CC BY
67
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10415
УДК577.115.4
ВЛИЯНИЕ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ТКАНЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ*
B. М. НИКОЛАЕВ1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (е-шаИ: Nikolaev1126@ mail.ru)
Л. П. КОРЯКИНА2, кандидат ветеринарных наук, зав. кафедрой
C. А. ФЕДОРОВА3, доктор биологических наук, зав. лабораторией
1Якутский научный центр комплексных медицинских наук, Сергеляхское ш., 4, Якутск, 677010, Российская Федерация
2Якутская государственная сельскохозяйственная академия, ул. Красильникова, 15, Якутск, 677007, Российская Федерация
3Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова, ул. Белинского, 58, Якутск, 677000, Российская Федерация
Резюме. Оценивали влияние низких температур (-10±2 0С на процессы перекисного окисления липидов в тканях внутренних органов (печени, почках, легких, сердца) крыс. Опытная и контрольная группы включали по 8 крыс линии Вистар. Животных опытной группы экспонировали нахолоде в течение 14 дней по 1 ч. На холоде температура лапок, измеренная электротермометром с игольчатымдатчиком, понижалась на 6,8 0Сдо (+20,5±0,5) 0С, хвоста - на 3,7 0Сдо (+21,4±0,7) 0С, по сравнению с контролем. Это свидетельствует о нарушении микроциркуляции и возникновении гипоксии в конечностях, следствие - интенсификация перекисных процессов. В конце опыта отбирали по 100 мг ткани печени, почек, легкого и сердца, которые исследовали с помощью спектрофотометра БРЕСОЯй 40. У подо-пытныхживотныхконцентрация малонового диальдегида - конечного продукта перекисного окисления липидов, была значительно ниже контрольных значений: в печени - в 1,6раза (6,64 нмоль/г), почках -в 1,7 раза (9,74 нмоль/г), легких - в 3,0 раза (5,02 нмоль/г). Уровень диеновых коньюгатов - первичных продуктов перекисного окисления липидов - был значительно выше, в сравнении с интактной группой, в печени - в 1,7раза (3,79 мкмоль/л), почках-в 5,6раз (5,55 мкмоль/л), легких-в 1,4 раза (7,10 мкмоль/л), сердце - в 1,7 раза (4,51 мкмоль/л). Суммарное содержание низкомолекулярных антиоксидантов было достоверно выше, чем в контроле, в печени - в 1,8 раз (29,78 мг-экв кверцетина/г), почках-в 2,0раза (76,57мг-экв кверцетина/г), легких-в 22,0 раза (44,18 мг-экв кверцетина/г). Активность каталазы была существенно ниже контрольных значений в печени в 1,4 раза (15,14 мккат/г), почках - в 1,7 раза (10,45 мккат/г), легких - в 1,7 раза (9,89 мккат/г), сердце - в 1,5раза (8,56мккат/г).
Ключевые слова: воздействие низких температур, перекисное окисление липидов, свободнорадикальное окисление липидов, липопероксидация, активные формы кислорода, малоновый ди-альдегид, диеновые коньюгаты, спектрофотометрические методы, электротермометр с игольчатым датчиком, адаптация. Для цитирования: Николаев В. М., Корякина Л. П., Федорова С. А. Влияние низких температур на перекисное окисление липидов в тканях экспериментальных животных // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 4. С. 62-64. ВО1: 10.24411/0235-2451-2018-10415.
Одна из фундаментальных проблем современной биологии - изучение состояния организма при воздействии различных негативных факторов внешней среды, а также способов повышения устойчивости к ним. В экстремальных
природно-климатических условиях Севера к числу таких факторов относится воздействие холода.
Имеются свидетельства того, что воздействие низких температур на организм экспериментальных животных сопровождается активацией перекисных процессов [1, 2]. При этом их умеренная интенсификация может способствовать увеличению проницаемости клеточной мембраны и облегчению работы мембранных белков. Однако чрезмерное усиление такого процесса может привести к срыву адаптации, что проявляется денатурацией и инактивацией белков, делипидизацией и нарушением целостности мембран, нарушением деления и роста клеток [3, 4]. Следовательно, от интенсификации перекисных процессов, индуцированных воздействием низких температур, зависит функциональное состояние клеток, тканей и органов, то есть способность организма адаптироваться к воздействию холода.
Цель исследования - изучение влияния низких температур (-10±2)0С на процессы перекисного окисления липидов в тканях внутренних органов (печени, почках, легких, сердца) экспериментальных животных.
