg Branch of the S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, 17 Salmyshskaya Str.,
Orenburg, Russian Federation, 460047
Effect of oxytocin on reparative regeneration of corneal structures
Stadnikov AA — D. Biol. Sc., Professor, Head of the Department of Histology, Cytology and Embryology, tel. (3532) 77-22-75, e-mail: alexander.stadnikov@yandex.ru
Kanyukov V.N. — D. Med. Sc, Professor, Chief Research Consultant, tel. (3532) 64-48-18, e-mail: ofmntkmg@esoo.ru Trubina O.M. — Cand. Med. Sc., Associate Professor, Deputy Director for Science, tel. (3532) 65-06-82, e-mail: nauka@ofmntk.ru Oleynik D.V. — ophthalmologist, tel. (3532) 65-06-82, e-mail: wedil@mail.ru
The influence of Oxytocin in corneal mechanical damage was estimated, its role in medical correction from the perspective of reparative morphogenesis was determined. All experimental animals (6 rabbits) were divided into 3 groups. Corneal erosion, 8 mm in diameter, was created in the first and the second groups. The third group was control, without any damages of the cornea. The 1st group (2 rabbits) was treated by intraconjunctival instillation of antibiotic Cipromed, 0.3%; the 2nd group (2 rabbits) — by Oxytocin 5 ME and Cipromed, 0.3%. Samples (n=18) of the anterior epithelium and stroma were taken from all animals at days 4 and 8 of the experiment and tissue specimens were prepared. mRNA was isolated from the samples, and
О
ИТАЛЬМОЛОГ
'6 (98) ноябрь 2016 г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ^ 169
its relative level was evaluated by electrophoresis. Complementary DNA was obtained by reverse transcriptase using MMLV reagent. Expression of the studied genes was evaluated according to the results of PCR real-time. The level of Ki-67 gene expression was normalized in relation to p-ACTIN gene. On day 4 there was a higher level of Ki-67 gene expression in the first group and on day 8 that was in the 2nd group. The analysis of the expression of Ki-67 gene as compared to p-ACTIN allows concluding that the drug Oxytocin improves corneal regeneration.
Key words: regeneration, cornea, genes expression, oxytocin.
С каждым годом растет функциональная нагрузка на зрительный анализатор людей всех возрастных групп. При этом увеличивается число случаев патогенных воздействий на орган зрения, включая травматические повреждения его переднего отдела, что связано с развитием производственных технологий и неблагоприятными чрезвычайными ситуациями [1-3]. Углубленное изучение этиологии, эпидемиологии, морфологии повреждения органа зрения диктует необходимость пересмотра лечения, одним из важных направлений которого должно быть создание фона максимального благоприятствования при подходе к лечению, в частности, травм [4, 5] и возможность управления процессами регенерации [6].
Особый интерес в последние годы вызывают природные биостимуляторы. В отечественной офтальмологической практике широко использовались такие стимуляторы регенерации, как керакол [7], низкомолекулярный полипептидадгелон [8], полученный из супернатанта сыворотки крови животных и человека, относящийся к гуморальным адгезивным факторам, циркулирующим в биологически активных жидкостях и обеспечивающих стимуляцию регенерации. При этом некоторые авторы отмечали отсутствие у препарата тканевой и видовой специфичности [9]. В клинической практике стимуляторов регенерации положительно зарекомендовал себя хитозан — деацетилированное производное полисахарида хитина, структурного аналога целлюлозы, построенного из остатков глюкозы [10].
В современной реконструктивной и восстановительной хирургии широкое применение нашли методы органоспецифического замещения поврежденных структур с помощью материалов, способных имитировать свойства замещаемых биологических структур [11]. Фундаментальные исследования, выполненные под руководством проф. Э.Р. Мулдаше-ва, подтверждают возможности использования биоматериалов для стимуляции регенерации целого ряда анатомических структур глазного яблока при различных его заболеваниях и патологических состояниях [12, 13].
Рядом исследователей изучено применение гиа-луроновой кислоты (естественного протеогликана аморфного межклеточного вещества тканей) в хирургической практике, как перспективного направления в разработке новых методов органоспецифи-ческой регенерации [14-16].
Одним из перспективных направлений в регенеративной хирургии и трансплантологии является использование эмбриональных (фетальных) тканей для стимуляции репаративных процессов, покрытие амниотической мембраной, трансплантация лимбальных стволовых клеток, культивированных стволовых клеток роговичного эпителия в остром периоде ожога [17, 18].
