Влияние гистохрома на осмотическую резистентность эритроцитов в экспериментах in vitro и in vivo

Талалаева О.С.; Зверев Я.Ф.; Замятина С.В.; Брюханов В.М.; Лампатов В.В.

ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

УДК 615.32:615.273-092.4

ВЛИЯНИЕ ГИСТОХРОМА НА ОСМОТИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO

О.С. Талалаева, Я.Ф. Зверев, С.В. Замятина, В.М. Брюханов, В.В. Лампатов

ГБОУ ВПО "Алтайский государственный медицинский университет" Минздрава России, Барнаул

E-mail: [email protected]

THE EFFECT OF HISTOCHROME ON THE OSMOTIC RESISTANCE OF RED BLOOD CELLS IN THE IN VITRO AND IN VIVO EXPERIMENTS

O.S. Talalaeva, Ya.F. Zverev, S.V. Zamyatina, V.M. Bryukhanov, V.V. Lampatov

Altai State Medical University, Barnaul

Цель: изучить возможное мембраностабилизирующее действие гистохрома in vitro и in vivo. Мембраностабилизирующее действие препарата изучали на модели осмотического гемолиза эритроцитов с применением растворов убывающих осмотических концентраций хлорида натрия от 190 до 100 мосм/л с интервалом в 10 мосм/л. В опытах in vitro исследовали эффект исходных концентраций гистохрома 1-10-3, 1-10-4 и 1-10-5 М/л. Двум группам крыс линии Wistar (n=15) в течение десяти дней in vivo подкожно вводили 10 и 1 мг/кг препарата. Контролем служила группа интактных животных (n=19). Установлено, что in vitro в концентрациях 1-10-4 и 1-10-5 М/л гистохром несколько усиливал гемолиз эритроцитов. Введение гистохрома подопытным животным сопровождалось дозозависимым повышением осмотической резистентности мембран эритроцитов. При этом наиболее выраженный мембранстабилизирующий эффект препарата отмечался у крыс, получавших гистохром в дозе 10 мг/кг. Различный эффект in virto и in vivo позволяет предположить, что гистохром влияет на проницаемость клеточных мембран посредством нескольких механизмов. По-видимому, некоторое усиление гемолиза в первом случае опосредовано прямым воздействием эхинохрома на клеточные мембраны, а во втором - является результатом изменения активности эндогенных мембранотропных механизмов.

Ключевые слова: гистохром, осмотическая резистентность мембран.

The aim of the study was to examine the in vitro and in vivo effects of histochrome on membrane stabilization. The membrane-stabilizing effects of histochrome were studied in red blood cell by using the model of osmotic hemolysis. The solutions with different osmolarity were applied in 10-m0sm/L intervals: the decreasing osmotic concentrations of sodium chloride (NaCl) ranged from 190 to 100 mOsm/L. In the in vitro experiments, the effects of histochrome were studied with the initial concentrations of this compound (1.0, 0.1 and 0.01 microM/L). In the in vivo experiments, two groups of Wistar rats (n=15) received subcutaneous injections with histochrome in daily doses of 10 mg/kg and 1 mg/kg during 10 days. The control group included intact healthy animals (n=19). The study showed that the in vitro treatment with histochrome in concentrations of 0.1 and 0.01 microM/L slightly potentiated hemolysis. The administration of histochrome injections was associated with a dose-dependent increase in the osmotic resistance of red blood cells. The highest membrane-stabilizing effect of the studied compound was documented in rats treated with 10-mg/kg histochrome. The differential effect of histochrome in the in vitro and in vivo experiments may suggest that this compound affects permeability of the cell membrane via several mechanisms. Some potentiation of hemolysis in the first instance is likely caused by the direct effect of echinochrome on cell membranes. In the second instance, the dose-dependent increase in the osmotic resistance of red blood cells results from modulation of the endogenous membrane-tropic mechanisms.

Key words: histochrome, osmotic resistance of membranes.

Введение

Новый природный антиоксидант гистохром представляет собой водорастворимую лекарственную форму эхинохрома (2, 3, 5, 6, 8-пентагидрокси-7-этил-1,4-нафтохи-нон), хиноидного пигмента морских беспозвоночных

[10]. Разработанный сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН препарат не имеет аналогов в мире и, в отличие от основных эндогенных антиоксидантов, одновременно блокирует ряд звеньев свободнорадикальных реакций [6, 8].

