CC BY
50
Дудукин С.Г. Эритроциты как модель для изучения влияния неионизирующих ЭМИ на резистентность мембран клеток / С.Г. Дудукин // Вестник совета молодых ученых и специалистов Челябинской области. - 2020. - №2 (29), Т. 1. - С. 13-17
УДК 57.048 ББК 28.071
ЭРИТРОЦИТЫ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ НЕИОНИЗИРУЮЩИХ ЭМИ
НА РЕЗИСТЕНТНОСТЬ МЕМБРАН КЛЕТОК
ДУДУКИН С.Г. ФГБОУВО ЧелГУ, Челябинск, Россия e-mail: srg_d_74@mail.ru
Аннотация
В статье эритроциты рассматриваются как модельные объекты для исследования влияния неионизирующих электромагнитных излучений и полей на клеточные мембраны. Обосновывается пригодность эритроцитов для подобных исследований и объясняется важность и актуальность изучения воздействия ЭМИ на мембраны.
Ключевые слова: электромагнитные излучения, резистентность эритроцитов, мембраны клеток.
Актуальность. Естественные
неионизирующие электромагнитные излучения (ЭМИ) и поля (ЭМП) являются неотъемлемым компонентом окружающей среды. Под их воздействием происходила эволюция всех живых организмов и человека [3, 9].
Но в современную эпоху естественный электромагнитный фон дополняется за счет ЭМИ и ЭМП, создаваемых техногенными источниками, которые нередко многократно превышают естественные по своей интенсивности. Поэтому актуальность исследования биологических эффектов неионизирующих ЭМИ возрастает.
На настоящий момент известно о многочисленных исследованиях воздействия ЭМИ как на клетки, так и на организм животных и человека в целом, но конкретные механизмы развития биологических эффектов
неионизирующих излучений до сих пор не установлены.
Данные исследования показали, что неионизирующие излучения способны вызывать самые разнообразные эффекты. Предполагается, что разнообразие эффектов ЭМИ есть следствие постоянного их взаимодействия как между собой, так и с факторами другой природы. Поэтому оценка эффектов неионизирующих излучений затруднена методами простых однофакторных экспериментов. Таким образом, основной проблемой для исследователей биологических эффектов ЭМИ является то, что в их основе лежат сложные взаимодействия.
Один из нескольких одномоментно воздействующих факторов может модулировать (т.е. изменять) характер воздействия других [3].
Подобно эффектам ионизирующих излучений, эффекты неионизирующих ЭМИ наблюдают практически на всех уровнях организации живого [9]. Во многих работах исследовалось влияние ЭМИ и ЭМП на растения. Есть данные, что ЭМП промышленной частоты (50 Гц) вызывает у проростков семян подорожника среднего Plantago media изменения физиологических, биохимических и цитологических
характеристик, включая содержание
хлорофиллов a и b и каротиноидов в тканях. Исследователи наблюдали пониженный всход семян, уменьшение митотической активности у клеток корневой меристемы, замедление молекулярно-генетических процессов в тканях проростков по мере возрастания значений напряженности электрического и индукции магнитного поля [9].
Также воздействие ЭМИ исследуют и на животных: от простейших одноклеточных до высших многоклеточных. Исследователи установили, что хроническое воздействие источника сотовой связи с одинаковой частотой (1 ГГц), но с разными плотностями потока энергий: 5 мкВт/см2 и 50 мкВт/см2 (при ПДУ равном 10 мкВт/см2) вызывает у одноклеточных гидробионтов - инфузорий Spirostomum ambiguum значительное снижение двигательной активности. Продолжительность безопасного
для инфузорий радиочастотного воздействия значительно различается в зависимости от плотности потока энергии: 8-9 ч при 5 мкВт/см2 и 10 мин при 50 мкВт/см2 [6].
При воздействии ЭМИ частотой 36 ГГц и плотностью потока энергии 100 мкВт/см2 у жуков наблюдали заторможенность
поведенческих реакций [3].
Главной мишенью в клетке как для ионизирующих, так и для неионизирующих излучений, является ДНК, как одна из наиболее чувствительных молекул к вредоносным воздействиям. Воздействие ЭМИ на ДНК изучено уже достаточно хорошо. Но также важной мишенью для электромагнитных излучений являются клеточные мембраны, которые являются одной из важнейших структур для клетки и выполняют множество функций. Кроме того, известно, что хромосомы в клетках представляют собой сложный структурный комплекс ДНК с белками, липидами, РНК и др., функционально связанный с мембранными структурами. Поэтому реальные события, происходящие в облученной клетке, значительно сложнее, чем повреждение и восстановление ее компонентов по отдельности.
Удобной моделью для исследования любых изменений, возникающих в мембранах клеток являются красные клетки крови - эритроциты, т.к. они имеют сравнительно простое строение, лишены ядра, межклеточных контактов, но их мембраны имеют значительное сходство с мембранами клеток других тканей и органов [5].
Мембраны эритроцитов как модельный объект при изучении биологических эффектов ЭМИ.