Новые возможности в коррекции микроцирку-ляторных нарушений в зоне травмы представляет методика региональной лимфатической терапии. Сущность метода заключается в создании в ткани
и региональных лимфатических узлах терапевтической концентрации антибиотиков, что позволяет в большинстве случаев уменьшить проявления воспалительной реакции [19].
В последние годы особенно популярным является изучение влияния различных факторов роста на регенерацию, имеющих различное происхождение: полученных из плаценты [20]; из глаз и мозга [21]; из тромбоцитов [22]. В течение многолетних исследований убедительно подтверждена позитивная роль гипоталамо-гипофизарной нейросекре-торной системы и нейроциркуляторных механизмов в регуляции регенерации трофических нарушений [23]. Так было установлено оптимизирующее воздействие гуморальных факторов крупноклеточных супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса на процессы репаративных гистогенезов в условиях пересадок аденогипофиза, слюнных желез, а также при экспериментальном моделировании острого панкреатита, синусита.
В последние десятилетия было выявлено, что нейрогормоны ядер гипоталамической области оказывают на клетки организма позвоночных широкий спектр биологических действий, которые в совокупности можно определить как охранительно-тормозные и адаптивные [23]. Кроме того, в настоящее время общепризнанным является наличие взаимосвязей между нейроэндокринной и иммунной системой, как в норме, так и при различных патологических состояниях. Главными «языковыми элементами» этой системы являются гормоны, пептиды, нейротрансмиттеры [24]. При этом установлено, что продуцирующими цитокины клетками в глазу являются клетки стромы и эпителия роговицы, эпителиальные клетки хрусталика, цилиарного тела, клетки пигментного эпителия и клетки Мюллера [25], а секреция цитокинов в значительной степени возрастает при инфекции и травмах [24].
Исходя из этих данных, становится очевидной адаптогенная роль нонапептидергической гипота-ламо-гипофизарной нейросекреторной системы с точки зрения оценки и прогнозирования исходов раневых процессов различной локализации. Известно, что системное введение окситоцина быстро улучшает регенерацию мышц путем повышения пролиферации стволовых клеток в результате активации сигнального пути MAPK/ERK в старых мышцах. Учитывая то, что окситоцин является препаратом, одобренным FDA, его введение пациентам может стать потенциально новым и безопасным способом борьбы со старением мышц [26]. В головном мозге он работает как нейромедиатор, осуществляющий связь между нервной и эндокринной системами. Он поступает из клеток гипоталамуса в гипофиз, там хранится и выделяется в кровь под действием внешних и внутренних стимулов.
Однако этот аспект проблемы относительно травматических повреждений органа зрения до сих пор в научной литературе не рассматривался.
Все вышеизложенное свидетельствует о многофакторности репаративного процесса, методов и
с
фтдльмолоп
средств, влияющих на его скорость и дифференци-ровку вновь образованных клеток, что, безусловно, требует дальнейшего изучения данной проблемы о роли окситоцина в сфере офтальмохирургии.
Цель исследования — оценить влияние окситоцина при механической травме и установить его роль в лечебной коррекции с позиций репаратив-ных морфогенезов.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
- Оценить в эксперименте регенераторный потенциал структур роговицы при механической эрозии;
- Установить показатели регенераторной активности клеток структур роговицы для прогнозирования процессов ее репаративной регенерации.
Материал и методы
Эксперимент выполнен на 6 беспородных кроликах массой 2,5±0,3 кг. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. (Страсбург, 1985). У 1 и 2-й групп эрозию роговицы выполняли по методу С. Hanna, J.E. O'Brien (1960) [27], согласно которому под местной анестезией (0,4% инокаином) легким прижатием трепана с поршнем диаметром 8 мм на роговицу наносили метку, окрашенную 0,1% раствором флюоресцеина натрия, не захватывая ростковую зону лимба. В пределах метки лезвием удалили эпителий и часть стромы роговицы. Дефект эпителия снова был окрашен раствором флюоресцеина для того, чтобы отчетливее были видны форма и размер эрозии роговицы. 3-я группа (2 кролика) — контрольная, без повреждения роговицы. Животным 1-й группы закапывали ципромед 0,3% 3 раза в сутки. Выведение животных из эксперимента осуществляли через 4 и 8 суток под эфирным рауш-наркозом. 2-й группе с эрозией роговицы закапывали ципромед 0,3% и раствор окситоцина 3 р/день (вывод из эксперимента на 4-е и 8-е сутки). После вывода животного из эксперимента глазное яблоко энуклеировалось. Под хирургическим микроскопом был произведен забор образцов переднего эпителия и стромы. Всего выделено 18 образцов. Все образцы помещались в фиксатор
IntactRNA на 24 часа в холодильник. мРНК выделяли с помощью реагента ExtractRNA методом фенол-хлороформной экстракции. Образцы разделены на 2 равные части. Одну часть образцов осаждали изопропанолом, другую — абсолютным этанолом, и дважды промывали 80%-ным этанолом. РНК растворяли в деионизованной воде, обрабатывали с помощью DNasel, RNase free. Обратную транскрипцию проводили с помощью обратной транскриптазы MMLV. При анализе были выбраны гены, которые потенциально могут участвовать в процессах регенерации роговицы. Для real-time PCR использовали специфические праймеры (ген «домашнего хозяйства» ß-ACTIN и целевой ген Ki-67), которые сконструировали с помощью программы Vector NTI и проверены в базе данных GENBANK.