В свою очередь, мощный антиоксидантный эффект гистохрома наводит на мысль о его возможном мембранопротекторном действии. На способность гистохрома изменять проницаемость клеточных мембран указывает как опыт его практического применения, так и отдельные экспериментальные исследования. В частности, клиническая апробация гистохрома в трех ведущих клиниках глазных болезней страны показала выраженную эффективность препарата в комплексном лечении синдрома отечной роговицы. Кроме того, установлено, что гистохром снижает внутриглазное давление у пациентов с глаукомой и обладает рассасывающим действием [7, 10]. Не исключено, что мембранотропный эффект препарата лежит в основе и его противовоспалительной активности [6, 8]. Экспериментально показано, что, не влияя не пролиферативный компонент воспаления, гистохром резко угнетает его экссудативную фазу [12]. При этом последний эффект сопоставим с действием классических нестероидных противовоспалительных средств. Не исключено, что с изменением проницаемости тканевых барьеров связано и диуретическое действие препарата [11, 13]. Более того, изучая почечные эффекты гистохрома, мы установили, что препарат защищает нефроциты от повреждения при экспериментальной мочекаменной болезни у крыс. Применение гистохрома при экспериментальной патологии почек обеспечило снижение содержания в суточной моче подопытных животных у-глю-тамилтрансферазы, которая, как известно, является преимущественно мембранным ферментом паренхиматозных органов. Попутно заметим, что положительная динамика выявлялась и со стороны экскреции с мочой двух других маркерных энзимов: лактатдегидрогеназы и N-ацетил-в-Б-глюкозаминидазы (данные не опубликованы).

На мембраностабилизирующие свойства гистохрома косвенно указывает и антиаритмический эффект препарата, хорошо известный в кардиологической практике. Улучшение реологических свойств крови - уменьшение времени фильтрации эритроцитов и повышение их электрофоретической активности - также может быть обусловлено мембранотропным эффектом гистохрома [5, 8]. И, наконец, проведенные в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН исследования показали способность гистохрома задерживать гемолиз эритроцитов при рН 5,5 (50цМ) [9]. Все вышеизложенное указывает на возможное мембраностабилизирующее действие гистохрома.

Цель работы: изучить возможное мембранстабилизи-рующее действие препарата гистохром на модели осмотической резистентности мембран эритроцитов.

Материал и методы

Эксперименты in vivo выполнены на крысах линии Wistar обоего пола массой 180-220 г. Животные были разделены на три группы. Первая (контрольная) группа состояла из 19 интактных крыс. Второй группе (подопытная группа), включавшей 15 животных, в течение 10 дней подкожно вводили гистохром в дозе 10 мг/кг. Третья группа крыс (подопытная) на протяжении 10 дней получала

подкожно гистохром в дозе 1 мг/кг (n=15). По окончании курса введения препарата у крыс под эфирным наркозом из брюшной аорты забирали кровь.

В экспериментах использовали препарат “Гистохром, раствор для внутривенного введения 1%” (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток).

Возможное мембраностабилизирующее действие гистохрома изучали на модели осмотического гемолиза эритроцитов с применением растворов убывающих осмотических концентраций хлорида натрия от 190 до 100 мосм/л с интервалом в 10 мосм/л. При этом захватывались зоны концентраций солевого раствора, в пределах которых начинается и заканчивается гемолиз [2].

В пробирки с разведениями хлорида натрия вносили

0,05 мл исследуемой крови. Пробы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и центрифугировали при 2000 об./мин 5 мин. Степень гемолиза эритроцитов оценивали фотометрически при длине волны 436 нм против дистиллированной воды при толщине слоя раствора 1 см. Учитывая, что экстинкция раствора прямо пропорциональна концентрации гемоглобина, можно вычислить процент гемолиза эритроцитов (X) при различных разведениях хлорида натрия по формуле:

X=(VEmJ-l°0,

где Е0 - экстинкция исследуемой пробы, Е^ - экстинк-ция, соответствующая 100% гемолизу, X - процент гемолиза.

В опытах in vitro к разведениям хлорида натрия добавляли 0,8 мл раствора гистохрома в исходных концентрациях 1*10-3, 1-10-4 и 1-10-5 М/л. Затем в исследуемые гипотонические растворы вносили 0,05 мл крови интак-тных крыс.

Умерщвление подопытных животных производили передозировкой эфирного наркоза с соблюдением требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей (Страсбург, 1986), и Федеральным законом Российской Федерации “О защите животных от жестокого обращения” от 01.01.1997.

