CC BY
38
УДК 615.27-092.4
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОЙ И ПРООКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЕЙ ПРЕПАРАТА ГИСТОХРОМ
В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO
Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул Талалаева О.С., Зверев Я.Ф., Замятина С.В.
В данной статье представлены результаты сравнения антиоксидантной и прооксидантной активностей гистохрома в экспериментах in vitro и in vivo. В экспериментах in vitro был изучен эффект двух концентраций гистохрома, примерно соответствующих дозам, вводимым животным. Эксперименты in vivo выполнены на аутбредных крысах сток Вистар, рандомизированных на три группы: группы 1 и 2 получали гистохром в дозе 1 мг/кг (n=15) и 10 мг/кг (n=15), группа 3 служила контролем. После 14 дней введения препарата индуцировали окислительный стресс и производили оценку показателей общей антиоксидантной активности (ОАА) и суммарной прооксидантной активности (СПА) в крови крыс. В ходе исследования было установлено, что препарат гистохром может проявлять разнонаправленное действие на процессы свободно-радикального окисления в модельных системах in vitro и в опытах in vivo. Преобладание антиоксидантной активности было зарегистрировано при введении крысам препарата в дозе 1 мг/кг.
Ключевые слова: гистохром, антиоксидантные и прооксидантные свойства.
The current study presents the results of comparison of antioxidant and pro-oxidant histochrom activity in terms of in vitro and in vivo experiments. In vitro effect of two concentrations of the drug approximately corresponding to the doses administered by animals was studied. In vivo experiments were performed on Wistar rats, randomized into three groups: the 1st and 2nd groups received histochrom at a dose of 1 mg/kg (n = 15) and 10 mg/kg (n = 15), the 3rd one was the control group. After 14 days of drug administration, oxidative stress was induced and the total antioxidant activity (TAA) and total pro-oxidant activity (TPA) in the rat blood were evaluated. In terms of study it was revealed, that histochrom can have multidirectional effect on the processes of free-radical oxidation in model systems in vitro and in vivo. The prevalence of antioxidant activity was registered by the injection of the drug at a dose of 1 mg/mk.
Key words: histochrom, antioxidant and pro-oxidant properties.
Гистохром - это водорастворимая лекарственная форма индивидуального вещества, природного хиноидного пигмента морских беспозвоночных эхинохрома А (2,3,5,6,8-пен-тагидрокси-7-этил-1,4-нафтохинон) [1]. Основой для разработки лекарственных препаратов серии «Гистохром» (номер государственной регистрации 002363/01-2003 и 002363/02-2003) ТИБОХ ДВО РАН послужила высокая плюри-потентная антиоксидантная активность эхино-хрома А [2,3,4].
Первые данные о выраженной реакционной способности 2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-э-тил-1,4-нафтохинона были получены сотрудниками ТИБОХ в экспериментах in vitro. В различных модельных системах было показано, что донорские свойства эхинохрома А позволяют ему восстанавливать липидные радикалы, обеспечивая структурную и функциональную целостность цитоплазматических мембран [5, 6]. Методом конкурентного ингибирования восстановления нитросинего тетразолия доказана способность 2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-э-тил-1,4-нафтохинона нейтрализовывать супе-роксид-анинон [6]. Высказано также мнение,
согласно которому антиоксидантный потенциал 2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-этил-1,4-нафтохи-нона в значительной степени обусловлен его способностью хелатировать катионы железа, которые, как известно, участвуют в разветвлении цепных радикальных реакций [5,7,8,9,10]. Таким образом, в многочисленных модельных системах и химических тестах была установлена высокая политаргетная антирадикальная активность эхинохрома А.
В то же время известно, что выявленное in vitro антиоксидантное действие вещества не следует в полной мере экстраполировать в условия in vivo, поскольку в условиях живого организма одни и те вещества могут одновременно проявлять как антиоксидантную, так и проокси-дантную активность [11, 12]. Принципиально способность гистохрома оказывать разнонаправленное действие в экспериментах in vitro и in vivo была ранее показана нами при изучении мембранстабилизирующего действия препарата [13].