Условия, материалы и методы. Эксперимент проводили на 8 крысах линии Вистар массой 170-260 г. Исследовали влияние температуры (-10±2) 0С в течение 14 дней. Животных экспонировали на холоде в течение 1 ч. Температуру лапок и хвоста у крыс определяли с помощью электротермометра с игольчатым датчиком. Контрольная группа состояла из 8 интактных животных.
Многократное кратковременное воздействие холода продолжительностью 1 ч на организм экспериментальных животных было выбрано, потому что оно встречается довольно часто, как в повседневных, так и в экспериментальных ситуациях [2].
При завершении эксперимента животных выводили из опыта путем декапитации с соблюдением требований гуманности согласно приложению № 4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных - приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1977 «О порядке проведения эвтаназии (умерщвления животного)». Отбирали по 100 мг ткани внутренних органов (печени, почек, сердца, легких) экспериментальных животных, которые промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и гомогенизировали в 1 мл 1* PBS.
Процессы перекисного окисления липидов и показатели антиоксидантной защиты исследовали с помощью спектрофотометра SPECORD 40, определяя в тканях печени, почек, легких и сердца содержание диеновых конъюгатов и малонового диальдегида, суммарное содержание низкомолекулярных антиоксидантов и активность каталазы.
Диеновые конъюгаты, образовавшиеся в результате миграции двойной связи в полиненасыщенных жирных кислотах, определяли по Даниловой [5]. После экстракции в смеси гептан-изопропанол (2:1) и последующего добавления раствора HCI (pH 2,0), диеновые конъюгаты выявляли
* Работа выполнена при финансовой поддержке госзадания Минобрнауки РФ №6.1766.2017.ПЧ, проекта СВФУ им. М.К. Аммосова: «Генетические особенности населения Якутии: структура генофонда, адаптация к холоду, психогенетические характеристики, распространенность некоторых наследственных и инфекционных заболеваний» и программы биоресурсных коллекций ФАНО России УНУ «Геном Якутии» ЯНЦ КМП (БРК: 0556-2017-0003).
в гептановой фазе при Х=233 нм, используя коэффициент их молярной экстинкции - 2,2х105 М-1хсм-1. Количество диеновых конъюгатов выражали в мкмоль/г ткани.
Метод определения малонового диальдегида основан на образовании при высокой температуре окрашенного триметинового комплекса с тиобарбитуровой кислотой [6]. Его оптическую плотность измеряли при Х=532 нм, в сравнении с контрольной пробой. Молярная экстинкция малонового диальдегида - 1,56х105 М-1хсм-1. Концентрацию малонового диальдегида выражали в нмоль/г ткани.
Определение суммарного содержания низкомолекулярных антиоксидантов основано на способности восстанавливать Fe(III) до Fe(II) в присутствии антиоксидантов в спиртовом растворе образца [7]. Количество образовавшегося Fe(II) определяли добавлением орто-фенантролина, в результате образовывался окрашенный комплекс, который определяли при длине волны Х=510 нм. С использованием серии стандартных растворов дигидрата кверцетина в диапазоне концентраций 0,10-0,025 мг/мл было установлено значение коэффициента молярной экстинции комплекса [о-фенантролин]^е(П) равное 5,28х104 М-1хсм-1. Уровень суммарного содержания низкомолекулярных антиоксидантов выражали в мг-экв кверцетина/г ткани.
Активность каталазы определяли при Х=410 нм методом, основанным на способности пероксида водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс [8]. Миллимолярный коэффициент экстинции перекиси водорода составил 22,2х103 мМ-1хсм-1. За единицу активности каталазы принимали то количество фермента, которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 сек. при заданных условиях.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 19. Достоверность различий между средними оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Результаты в таблицах представлены в виде M±m, где M - среднее, m - ошибка среднего. Вероятность справедливости нулевой гипотезы принимали при уровне значимости p<0,05.
Исследование одобрено Локальным комитетом по биомедицинской этике при Якутском научном центре комплексных медицинских проблем.
Результаты и обсуждение. Измерение температуры с помощью электротермометра с игольчатым датчиком показало, что влияние холода, прежде всего, проявляется в понижении температуры лапок и хвоста крыс. При экспонировании животных в течение 1 ч (-10±2) 0С температура лапок понижалась до (+20,5±0,5) 0С, хвоста -до (+21,4±0,7) 0С. В интактной группе крыс температура лапок была равна (+27,3±0,8) 0С, хвоста - (+25,1±0,6) 0С. Уменьшение температуры свидетельствует о нарушении микроциркуляции в конечностях подопытных животных. Как известно, это приводит к гипоксии тканей. Из-за нехватки кислорода в митохондриях происходит генерация активных форм кислорода, которые служат инициаторами перекисного окисления липидов [3].