Результаты
Из 6 образцов приготовлены микропрепараты для контроля. Гистосрезы толщиной 5 мкм, изготовленные на ротационном микротоме, после депара-финирования окрашены гематоксилином Мейера и эозином (рис. 1).
Относительное содержание мРНК оценивали методом электрофореза (рис. 2).
В образцах, которые осаждали изопропанолом, по данным электрофореза рНк выделилась не во всех образцах. В образцах, осажденных абсолютным этанолом, РНК выделилась в большинстве образцах, которые были взяты для обратной тра-скрипции. По данным real-time PCR уровень экспрессии изучаемых генов нормализовали относительно гена ß-ACTIN (рис. 3). По предварительным данным экспрессия гена Ki-67 на 4-е сутки больше в образцах 1-й группы животных, которым инстилли-ровали антибиотик (1,25). На 8-е сутки экспрессия больше в образцах 2-й группы животных, которым инстиллировали антибиотик с окситоцином (1,31). Полученные данные требуют сравнения динамики экспрессии остальных генов.
Заключение
В результате проведенного исследования установлено позитивное влияние препарата «Оксито-цин» на процессы регенерации роговицы, о чем свидетельствуют показатели экспрессии гена Ki-67 по сравнению с ß-ACTIN.
Рисунок 1.
А — передний эпителий, Б — строма (Цветная иллюстрация на стр. 227)
А
'6 (98) ноябрь 2016 г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА | 171
Рисунок 2.
Образцы 1-18 — выделение РНК с изопропанолом. Образцы 1.-18. — выделение РНК с этанолом
1 Щ 2 2. М 3 3. 4 4, 5
5. 6 6. 7 М 7. 8 8. 9 9.
10 10. 11 11. м 12 12. 13 13. 14
14. 15 15. 16 М 16. 17 17. 13 18.
Рисунок 3.
Динамика экспресии гена Ю-67 (по оси ординат — относительный уровень экспрессии гена, относит. ед.)
ЛИТЕРАТУРА
1. Федоров С.Н., Мороз З.И., Зуев В.К. Кератопротезирование. — М.: Медицина, 1982. — 143 с.
2. Логвинов С.В., Потапов А.В., Варакута Е.Ю., Жданкина А.А. с соавт. Изменения сетчатки и зрительного нерва при комбинированном воздействии ионизирующей радиации и света // Морфология. — 2006. — Т. 129, №4. — С. 76.
3. Сухинин М.В. Морфологическая характеристика переднего эпителия роговицы и сосудистого русла конъюнктивы глазного яблока в норме и при механическом повреждении перилимбаль-ной зоны: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — СПб., 2011. — 18 с.
4. Копаева В.Г. Современные аспекты сквозной субтотальной кератопластики: автореф. дис. ... докт. мед. наук. — М., 1982. — 48 с.
5. Гундорова Р.А., Степанов А.В. Новые приоритетные направления в проблеме глазного травматизма // Вестник офтальмологии. — 1999. — Т. 115, №2. — С. 3-5.
6. Синельщикова И.В., Беляев Д.С., Петухова А.Б. Морфология и медикаментозная коррекция процессов репаративной регенерации при повреждении роговицы // Вестник офтальмологии. — 2013. — Т. 129, №1. — С. 56-60.
7. Суркова В.К., Азнабаев М.Т., Даутова З.А. Способы стимуляции репаративного процесса при патологии роговой оболочки: Пособие для врачей. — Уфа, 1997. — 11 с.