Цель исследования
Таким образом, целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка антиокси-
дантной и прооксидантной активностей препарата гистохром в экспериментах in vitro и in vivo.
Материал и методы
В эксперименте использовался препарат «Гистохром® раствор для внутривенного введения 1% в ампулах по 5 мл» (регистрационный номер Р N002363/01-2003 от 07.23.2008) (ТИБОХ ДВО РАН, г. Владивосток) [1].
Эксперименты in vivo выполнены на аут-бредных крысах сток Вистар обоего пола в возрасте 2-3 месяца и весом 200-300 г, выращенных в питомнике ГУ НИИ цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Животных содержали в стандартных условиях вивария на полноценном сбалансированном рационе в соответствии с рекомендациями института питания РАМН, в хорошо проветриваемом помещении с температурой +20±2°С и влажностью не более 80%. Эксперименты выполняли в весенний период с 9.00 до 15.00. Рандомизацию животных на три группы проводили блочным методом. Первые две группы крыс ежедневно в течение 14 суток подкожно получали гистохром в дозе 1 мг/кг (опытная группа 1, n=15) и в дозе 10 мг/кг (опытная группа 2, n=15). Третья группа животных являлась контролем и получала эквиобъемные подкожные инъекции изотонического раствора натрия хлорида (n=15).
По окончании курса моделировали экссуда-тивное воспаление. Для этого под плантарный апоневроз обеих задних конечностей крыс вводили по 0,2 мл 3%-ного раствора формалина. Ранее в нашей лаборатории было показано, что субплантарное введение формалина сопровождается развитием окислительного стресса с пиком через два дня после введения флоги-стика [14]. На третьи сутки экссудативного воспаления крыс под эфирным наркозом дека-питировали и в крови определяли показатели активности свободно-радикальных окислитель-
ных процессов. Полученные результаты сравнивали с данными, характерными для интакт-ных животных. Суммарную прооксидантную активность (СПА), интегративный показатель концентрации всех прооксидантов и активности процессов перекисного окисления липидов оценивали по способности плазмы крови индуцировать окисление ТВИН-80 с последующим фотоколориметрическим определением содержания продуктов, реагирующих с тиобар-битуровой кислотой (ТБРП; результаты представлены в процентах от значения контрольной пробы) [15].
Антиоксидантную активность в гемолизате эритроцитов оценивали по изменению инте-гративного показателя общей антиоксидантной активности (ОАА; определяется по ингибиро-ванию Fe2+/аскорбат индуцируемого накопления ТБРП при окислении ТВИН-80; результаты выражены в процентах от значения контрольной пробы) [16, 17, 18]. Данная система моделирует перекисное окисление липидов плазмы крови [19].
Все эксперименты in vivo проводились в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей (Страсбург, 1986 г.), и Федерального закона Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997.
В двух сериях экспериментов in vitro была проведена оценка антиоксидантной и проок-сидантной активности гистохрома [15,16,18]. Для определения суммарной прооксидантной (СПА) и общей антиоксидантной активности (ОАА) вместо биологического материала в опытные пробирки вносили соответствующий объем раствора гистохрома, исследуемой концентрации (табл. 1).
Таблица 1
Дизайн проведения экспериментов in vitro
Вид Число опре- Т,
„г Исходные концентрации изучаемых растворов гистохрома
определения делении, n г J г г г
Прооксидантная активность гистохрома
Контрольные 20 Дистиллированная вода, 0,2 мл
определения
Опытные 20 0,1 мг/мл, 0,2 мл 0,2 мг/мл, 0,2 мл
определения
Антиоксидантная активность гистохрома Контрольные
г 20 Дистиллированная вода, 0,1 мл
определения
Опытные 20 0,1 мг/мл, 0,1 мл 0,2 мг/мл, 0,1 мл
определения
Особенностью данного исследования было применение запатентованных модельных систем (АГМУ, кафедра биохимии и КЛД), максимально приближенных к условиям целостного организма. Как в экспериментах in vitro, так и в опытах in vivo оценка антиоксидантной и прооксидантной активностей препарата ги-стохром производилась с применением единой методики, что позволило максимально объективизировать результаты сравнительного анализа. Анализируемые концентрации препарата были эквивалентны дозам гистохрома, использованным в двух группах крыс. Методики были валидированы.