У крыс опытной группы, концентрация малонового диальдегида была значительно ниже, чем в контроле, в тканях печени - в 1,6 раза, почек - в 1,7 раза, лёгких - в 3,0 раза, миокарда - в 1,1 раза. Содержание диеновых коньюгатов у подопытных животных в печени и миокарде было выше в 1,7 раза, почках - в 5,6 раза, легких - в 1,4 раза (табл. 1).
Концентрация низкомолекулярных антиоксидантов у животных опытной группы была достоверно выше, по сравнению с контрольной, в тканях печени в 1,8 раз, почек - в 2,0 раза, легких - в 22,0 раза. Отмечена тенденция к повышению содержания этих веществ в ткани миокарда (в 1,02 раза). Активность каталазы была значительно ниже
Таблица 1. Концентрация диеновых коньюгатов и малонового диальдегида в тканях внутренних органов экспериментальных животных
Орган Диеновые коньюга-ты, мкмоль/г Малоновый диаль-дегид, нмоль/г
тк™ь опыт троль тк°нь опыт троль
Печень 3,79±0,18 6,52±0,39* 10,73±0,52 6,64±0,33* Почки 1,00±0,01 5,55±0,27* 16,30±0,81 9,74±0,47* Легкие 5,13±0,20 7,10±0,35* 15,25±0,76 5,02±0,25* Сердце 2,66±0,13 4,51±0,21* 6,34±0,31 5,83±0,24
* р<0,05, по сравнению с контрольной группой
контрольных значений: в тканях печени в 1,4 раза, почек и легких - в 1,7 раза, миокарда - в 1,5 раза (табл. 2).
У крыс при экспозиции на холоде перекисные процессы во всех органах протекали активнее на начальных этапах, о чем свидетельствует накопление их первичных продуктов -диеновых коньюгатов, а уровень конечного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида был во всех органах ниже, чем у интактных животных.
Таблица 2. Суммарное содержание низкомолекулярных антиоксидантов и активность каталазы в тканях внутренних органов экспериментальных животных
Орган Суммарное содержание низкомолекулярных антиоксидантов, мг-экв кверцетина/г Каталаза, мккат/г
контроль опыт опыт троль
Печень 16,54±2,14 29,78±1,45* 21,15±1,78 15,14±2,52* Почки 38,12±2,47 76,57±3,62* 17,48±1,65 10,45±4,62* Легкие 2,14±0,18 44,18±2,35* 17,12±0,12 9,89±4,45* Сердце 32,47±0,17 33,21±1,47 13,24±1,35 8,56±1,21*
* р<0,05, по сравнению с контрольной группой
Значительное повышение уровня диеновых коньюгатов (в 5,6 раза) в тканях почек можно объяснить тем, что при воздействии холода на организм экспериментальныхживотных усиливалось кровообращение и потребление кислорода их тканями. Но в результате выброса надпочечниками кате-холаминов и глюкокортикоидов возник спазм микроцир-куляторного русла, вызывающий гипоксию, которая активировала перекисные процессы на начальных этапах. По литературным данным на гипоксию указывает увеличение количества мезангиоцитов и нефроцитов с пикнотичными ядрами в дистальных канальцах, а также объемной доли митохондрий в цитоплазме нефроцитов [9].
Катехоламины и глюкокортикоиды, выделяемые надпочечниками при воздействии низких температур, необходимы для выработки тепла. Они активируют липолиз, а образующиеся в результате жирные кислоты служат не только «топливом», но и важнейшим регулятором - разобщителем дыхания и фосфорилирования, упрощающим путь превращения энергии дыхательных субстратов в тепло [10]. Уменьшение концентрации малонового диальдегида в организме экспериментальных животных может быть связано с его утилизацией при интенсификации процессов метаболизма, вызванных увеличением концентрации катехоламинов в ответ на воздействие холода, а также увеличением синтеза низкомолекулярных антиоксидан-тов, которые способны замедлять процессы перекисного окисления липидов.