Полученные результаты обрабатывали статистическим методом вариационных рядов с использованием критерия Манна-Уитни. Все расчеты велись по общепринятым формулам. Результаты представлены в виде M±m, где M - выборочное среднее, m - ошибка среднего, n - выборка для каждой из групп в конкретный период эксперимента. Разница сравниваемых средних считалась статистически значимой, если показатель достоверности (p) был меньше 0,05.

Результаты и обсуждение

В экспериментах in vitro установлено, что гистохром не оказал существенного влияния на осмотическую резистентность мембран эритроцитов. Более того, как видно из таблицы, в концентрациях 1-10-4 и 1-10-5 М/л он даже несколько усиливал гемолиз эритроцитов в диапазоне концентраций натрия хлорида 170-190 мосм/л.

Как видно из рисунка 1, в экспериментах in vitro наблюдалась иная картина. Выяснилось, что введение гис-

Таблица

Влияние различных концентраций гистохрома на осмотическую резистентность мембран эритроцитов крови крыс в эксперименте in vitro

Концентрация NaCl, мосм/л Контроль Исследуемые концентрации гистохрома

1-10-3 М/л 1-10-4 М/л 1-10-5 М/л

190 1,4+0,19 (n=18) 1,8+0,20 (n=12) 2,2+0,36* (n=13) 4,7+1,36* (n=12)

180 4,1+0,64 (n=19) 5,1+1,20 (n=13) 7,6+1,53* (n=13) 11,4+3,74* (n=14)

170 21,7+3,06 (n=19) 21,96+5,24 (n=11) 28,4+5,54 (n=12) 35,1+6,24* (n=13)

160 38,1+5,69 (n=18) 41,6+7,21 (n=13) 48,3+6,70 (n=13) 49,7+6,88 (n=14)

150 62,7+5,18 (n=18) 61,5+7,77 (n=12) 64,9+8,04 (n=13) 69,7+6,50 (n=13)

140 77,4+2,96 (n=18) 74,6+4,95 (n=12) 78,6+5,51 (n=13) 81,3+3,41 (n=13)

130 93,6+1,28 (n=18) 88,1+2,53 (n=12) 89,6+2,96 (n=13) 89,7+2,46 (n=13)

120 93,3+1,74 (n=19) 88,2+2,62 (n=12) 92,5+2,46 (n=12) 90,1+1,81 (n=13)

110 94,4 + 1,40 (n=19) 91,8+1,92 (n=12) 91,3+2,00 (n=11) 91,4+1,90 (n=13)

100 94,8+1,37 (n=18) 91,8+1,92 (n=12) 92,4+1,90 (n=10) 89,99+2,04 (n=12)

Примечание: звездочками обозначены достоверные изменения в сравнении с контрольными показателями (р<0,05).

% гемолиза

Концентрация NaCl, мосм/л

Рис. 1. Влияние длительного введения различных доз гистохрома на осмотическую резистентность мембран эритроцитов крови крыс в эксперименте in vivo: сплошная линия - изменение осмотической резистентности эритроцитов интактных крыс; пунктирная линия - изменение осмотической резистентности эритроцитов крыс, получавших гистохром в дозе 1 мг/кг; точечная линия - изменение осмотической резистентности эритроцитов крыс, получавших гистохром в дозе 10 мг/кг; звездочкой обозначены достоверные различия показателей по сравнению с контролем

тохрома подопытным животным сопровождалось дозозависимым повышением осмотической резистентности мембран эритроцитов. Так, в дозе 1 мг/кг гистохром существенно снижал процент гемолиза эритроцитов в разведениях натрия хлорида 180 и 170 мосм/л (4,1±0,б4% в контроле и 2,3±0,41% - в опыте, р=0,049; 21,7+3,06% в контроле и 10,2+2,66% - в опыте, р=0,008 соответственно). При этом максимальная задержка гемолиза отмечалась при осмотичности среды 170 мосм/л, когда описываемый показатель снижался в 2 раза по сравнению с контрольными значениями.

Этот эффект существенно усиливался при десятикрат-

ном увеличении дозы препарата. Из того же рисунка видно, что диапазон гипотонических растворов, в которых отмечалась задержка гемолиза, расширился до 130 мосм/л. В этом случае при концентрации солевого раствора 180 мосм/л в опыте гемолизировалось лишь 1,99+0,34% эритроцитов (р=0,019), а при 170 мосм/л - 5,2+0,89%

(р<0,001). В разведении натрия хлорида 160 мосм/л процент гемолиза эритроцитов составил 16,0+1,91 против 38,10+5,69% в контроле (р=0,017), 150 мосм/л

- 35,30+2,94 против

62,70+5,18% в контроле (р=0,001), 140 мосм/л -54,95+4,10 против 77,40+2,96% в контроле (р<0,001) и 130 мосм/л -83,20+1,28 против 93,60+1,28% в контроле (р<0,001). Как и в случае применения гистохрома в дозе 1 мг/кг, максимальный эффект препарата отмечался при осмотичности среды 170 мосм/л, когда процент гемолиза эритроцитов оказался ниже исходного уровня в 4,2 раза. Более того, описываемый показатель оказался в среднем в 1,3 раза ниже, чем в предыдущей серии экспериментов.