Результаты обрабатывали с помощью пакета программ «Statistica for Windows 6.0». Результаты представлены в виде M ± m, где M - выборочное среднее, m - ошибка среднего, n - выборка. Динамику показателей в зависимых выборках парных измерений осуществляли с помощью критерия Вилкоксона. Для межгрупповой оценки непараметрических показателей независимых выборок использовали критерий Ман-
рост свободно-радикальных производных в плазме крови животных характеризовался линейной зависимостью от количества активного начала гистохрома (табл. 2, 3). Обращает внимание, что в группе животных, получавших гистохром в дозе 1 мг/кг, значение показателя СПА оказались в 2,5 раза ниже цифр, характеризующих окислительный стресс у животных с экспериментальным отеком, и вдвое меньшим, чем показатель у интактных животных (таблица 2). Десятикратное увеличение дозы препарата нивелировало зарегистрированный эффект, а концентрация свободно-радикальных дериватов в плазме крови подопытных крыс соответствовала таковой в контрольной группе животных в условиях максимальной активности окислительного стресса.
Как следует из таблицы 2, в отношении ан-тиоксидантной активности и дозы препарата была зарегистрирована обратная зависимость. В условиях длительного введения гистохрома у крыс с экспериментальным воспалением был
на-Уитни. Уровень статистической значимости соответствовал р < 0,05.
Результаты
Изучение антиоксидантной активности гистохрома в экспериментах in vivo проведено на модели патологии, сопровождающейся окислительным стрессом, вызванным субплан-тарным введением формалина с последующим формированием воспалительного отека задних конечностей крыс [14,20]. Предварительно для определения оптимального времени оценки показателей антиоксидантной активности исследована динамика развития окислительного стресса на фоне формалинового отека (табл. 2).
С учетом динамики развития окислительного стресса, вызванного воспалительным процессом, определение показателей антиоксидант-ной и прооксидантной активностей в опытах in vivo проводили на пике формалинового отека, достигающего максимума на третьи сутки после введения флогогена.
ный эффект препарата. Так, введение 1 мг/кг гистохрома животным с экспериментальным воспалением приводило к подавлению процессов перекисного окисления липидов, а десятикратное увеличение дозы - к активации.
Приведенные в таблице 3 данные экспериментов iv vitro демонстрируют зависимое от концентрации увеличение показателей как прооксидантной, так и антиоксидантной активностей. При этом прирост СПА превалировал при всех использованных концентрациях.
Обсуждение
Результаты проведенного исследования зарегистрировали различия в характере изменения процессов свободно радикального окисления в экспериментах in vivo и in vitro.
Анализ прооксидантной активности ги-стохрома в экспериментах in vivo показал, что при длительном введении животным дозы, эквивалентной терапевтической дозе человека, препарат, снижая в плазме крови крыс уровень
Таблица 2
Влияние длительного введения различных доз гистохрома на активность свободно-радикальных
окислительных процессов в крови крыс
Показатель
Гистохром 1 мг/кг 10 мг/кг
Интактные Контрольные крысы крысы
Суммарная прооксидантная активность, %
Общая антиоксидантная активность, %
Примечание: * - статистически значимое отличие от соответствующего показателя у интактных крыс, # - достоверное отличие от соответствующего показателя у контрольных крыс.