Так, в ткани легких мы наблюдали самое значительное снижение концентрации малонового диальдегида (в 3,0 раза), что объясняется наибольшим повышением уровня низкомолекулярных антиоксидантов (в 22,0 раза). Это, в свою очередь, связанно с их мобилизацией в ответ на
стрессорное воздействие низких температур и согласуется с литературными данными, в которых показано повышение концентрации а-токоферола, глутатиона и аскорбиновой кислоты в ответ на стрессовые воздействия [11, 12].
Увеличение концентраций низкомолекулярных анти-оксидантов в тканях печени в 1,8 раза обусловлено тем, что в ней происходит синтез большинства эндогенных антиоксидантов, как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных. Кроме того, гепатоциты способны накапливать жирорастворимые антиоксиданты (витамины Е, А), которые мобилизируются при стрессовых воздействиях.
Снижение активности каталазы в тканях всех органов у экспериментальных животных подтверждает тот факт, что в механизме адаптации организма крыс к многократному кратковременному воздействию холода низкомолекулярным антиоксидантам принадлежит ведущая роль.
Таким образом, при воздействии на организм экспериментальных животных низких температур в течение 2 недель, происходит повышение содержания в тканях внутренних органов ненасыщенных жирных кислот. Об этом свидетельствует накопление первичного продукта перекисного окисления липидов - диеновых коньюгатов, при одновременном снижении содержания конечного продукта этого процесса - малонового диальдегида. Изменение концентрации последнего можно объяснить интенсификацией метаболических процессов, благо-
даря которым может произойти его утилизация, а также увеличением синтеза низкомолекулярных антиокси-данов, которое мы наблюдали во всех тканях органов. Кроме того, отмечено снижение активности каталазы в тканях органов (печени, почках, легких, сердца) крыс.
Выводы. Воздействие низких температур на организм крыс сопровождает накопление в тканях внутренних органов начальных продуктов перекисного окисления липидов - диеновых коньюгатов и уменьшением конечных продуктов - малонового диальдегида. Концентрация малонового диальдегида была ниже контрольных значений в тканях печени в 1,6 раза, почек - в 1,7 раза, легких - в 3,0 раза, миокарда - в 1,1 раза. Уровень диеновых коньюгатов был выше, в сравнении с интактной группой, в тканях печени в 1,7 раза, почек - в 5 раз, легких - в 1,4 раза, миокарда - в 1,7 раза.
Кратковременное воздействие низких температур на организм крыс приводит к уменьшению активности каталазы и увеличению синтеза низкомолекулярных антиоксидантов в тканях внутренних органов. Суммарное содержание низкомолекулярных антиоксидантов было выше, в сравнении с контрольной группой, в тканях печени в 1,8 раз, почек - в 2,0 раза, легких - в 22,0 раза, сердца - в 1,02 раза. Активность каталазы была ниже контрольных значений в тканях печени в 1,4 раза, почек - в 1,7 раза, легких - в 1,7 раза, миокарда - в 1,5 раза.
Литература.
1. Кличханов Н. К., Исмаилова Ж Г., Астаева М. Д. Интенсивность свободнорадикальных процессов в крови крыс при глубокой гипотермии и в ходе самосогревания // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2016. Т.1. № 5 (111). С. 104-109.
2. Эффективность природных антиоксидантов при адаптации организма к холоду / Е Ю. Юртаева, В. А. Доровских, Н. В. Симонова и др. //Бюллетень физиологии и патологии дыхания, 2017. Выпуск 63. С. 70-74.
3. Bhattacharya S. Reactive oxygen species and cellular defense system// Free radicals in human health and disease. 2015. Рр. 17-29.
4. DHA reduces oxidative stress following hypoxia-ischemia in newborn piglets: a study of lipid peroxidation products in urine and plasma / M. U. Huun, H. T. Garberg, J. Escobar, eta //J Perinat Med. 2018. № 46 (2). Рр. 209-217.
5. Evaluation of the Antioxidant Activity of Ethanolic Extracts of Some Varieties of Onion / M. C. Gutirrez, P. D. Rocca, E. G. Seta, etс. //Food and Nutrition Sciences. 2013. № 4. Рр. 1260-1265.
6. Влияние гимантана на уровень продуктов перекисного окисления липидов в головном мозге при экспериментальном паркинсо-ническом синдроме/Е. А. Иванова, И. Г. Капица, Н. Н. Золотов и др. //Фармакокинетика и фармакодинамика. 2016. № 3. С. 9-12.
7. Ермаков А. И. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987.430 с.