Таким образом, эксперименты по изучению возможного мембраностабилизирующего эффекта гистохрома показали, что в условиях in vitro и in vivo препарат оказывает не одинаковое действие на осмотическую резистентность мембран эритроцитов. Полученные результаты позволяют предположить, что гистохром влияет на проницаемость клеточных мембран посредством нескольких механизмов. Oчевидно, что некоторое усиле-

ние гемолиза эритроцитов в опытах in vitro - результат прямого воздействия препарата на клеточные мембраны. Не исключено, что это обусловлено изменением проницаемости мембранных структур для ионов натрия. Последнее может быть вызвано воздействием на транспортные системы мембран клеток [15].

В контексте этих рассуждений логичным выглядит предположение о том, что выявленная в экспериментах in vivo мембраностабилизирующая активность гистохрома опосредована вмешательством препарата в эндогенные механизмы стабилизации мембран. Более того, мощный защитный эффект гистохрома наводит на мысль о вовлечении в процесс нескольких мембранотропных систем. Наиболее вероятно, что ключевым звеном в развитии мембраностабилизирующего эффекта гистохрома является выраженное подавление активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), тем более, что хорошо известна тесная взаимосвязь процессов ПОЛ с такими мембраноповреждающими механизмами, как липолиз и фосфолиполиз, арахидоновый каскад и дефицит энергообеспечения клетки [3, 14].

Многочисленные экспериментальные исследования показали, что высокие донорские свойства гистохрома позволяют ему восстанавливать липидные радикалы, обеспечивая структурную и функциональную целостность плазматических мембран [6, 8]. В свою очередь, сохранение структурной организации мембран препятствует активации фосфолиполиза и предотвращает гидролиз фосфолипидов, снижая конверсию неактивной формы мембрансвязанной Са2+-зависимой фосфолипа-зы в активную форму. Не исключено, что эхинохром, нейтрализуя свободные радикалы и связывая ионы кальция, подавляет активность этого фермента и последующую деградацию фосфолипидов [3, 8]. В результате снижается образование амфифильных продуктов гидролиза фосфолипидов, которые, как известно, в высоких концентрациях оказывают детергентоподобное действие на плазматические мембраны и угнетают активность АТФ-аз, нарушая проницаемость клеточных барьеров для катионов [3]. Хорошо известно, что ионный гомеостаз клетки, как и активность АТФ-аз, напрямую зависят от процессов ее энергообеспечения. Благоприятное действие гистохрома на энергообеспечение как один из механизмов резистентности мембран может быть результатом его АТФ-сберегающей активности [1].

Не менее интересной, на наш взгляд, представляется идея о возможном влиянии гистохрома на метаболизм простагландинов. Участие этих соединений в регуляции трансмембранного транспорта подтверждают многочисленные экспериментальные исследования. Вместе с тем хорошо известно, что активные формы кислорода и продукты ПОЛ являются важным фактором усиления путей метаболизма арахидоновой кислоты, а степень гидролиза фосфолипидов коррелирует со степенью продукции простагландинов [4]. Благодаря выраженной антиокси-дантной активности гистохром вполне способен угнетать арахидоновый каскад. Косвенным подтверждением снижения метаболизма арахидоновой кислоты может служить мощное антиэкссудативное действие препарата, выявленное нами ранее [12]. Не исключено, что в разви-

тии мембранстабилизирующего эффекта гистохрома в эксперименте in vivo принимают участие и другие системы клеточной защиты.

Таким образом, защитное действие гистохрома на плазматические мембраны, скорее всего, определяется не минорным механизмом, а соотношением различных мем-бранотропных эффектов препарата.