Как и в случае экспериментов in vitro, при- выявлен дозозависимый, но разнонаправлен-
45,1 ± 1,06 73,7 ± 0,51
60,1 ± 1,25* 87,8 ± 0,86*
23,7 ± 1,24*,# 38,9 ± 2,01*,#
61,1 ± 1,16* 17,4 ± 0,70*,#
свободно-радикальных производных, проявлял себя как антиоксидант. В дозе 10 мг/кг по данным СПА гистохром не обнаруживал такого действия. Параллельно оценка антиоксидантной активности в опытах in vivo показала, что
результатов, полученных в экспериментах in vivo и in vitro, представляется вовлечение в действие гистохрома неких дополнительных механизмов, индуцируемых в условиях целостного организма. И это не вызывает особого удивления. Современные исследования показали принципиальные различия в активности фе-нольных антиоксидантов в химических тестах и в клеточной системе, обусловленные вовлечением эндогенных механизмов [12, 21]. Известно, например, что многие полифенольные соединения способны модифицировать активность эндогенных антиоксидантных систем [20, 21, 22], вторичных внутриклеточных мессендже-ров и обладают геномными эффектами [21, 23]. В том числе наличие геномных эффектов было установлено и у эхинохрома А [24, 25, 26]. Среди последних особого внимания заслуживает способность этого нафтохинона модулировать активность гена р53 [26].
В то же время следует отметить, что, несмотря на значительную антиоксидантную емкость, в определенных условиях полифенолы могут проявлять и прооксидантные свойства [12, 27]. Закономерно, что при увеличении количества действующего вещества возрастала проокси-дантная активность препарата. Полученные результаты в определенной мере объясняют данные квантово-химического анализа структурной основы гистохрома - 2,3,5,6,8-пентаги-дрокси-7-этил-1,4-нафтохинона. Можно предположить, что длительное введение высоких доз препарата животным с экспериментальным воспалением сопровождалось избыточной продукцией реактивного радикала нафто-хинона и перекиси водорода, которые в свою очередь поддерживали активность процессов перекисного окисления липидов на высоком уровне [27, 28]. В таком случае становится по-
увеличение дозы препарата сопровождается падением его защитных свойств. При этом в экспериментах in vitro прирост прооксидант-ной активности превалировал при всех анализируемых концентрациях препарата.
до 10 мг/кг сопровождалось активацией процессов СРО. В свою очередь антиоксидантный эффект гистохрома проявлялся лишь в условиях отсутствия его прооксидантной активности, что и было зафиксировано при применении меньших доз препарата.
Защитное действие гистохрома в отношении процессов свободно-радикального окисления, скорее всего, определяется не минорным механизмом, а соотношением различных анти-оксидантных эффектов препарата. Антиокси-дантное действие гистохром реализует в дозах, эквивалентных терапевтической дозе человека, а десятикратное увеличение последней сопровождается ростом прооксидантной активности препарата.
Выводы
Результаты проведенного исследования показали преобладание прооксидантной активности гистохрома в экспериментах in vitro.
Соотношение антиоксидантной/проокси-дантной активностей препарата в опытах in vivo имело положительное значение при назначении дозы, эквивалентной терапевтической дозе человека. Десятикратное повышение дозы гистохрома трансформировало соотношение в сторону активации процессов свободно-радикального окисления.
Разнонаправленное действие препаратов серии «Гистохром®» на биологические процессы в модельных системах in vitro и in vivo указывают на наличие у эхинохрома эндогенных механизмов.
Список литературы
1. ГРЛС. Регистрационное удостоверение. Доступно по: http:// grls.rosminzdrav.ru/Grls_View_
Таблица 3
Показатели прооксидантной и антиоксидантной активностей различных концентраций гистохрома в экспериментах in vitro
Показатель Исследуемые концентрации гистохрома
0,1 мг/мл, n = 20 0,2 мг/мл, n = 20
СПА (%) 15,5 ±1,45 20,3 ±1,78, р = 0,053
ОАА (%)
9,4 ± 1,20, р* = 0,003
12,2 ±1,24, р* = 0,000
Примечание: р - статистически значимые различия эффектов между исследуемыми концентрациями р* - статистически значимые различия между соответствующими концентрациями ОАА и СПА.