8. Романова И.Ю. Применение адгелона при травматических поражениях роговой оболочки: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — 2004. — 24 с.
фтдльмолоп
9. Капитонов Ю.А., Мусостова М.К., Краснов М.С. с соавт. Бел-ковопептидные комплексы из роговицы и сыворотки крови телят как стимуляторы восстановительных процессов при экспериментальной травме роговицы // Современные технологии диагностики и лечения при поражениях органа зрения: материалы конференции. - 2013. - С. 64-66
10. Rui Cui, Qingjun Lu, Yufei Teng, Kun Li & Na Li. Chitosan Promoted the Corneal Epithelial Wound Healing via Activation of ERK Pathway // Curr. Eye Res. — 2016. — 1-7.
11. Шумаков В.И., Севастьянов В.И. Биополимерные матриксы для искусственных органов и тканей // Здравоохранение и медицинская техника. — 2003. — №4. — С. 30-32.
12. Мусина Л.А. Функциональная морфология макрофагов при регенерации тканей, индуцированной аллогенными биоматериалами: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Саранск, 2007. — 49 с.
13. Мулдашев Э.Р. Теоретические и прикладные аспекты создания аллотрансплантатов «Аллоплант» для пластической хирургии лица: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — СПб., 1994. — 40 с.
14. Зиновьев Е.В., Ивахнюк Г.К., Лагвилава Т.О. Об эффективности местного применения гидрогелей карбополов при лечении синдрома диабетической стопы // Вестник Российской Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. — 2012. — №4 (40). — С. 200-205.
15. Рахматуллин Р.Р., Бурлуцкая О.И., Гильмутдинов Р.Г. Применение биоматериала «Гиаматрикс» (Hyamatrix) в арсенале современных методов лечения ожогов и ожоговой болезни // Врач. — 2011. — №12. — С. 44-46.
16. Рахматуллин Р., Забиров Р., Бурлуцкая О. Применение нового биопластического материала «Гиаматрикс» в оториноларингологии // Врач. — 2011. — №13. — С. 32-33.
17. Милюдин Е.С., Золотарев А.В., Милюдин А.Е. Возможности местной иммуносупрессии при повторной кератопластике // Клиническая офтальмология. — 2014. — Т. 14, №3. — С. 160-164.
18. Борзенок С.А., Онищенко Н.А., Тонаева Х.Д., и др. Длительная нормотермическая консервация лимбальных трансплантатов как способ повышения количества и активности ммск-подобных лимбальных клеток // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2012. - 14 (2). - С. 77-85.
19. Милова С.В., Андрианова Е.В. Лимфотропная регионарная терапия больных с глаукомной оптической нейропатией // XI международная конференция «Глаукома: теории, тенденции, технологии — 2013»: Сб. науч. статей. — М., 2013. — С. 212-215.
20. Thatte S., Jain J. Fornix Reconstruction with Amniotic Membrane Transplantation: A Cosmetic Remedy for Blind Patients // Journal of Ophthalmic & Vision Research. — 2016. — 11 (2). — P. 193-197.
21. Кусень С.И., Стойка Р.С. Молекулярные механизмы в действии полипептидных факторов роста. — М.: Наука, 1985. — 236 с.
22. Bazan H.E., Varner L. Amitogen activated proteinkinase (MAP-Kinase) cascade is simulated by plateled activating factor (pAf) in corneal epithelium // Curr. Eye Res. — 1997. — Vol. 16 (4), №2. — P. 372-379.
23. Стадников А.А., Бухарин О.В. Гипоталамическая нейросе-креция и структурно-функциональный гомеостаз про- и эукариот (морфологические основы реактивности, пластичности и регенерации). — Оренбург: ОрГМА, 2012. — 296 с.
24. Черешнев В.А., Юшков Б.Г., Гаврилова Т.В. и др. От имму-нофизиологии к иммунопатофизиологии //Аллергология и иммунология. — 2006. — Т. 7, №3. — С. 242-243.
25. Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А. и др. Иммунитет глазного яблока и конъюнктивальная микрофлора // Инфекция и иммунитет. — 2012. — 2 (3). — С. 635-644.
26. Elabd C., Cousin W., Upadhyayula P. et al. Oxytocin is an age-specific circulating hormone that is necessary for muscle maintenance and regeneration // Nature communications. — 2014. — 5. — P. 4082.
27. Hanna C. Cellturnover in the adult human eye / C. Hanna, D.S. Bicknell, J.E. O'Brien // Arch. Ophthalmol. - 1961. — Vol. 65. -P. 695-703.
