CC BY
6УДК 57.022, 57.044
ВЛИЯНИЕ НИТРАТА И СУЛЬФАТА КОБАЛЬТА НА ОСМОТИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ
Филончикова Е.С., студент группы 13Био(ба)Бх, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: filonchikova@inbox.ru
Научный руководитель: Барышева Е.С., д. мед. н., доцент, заведующий кафедрой биохимии и микробиологии, ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет», Оренбург
В статье представлены данные о влиянии сульфата и нитрата кобальта на осмотическую устойчивость мембран эритроцитов крови человека. Ионы кобальта способны непосредственно инициировать перекисное окисление липидов, вытеснять железо из гема и гемопротеинов. Активация перекисного окисления липидов в комплексе с образованием свободных радикалов при токсических воздействия тяжелых металлов приводит к повреждениям мембран, вследствие чего устойчивость клеток в целом существенно снижается.
Ключевые слова: эритроцит, мембранная резистентность, кобальт, осмотическая резистентность.
Актуальность. В настоящее время все большее внимание уделяется вопросам изучения влияния ионов тяжелых металлов на живые организмы, в частности на устойчивость мембран эритроцитов крови человека.
Главным образом токсическое воздействие тяжелых металлов проявляется на биологической мембране [1].
Исследования изменения проницаемости мембран эритроцитов крови человека имеют важное значение для своевременного выявления патогенеза возникающих патоморфологических и биохимических сдвигов при различных заболеваниях и воздействиях на мембрану, в том числе и влиянии тяжелых металлов.
Для оценки физико-химических свойств эритроцитов исследуют стойкость (резистентность) эритроцитов к различным воздействиям. Наибольшей популярностью в клинической практике пользуются исследования осмотической резистентности эритроцитов [2].
М.О. Трусевичем изучено влияние тяжелых металлов (хлориды Со, Mn, Ni, Zn) в конечных концентрациях от 0,008 до 1 мМ. На основании результатов этих исследований сообщается о том, что все тяжелые металлы в концентрации свыше 0,008 мМ оказывают токсическое воздействие на резистентность эритроцитарной мембраны, исключая значения концентрации 0,04 мМ. Для хлорида Zn отмечено снижение уровня гемолиза эритроцитов в концентрации 0,04 мМ [1, 5].
Установлено, что вышеуказанные ионы тяжелых металлов оказывают влияние на мембранную устойчивость эритроцитов, которая выражается в изменении плотности последних.
Таким образом, исследование нарушения проницаемости мембран эритроцитов крови имеет важное значение для своевременного выявления патогенеза возникающих патоморфологических и биохимических сдвигов при различных заболеваниях и воздействиях на мембрану, в том числе и влиянии тяжелых металлов
Кобальт - один из эссенциальных микроэлементов, жизненно необходимых организму. Данный элемент входит в состав кобаламина (витамин В12 ). Кобальт участвует в
процессах кроветворения, задействован в функциях нервной системы и печени, а также ферментативных реакциях. Потребность человека в кобальте - 0,007-0,015 мг, ежедневно.
Кобальт как биологический элемент имеет влияние на обмен веществ, но наиболее выраженное на кроветворение, а именно: определенные количества вещества стимулируют образование красных кровяных клеток и гемоглобина, однако высокие, токсические дозы угнетают продукцию эритроцитов. Наиболее токсичными считаются легко растворимые соли кобальта, главным образом углекислые и хлористые).
Избыток кобальта ингибирует абсорбцию железа, блокируя его транспортные системы. Ионы двухвалентного кобальта подавляют потребление кислорода в митохондриях клеток сердца. Соли двухвалентного кобальта ингибируют окислительные ферменты. Токсичность кобальта также связывают с инактивацией тиоловых групп (например, липоевой кислоты) в тканях. Кобальт оказывает общетоксическое, аллергическое и мутагенное действие. Летальная доза данного микроэлемента для человека - более 0,5 г/сутки. [3]
Хронические интоксикации, обусловленные высокими дозами хлорида кобальта, сопровождаются активацией процессов перекисного окисления липидов клеточных мембран, что доказывает статистически достоверное повышение концентрации малонового диальдегида в мембранах эритроцитов. [4]
Цель настоящего исследования - изучение влияния сульфата и нитрата кобальта на осмотическую устойчивость мембраны эритроцита, а так же сравнение эффектов, оказываемых этими солями на мембрану.