Наиболее логичным объяснением различий
нятным, почему увеличение дозы гистохрома
v2.aspx?routingGuid=39892aad-5327-4a6c-99d5-2dc5a51ee2e7&t=
2. Патент РФ № 2134107/10.08.1999. Еля-ков Г.Б., Максимов О.Б. Препарат «Ги-стохром» для лечения воспалительных заболеваний сетчатки и роговицы глаз.
3. Патент РФ № 2137472/20.09.1999. Еля-ков Г.Б. Лекарственный препарат «Ги-стохром» для лечения острого инфаркта миокарда и ишемической болезни сердца.
4. Хабриев Р.У. Государственный реестр лекарственных средств, «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Москва: Минздрав России; 2004.
5. Мищенко Н.П., Прокофьева Н.Г., Федо-реев С.А. Антирадикальная и гемолитическая активности хиноидных пигментов морских ежей. Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов региональной научной конференции. 2004; Владивосток.
6. Лебедев А.В., Иванова М.В., Красновид
H.И. и др. Кислотные свойства и взаимодействие с супероксид анион-радикалом эхинохрома А и его структурных аналогов. Вопросы медицинской химии. 1999; 45(2): 123-130.
7. Тахчиди Х.П., Метаев С.А., Кагиров Р.Р. и др. Антиоксидантная защита сетчатки при экспериментальном гемофтальме у кроликов. Офтальмохирургия. 2003; 2: 14-16.
8. Приезжаева Е.Ю., Лебедько О.А., Ры-жавский Б.Я. и др. Влияние эхинохро-ма А на сруктуру и метаболизм почек 40-суточных белых крыс, подвергшихся пренатальному воздействию нитрата свинца. Тихоокеанский медицинский журнал. 2009; 3: 58-60.
9. Lebedev A.V., Ivanova M.V., Levitsky D.O. Echinochrome, a naturally occurring iron chelator and free radical scavenger in artificial and natural membrane systems. Life Sci. 2005; 76(8): 863-875.
10. Lebedev A.V., Ivanova M.V., Levitsky D.O. Iron chelators and free radical scavengers in naturally occurring polyhydroxylated
I,4-naphthoquinones. Hemoglobin. 2008; 32(1): 165-179.
11. Ратькин Е.В., Иванов В.В., Ратькин А.В. и др. Антиоксидантные и антирадикальные свойства полифенолов в механизме гепатопротекторного действия препар-тов маакии амурской. Бюл. сиб. мед. 2011; 5: 91-94.
12. Бизунок Н.А. Структурные детерми-нанаты антиоксидантной активности
производных фенола, дифенола и полифенолов в отношении активных форм кислорода, генерируемых макрофагами в различных условиях микроокружения. Военная медицина: научно-практический рецензируемый журнал. 2013; 1: 84-94.
13. Талалаева О.С., Зверев Я.Ф., Замятина С.В., Брюханов В.М., Лампатов В.В. Влияние гистохрома на осмотическую резистентность эритроцитов в экспериментах in vitro и in vivo. Сибирский медицинский журнал. 2012; 27(4): 70-74.
14. Тихомирова С.В., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф. и др. Антиоксидантное действие сбора лекарственных растений, применяемого при экспериментальном гло-мерулонефрите. Нефрология. 2004; 8(2): 155-156.
15. Патент РФ № 2146053/10.02.1997.Мол-чанов, А.В., Галактионова, Л.П. Способ определения прооксидантной активности биологического материала.
16. Благородов С.Г., Шепелев А.П., Дмитриева Н.А. и др. Определение антиокси-лительной активности химических со-единенйи. Химико-фармацевтический журнал. 1987; 21(3): 292-294.