8. Hussein N. A., Mahmoud H. H. Clinicaland thermodynamicalproperties of catalase enzyme in sera of Iraqi diabetic patients//BioTechnology An Indian Journal. 2016. № 12 (1). Рр. 34-38.
9. Динамика ультраструктурных изменений почек при общем переохлождениии организма / Ю. А. Арбыкин, Ф. В. Алябьев, В. Э. Янковский и др. // Сибирский медицинский журнал. 2015. Т. 30. № 3. С. 65-68.
10. Панин Л. Е. Особенности энергетического обмена // Механизмы адаптации человека в условиях высоких широт. Л.: Медицина. 1980. С. 87-97.
11. Impact of acute and subchronic inhalation exposure to PbO nanoparticles on mice / J. Lebedova, Z. Novakova, Z. Vecera, etс. // Nanotoxicology. 2018. № 12(4). Рр. 290-304.
12. Oxidation increases mucin polymer cross-links to stiffen airway mucus gels/S. Yuan, M. Hollinger, M. E. Lachowicz-Scroggins, eta//Sci Transl Med. 2015. № 7. Рр. 276.
INFLUENCE OF LOW TEMPERATURES ON LIPID PEROXIDATION IN TISSUES OF EXPERIMENTAL ANIMALS
V. M. Nikolaev1, L. P. Koryakina2, S. A. Fedorova3
'Yakutsk Scientific Center of Complex Medical Sciences, Sergelyakhskoe sh. 4, Yakutsk, 677010, Russian Federation 2M. K. Ammosov North Eastern Federal University, st. Belinskogo, 58, Yakutsk, 677000, Russian Federation 3Yakutsk State Agricultural Academy, st. Krasil'nikova, 15, Yakutsk, 677007, Russian Federation
Abstract. The authors determined the influence of low temperatures (-10 ± 2) C on the processes of lipid peroxidation in tissues of viscera (liver, kidneys, lungs, heart) of rats. An experimental and control group consisted of eight Wistar rats. Animals from the experimental group were exposed to the cold temperature for 14 days. In cold, the temperature of paws, measured by an electric thermometer with a needle sensor, decreased by 6.8 C to (+20.5 ± 0.5) C and of the tail - by 3.7 C to (+21.4 ± 0.7) C, in comparison with the control. It indicates a violation of microcirculation and occurrence of hypoxia in the limbs and, as a result, intensification of peroxide processes. At the end of the experiment, 100 mg of liver, kidney, lung and heart tissue were sampled, which were examined using SPECORD 40 spectrophotometer. In the experimental animals, the concentration of malondialdehyde, the end product of lipid peroxidation, was significantly lower than control values: 1.6 times in the liver tissues (6.64 nmol/g), 1.7 times in kidneys (9.74 nmol/g), 3.0 times in lungs (5.02 nmol/g). The level of diene conjugates, primary products of lipid peroxidation, was reliably higher, in comparison with the intact group, in liver tissues - 1.7 times (3.79 micromol/L), kidneys - 5.6 times (5.55 micromol/L), lungs - 1.4 times (7.10 micromol/L), myocardium - 1.7 times (4.51 micromol/L). The total content of low-molecular antioxidants was reliably higher, in comparison with the control group, in the liver tissues - 1.8 times (29.78 mg-eq/g of quercetine), kidneys - 2.0 times (76.57 mg-eq/g of quercetine), lungs -22.0 times (44.18 mg-eq/g of quercetine). The catalase activity was significantly lower than the control values: in the liver tissue - 1.4 times (15.14 microkat/g), in kidneys - 1.7 times (10.45 microkat/g), in lung - 1.7 times (9.89 microkat/g), in myocardium - 1.5 times (8.56 microkat/g). Keywords: low-temperature effect; lipid peroxidation; free radical lipid oxidation; lipoperoxidation; active oxygen species; malondialdehyde; diene conjugates; experimental animals; spectrophotometric methods; electrothermometer with a needle sensor; adaptation. Author Details: V. M. Nikolaev, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow (е-mail: Nikolaev1126@mail.ru); L. P Koryakina, Cand. Sc. (Vet.), head of department; S. A. Fedorova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory.
For citation: NikolaevV M., Koryakina L. P., Fedorova S. A. Influence of Low Temperatures on Lipid Peroxidation in Tissues of Experimental Animals. Dostzheniyanaukiitekhniki APK 2018. Vol. 32. No. 4. Pp. 62-64 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10415.