Методы исследования. Подготовка образцов. Для проведения исследования необходима свежая гепаринизированная кровь. В две стерильные пробирки с предверительно внесенными 2 каплями гепарина берут по 1,5 мл крови, перемешивают и одну используют для исследования, вторую - оставляют на сутки в термостате. Таким образом необходимо подготовить по 3 пробирки для исследования и инкубирования в термостате.
Приготовление рабочих растворов. В качестве основного раствора используется 0,9% физиологический раствор хлорида натрия, рН = 7,4. Из данного раствора готовят рабочие растворы хлорида натрия следующих концентраций 0,85; 0,75; 0,70; 0,65; 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20; 0,10%
Ход определения. В ряд центрифужных пробирок (14 штук) разливают по 5 мл рабочих растворов хлорида натрия концентрации от 0,9 до 0,10 %. В каждую центрифужную пробирку добавляют по 0,02 мл перемешанной гепаринизированной крови и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Центрифугируют смесь крови с растворами хлорида натрия при 2000 об/мин в течение 5 мин. Из каждой пробирки сливают надосадочную жидкость и измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500 - 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы [6].
Холостая проба - надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 0,9 % раствор хлорида натрия.
Для изучения влияние солей кобальта на мембраны эритроцитов в пробирки с кровью добавляют необходимое количество солей кобальта (сульфата или нитрата) для получения 0,1 н раствора. После этого выжидают экспозицию в 30 минут и продолжают опыт по вышеописанной методике.
Через сутки повторяют опыты с кровью, инкубированной в термостате при 37 °С.
Рассчеты. Процент гемолиза вычисляли в каждой пробирке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, принятой за 100 %, по формуле:
Ех X 100
х = -ЁГ~
где X - процент гемолиза;
ЕХ - экстинкция исследуемой пробы;
100 - процент гемолиза в пробирке с 0,1 % раствором хлорида натрия;
Е1 - экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% раствором хлорида
натрия.
За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей 0,1 % раствор хлорида натрия.
Результаты и обсуждения. Осмотическая резистентность эритроцитов характеризует устойчивость мембран этих клеток по отношению к разрушающим факторам: химическим, температурным, а также механическим. В лабораторных исследованиях особое внимание уделяется определению стойкости клеток крови к гипотоническим растворам хлорида натрия, а именно, тому какая концентрация вызывает гемолиз эритроцитов. Нормально функционирующие клетки сопротивляются осмосу и сохранят прочность в определенных пределах концентраций хлорида натрия - это характеризует осмотическую резистентность эритроцитов.
У здоровых людей в свежей крови гемолиз (минимальная резистентность эритроцитов) начинается при концентрациях хлорида натрия 0,50-0,45 %, а полный гемолиз (максимальная резистентность эритроцитов) наблюдается в 0,40-0,35% растворе натрия хлорида, в инкубированной (в течение суток) начало гемолиза - 0,65% , полный - 0,20 %
ша.
Понижение осмотической резистентности, т. е. появление гемолиза эритроцитов при более высокой, чем в норме, концентрации хлорида натрия (0,70-0,75%), наблюдается при наследственном микросфероцитозе и некоторых наследственных несфероцитарных гемолитических анемиях, а также иногда при аутоиммунной гемолитической анемии. Повышение осмотической резистентности характерно для талассемии, гемоглобинопатий. В ряде случаев понижение осмотической резистентности выявляется только при исследовании инкубированной крови [6].
Воздействие ионов тяжелых металлов приводят к изменениям физико-химического состава эритроцитов, проявляющимся в непостоянстве их устойчивости, возникающем при повреждении мембран клеток [7].
Ионы кобальта способны непосредственно инициировать перекисное окисление липидов, вытеснять железо из гема и гемопротеинов. Усиление перекисного окисления липидов, а также образования свободных радикалов при токсических воздействия тяжелых металлов приводит к повреждениям мембран, вследствие чего устойчивость клеток в целом существенно снижается.
По результатам данного исследования можно проследить изменения резистентности эритроцитарных мембран, происходящие при воздействии 2 различных солей кобальта (рисунок 1, 2, 3, 4).
При исследовании свежей крови были получены следующие результаты: по отношению к контрольным показателям наблюдается понижение осмотической устойчивости клеток крови. В контрольном образце начало гемолиза отмечается при концентрации хлорида натрия 0,50 %, полный гемолиз - 0,35 %. Тогда как в образце, содержащем сульфат кобальта начало гемолиза отмечается при концентрации 0,55 %, полный гемолиз - 0,10 %.