17. Галактионова, Л.П. Особенности изменения оксидантно-антиоксидантного статуса больных бронхиальной астмой при медикаментознгой и немедиамен-тозной коррекции Новосибирск: Авто-рефереат диссетрадии д.м.н., 14.00.16 -патологическая физиология; 2004.
18. Коленченко Е,А., Сонина Л.Н., Хотим-ченко Ю.С. Сравнительная оценка анти-оксидантной активности низкоэтерифи-цированного пектина из морской травы Zostera Marina и препаратов-антиокси-дантов in vitro. Биологя моря. 2005; 31(5): 380-383.
19. Опейда И.А., Шендрик А.Н., Качурин И.О. и др.. Кинетика поглощения кислорода и хемилюминисценции при окислении липидов в присутствии ионов Fe2+. Кинетика и катализ. 1994; 35(1): 3844.
20. Талалаева О.С., Мищенко Н.П., Брюханов В.М. др. и. Влияние гистохрома на процесс свободнорадикального окисления в эксперименте. Бюлл. СО РАМН. 2011; 31(3): 63-67.
21. Ching-Hsein C., Miao-Ling L., Ping-Lin O. et al. Novel multiple apoptotic mechanism of shikonin in human glioma cells. Ann. Surg. Oncol. 2012; 19(9): 3079-3106.
22. Artiukov A.A., Popov A.M., Tsybul'skii A.V. et al. Pharmacological activity echinochrome A singly and consisting of
BAA "Timarin". Biomed. Khim. 2012; 58(3): 281-290.
23. Bharathi R.S., Gayathri S., Sakeena S.M.S. et al. Apoptosis inducing effect of plumbagin on colonic cancer cells depend on expression of COX-2. PLos ONE. 2011; 6(4): 1-11.
24. Eremenko E.M., Antimonova O.I., Shekalova O. et al. Novel compounds that increase expression of Hsp70 and its biological activity. Cell and Tissue Biology. 2010; 4(3): 251-257.
25. Lennikov A., Kitaichi N., Noda K. et al. Amelioration of endotoxin-induced uveitis treated with the sea urchin pigment echinochrome in rats. Mol. Vis. 2014; 20: 171-177.
26. Кареева Е.Н., Тихонов Д.А., Мищенко Н.П., Федореев С.А. Влияние гистохро-ма на экспрессию р53 в клетках красного костного мозга мышей в условиях модели хронического стресса. Хим.-фарма-цевт. журн. 2014; 48(3): 9-12.
27. Lebedev A.V., Levitskaya E.L., Tichonova E.V. et al. Antioxidant properties, autooxidation, and mutagenic activity of echinochrome A compared with its etherified derivative. Biochemistry (Mosc). 2001; 66(8): 885-893.
28. Бердышев Д.В., Глазунов В.П., Новиков В.Л. Изучение механизмов анти-оксидантного действия 2,3,5,6,8-пен-
тагидрокси-7-этил-1,4-нафтохинона (эхинохрома) с использованием теории функциональной плотности. Сообщение 1. Взаимодействие эхинохрома А с гидропероксидным радикалом. Изв. АН. Сер. Хим. 2007; 3: 400-415.
29. Янькова В.И., Кнышова В.В., Ланкин В.З. Механизмы коррекции окислительного стресса антиоксидантами из морских ги-дробионтов при алиментарных дисли-пидемиях. Бюллетень СО РАМН. 2010; 30(1): 64-69.
30. Лебедькова О.А., Рыжавский Б.Я., Демидова О.В. Влияние антиоксиданта эхино-хрома А на блеомицининдуцированный пневмофиброз. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2015; 159(3): 351-354.
31. Клочков С.Г., Неганова М.Е., Афанасьева С.В., Шевцова Е.Ф. Синтез и антиок-сидантная активность производных се-куринина. Химико-фармацевтический журнал. 2014; 48(1): 18-21.
Контактные данные
Автор, ответственный переписку: Талалаева Ольга Сергеевна, к.м.н., доцент патологической физиологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40. Тел: 8 (3852) 24-18-56. E-mail: [email protected]