Не менее интересен и выявленный в опытах in vivo дозозависимый эффект гистохрома. Согласно полученным результатам, десятикратное увеличение дозы препарата сопровождалось резким падением процента гемолиза эритроцитов. Заметим, что независимо от дозы гистохрома максимальное мембраностабилизирущее действие препарата отмечалось при концентрации раствора 170 мосм/л. В этом аспекте данные экспериментов in vitro не противоречат результатам, полученным в опытах на животных. Так, в условиях in vitro повреждающее действие гистохрома на мембраны эритроцитов уменьшалось по мере увеличения концентрации исследуемого раствора препарата с 1*10-5 до 1-10-3 М/л.

Заключение

Таким образом, результаты опытов in vivo свидетельствуют о наличии у гистохрома стабилизирующего влияния на клеточные мембраны. При этом десятикратное увеличение дозы гистохрома сопровождается значительным усилением его мембранстабилизирующего эффекта. В условиях in vitro и in vivo гистохром оказывает не одинаковое действие на осмотическую резистентность мембран эритроцитов. По-видимому, некоторое усиление гемолиза в первом случае опосредовано прямым воздействием эхинохрома на клеточные мембраны, а во втором - является результатом изменения активности эндогенных мембранотропных механизмов. Среди последних, вероятно, ключевое значение имеет угнетение процессов перекисного окисления липидов и подавление метаболизма арахидоновой кислоты.

Литература

1. Афанасьев Т.А., Ласукова Т.В., Чернявский А.М. АТФ-сбере-гающий эффект гистохрома при острой ишемии миокарда больных ишемической болезнью сердца // Бюл. экспер. биол. мед. - 1997. - Т. 124, вып. 12. - С. 669-671.

2. Василевская Н. Л. Методика определения резистентности эритроцитов // Бюл. экспер. биол. мед. - 1955. - Вып. 12. -С. 68-72.

3. Владимиров Ю.А., Арчаков Р.М. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М. : Наука, 1972. -252 с.

4. Дыгай А.М., Клименко Н.А. Воспаление и гемопоэз. - Томск : Изд-во Том. ун-та, 1992. - 276 с.

5. Закирова А.Н., Лебедев А.В., Кухарчук В.В. и др. Антиоксидант гистохром: влияние на перекисное окисление липидов и реологические свойства крови у больных нестабильной стенокардией // Тер. архив. - 1996. - Вып. 8. - С. 12-

14.

6. Козлов В.К., Козлов М.В., Гусева О.Е. и др. Антиоксидантная активность эхинохрома А при хронических воспалительных заболеваниях легких у детей // Тихоокеанский мед. журн. - 2009. - Вып. 3. - С. 106-107.

7. Красногорская В.Н., Басинский С.Н., Басинский А.С. Клинические результаты применения трансхориоидального введения гистохрома при лечении дистрофических заболеваний сетчатки // Русский медицинский журнал. - 2007. -Т. 8, Вып. 1. - С. 3-5.

8. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Догадова Л.П. Препарат гистохром для офтальмологии // Вестник ДВО РАН. - 2004. -Вып. 3. - С. 111-119.

9. Мищенко Н.П., Прокофьева Н.Г., Федореев С.А. Антиради-кальная и гемолитическая активности хиноидных пигментов морских ежей // Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии : тез. докл. Региональной науч. конф. - Владивосток, 2004. - С. 14.

10. Пат. 2134107 РФ. Препарат “Гистохром” для лечения воспалительных заболеваний сетчатки и роговицы глаз / Еляков Г.Б., Максимов О.Б., Мищенко Н.П. и др.; опубл.10.08.1999.

11. Пат. № 2408367 РФ. Диуретическое средство / Лампатов В.В., Жариков А.Ю., Федореев С.А., Мищенко Н.П.; опубл. 10.01.2011.

12. Талалаева О.С. О взаимосвязи противовоспалительного и антиоксидантного эффектов гистохрома // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т. 3, вып. 1. - С. 48.

13. Талалаева О.С., Жариков А.Ю., Федореев С.А. и др. Влияние гистохрома на экскреторную функцию почек в эксперименте // Бюл. сиб. мед. -2011. - Вып. 5. - С. 101-104.

14. Шанин Ю.Н., Шанин В.Ю., Зиновьев Е.В. Антиоксидантная терапия в клинической практике. - СПб. : ЭПБИ-СПб, 2003.

- 132 с.

15. Floreani M., Forlin A., Bellin S. et al. Structure-activity relationship for the inhibition of cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase activity by naphthoquinones // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1995.

- Vol. 37 (4). - Р. 757-763.

Поступила 09.07.2012

Сведения об авторах

Талалаева Ольга Сергеевна, канд. мед. наук, ассистент кафедры фармакологии reOY BПO “Алтайский государственный медицинский университет” Минздрава России.