120 100 80
^ 60 Ч
§ 40
(н
20 0 -20
" • * И М ^ - 1*
"I ■ "Т I1 в» Г1 I 'г—I-1-1-1-1-1-г
0,85 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,2 0,1
концентрация хлорида натрия, %
■ контроль сульфат кобальта
Рисунок 1 - Влияние сульфата кобальта на осмотическую устойчивость мембран эритроцитов
Начало гемолиза в образце с нитратом кобальта отмечается при 0,50 % хлорида натрия, полный гемолиз - 0,10 %.
120 100 80 60 40 20
-20
0 —1Ц.Г
I I I I I I
0,85 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,2 0,1
■— контроль
- нитрат кобальта
концентрация хлорида натрия, %
Рисунок 2 - Влияние нитрата кобальта на осмотическую устойчивость мембран эритроцитов
-■— контроль,
термостатированный
-•- - сульфат кобальта, термостатированный
Рисунок 3 - Влияние сульфата кобальта на осмотическую устойчивость мембран эритроцитов в инкубированной крови
Исследования инкубированной в течение суток крови показали: начало гемолиза в контрольном образце отмечается при концентрации хлористого натрия равной 0,65 %, в опытном образце, содержащем сульфат кобальта - 0,65 %. Полный гемолиз контрольного образца происходит при концентрации основного раствора равной 0,25 %, опытного - 0,35 % . Исходя из графика полный гемолиз опытного образца, содержащего сульфат кобальта, происходит при более высоких концентрациях гипотонического раствора хлорида натрия, что может свидетельствовать о более низкой резистентности по сравнению с контрольным образцом.
В опытном образце крови, содержащем нитрат кобальта начало гемолиза было отмечено при концентрации раствора натрия хлорида равной 0,75 %, а полный гемолиз происходил при концентрации 0,35 %, что также указывает на понижение устойчивости мембран эритроцитов при воздействии данной соли кобальта на клетку.
-■— контроль,
термостатированный
-•- - нитрат кобальта,
термостатированный
Рисунок 4 - Влияние нитрата кобальта на осмотическую устойчивость мембран эритроцитов в инкубированной крови
Выводы. Исходя из результатов исследования, представленных на графиках можно сделать вывод о том, что в целом влияние сульфатов и нитратов кобальта выражается в понижении осмотической устойчивости мембран клеток крови. Снижение резистентности к пониженным концентрациям хлорида натрия также может быть интепретировано как снижение устойчивости клеток и к другим воздействиям
Литература
1. Бойтлер, Э. Нарушение метаболизма эритроцитов и гемологическая анемия / Э. Бойтлер; пер. с англ. - М.: Медицина, 1981. - 256 с.
2. Карпищенко, А.И. Медицинские и лабораторные технологии. Справочник. / под общ. ред. А.И. Карпищенко. - СПб: Интермедика, 1998. - Т.1. - С. 283-284.
3. Набивач, В.М. Основы экологического нормирования и промышленной токсикологии: учеб. пособие / В.М. Набивач, М.П. Сухой. - Днепропетровск: УГХТУ, 2010. - 235 с.
4. Дзугкоева, Ф.С. Механизмы токсического влияния хлорида кобальта на биохимические и функциональные показатели в эксперименте / Ф.С. Дзугкоева, Е.А. Такоева, С.Г. Дзугкоев, Ж.Р. Битарова, А.И. Тедтоева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т. 13. - № 1(7). - С. 1698-1701.
5. Трусевич, М.О. Изучение гемолиза эритроцитов под воздействием тяжелых металлов. Экология человека и проблемы окружающей среды в постчернобыльский период / М.О. Трусевич // Материалы респуб. научн. конференции. - Минск, 2009. - 50 с.
6. Идельсон, Л.И. Справочник по функциональной диагностике / под ред. И.А. Кассирского. - М.: Медицина, 1970. - С. 401-402.
7. Кочарли, Н. К. Влияние ионов тяжелых металлов на мембранную устойчивость эритроцитов в норме и при различной патологии организма. / Н. К. Кочарли, С. Т. Гумматова, Х. Д. Абдуллаев, Н. М. Зейналова // Фундаментальные исследования. - 2012. -№ 11-2. - С. 299-303.