Наиболее чувствительными к воздействию различных физических и химических факторов (в т.ч. и ЭМИ) клеточных структур являются клеточные мембраны [1].
Мембрана - важнейшая структура, которая обеспечивает нормальное функционирование клетки. Она является барьером между цитоплазмой и внеклеточной средой, осуществляет транспорт различных веществ и ионов, таким образом обеспечивая гомеостаз клетки. На мембранах располагаются белковые комплексы, выполняющие многие важные функции. Велико значение мембран в процессе обмена информацией между клетками и внешней средой.
Также в настоящее время считается, что именно мембраны непосредственно отвечают за коммуникации между как
близкорасположенными клетками, так и удаленными друг от друга.
Общеизвестно, что в формировании биологической реакции на внешнее физическое воздействие особая роль принадлежит мембранам. Изменение проницаемости мембран влияет на скорость диффузии ионов и других веществ, что в свою очередь влияет на энергетические и биохимические процессы, протекающие внутри клетки. Различные факторы, воздействующие извне на клетку, способны изменять её физиологические показатели, в том числе транспорт ионов. Есть данные, что ЭМИ крайне высокочастотного (КВЧ) диапазона повышают проницаемость мембран эритроцитов для ионов калия и других субстратов, поступающих в клетку путем диффузии [2].
Повреждающее действие любого фактора на клеточные мембраны опосредовано через изменение их структуры и, следовательно, нарушение вязкости и проницаемости. Это процесс может идти по двум механизмам:
В основе первого механизма лежат повреждения фосфолипидного бислоя мембран вследствие интенсификации процессов перекисного окисления липидов, причиной которого является угнетение активности антиоксидантной системы клетки. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - это каскадная реакция окислительной свободно-радикальной деградации липидов. В клетке в ходе окислительных процессов могут возникать свободные радикалы. Это реакционно-активные молекулы, имеющие неспаренный электрон и способные запускать ПОЛ. Но в нормально функционирующих клетках концентрация данных молекул невелика вследствие наличия систем ферментов - антиоксидантов (ферменты супероксиддисмутаза, каталаза), которые обезвреживают свободные радикалы. Наиболее чувствительны к ПОЛ ненасыщенные жирные кислоты, которые часто являются компонентом фосфолипидов мембран. Различные повреждающие факторы (в т.ч. ЭМИ) могут приводить к недостаточности антиоксидантных систем, вследствие которой в клетке растут концентрации свободных радикалов, что может привести к интенсификации процессов ПОЛ и повреждениям мембран.
Второй механизм заключается в интенсификации процесса гидролиза фосфолипидов мембраны, вследствие активации эндогенной фосфолипазы А2. В результате
происходит накопление в мембране производных липидов, свободных жирных кислот, других продуктов ПОЛ.
Действуя как совместно, так и раздельно, оба механизма приводят к повреждению фосфолипидного бислоя, в результате чего нарушаются барьерная и транспортная функция мембраны (в частности, увеличивается ее проницаемость) [5].
Проницаемость мембраны для малых молекул (особенно для катионов К) -
критически важна для жизнедеятельности любой клетки. Изменение пассивной проницаемости мембраны воздействует на величину объема аналогично изменению осмолярности [4].
Наиболее удобной моделью для изучения изменений, возникающих в мембранах клеток под действием тех или иных факторов являются красные клетки крови - эритроциты. Они имеют форму двояковогнутого диска, лишены ядра и многих органоидов, присущих другим клеткам, что обуславливает их уникальные функции: высокую способность к деформации, эластичность и способность к транспорту газов (отсутствие ядра позволяет наиболее полно использовать внутриклеточное пространство).
При этом мембраны эритроцитов и клеток других тканей имеют большое сходство в строении. Эритроциты не имеют ядра и многих органелл, характерных для ядерных клеток, что позволяет связывать полученные результаты именно с изменениями в мембране [1, 5].
Именно от состояния мембран зависит функциональная активность эритроцита. Оно также регулирует взаимодействие эритроцита со внешней средой, определяет активность белков-ферментов, локализующихся на мембране, обеспечивает транспорт ионов, веществ и газов, влияет на продолжительность циркуляции эритроцита в периферической крови. Известно, что на эритроцитарной мембране располагаются комплексы ферментов, необходимых для процессов гликолиза, пентозофосфатного цикла, системы глутатиона, адениловой системы и других реакций обмена, необходимых для усвоения энергии анаэробным путем. Эти ферментативные комплексы также входят в антиоксидантную систему организма.
Структура клеточной мембраны является однородной на всей поверхности эритроцита. На различных участках поверхности мембраны способны формироваться неровности, но при этом изменение внутри- и внеклеточного
давления с разбросом +/- 15% не вызывает сморщивание клетки вследствие наличия у эритроцита значительного запаса
деформабельности.
Установлено, что под воздействием ряда факторов возможна деструкция мембраны эритроцита. Выяснено, какие деструктивные изменения эритроцитарной мембраны чаще всего возникают, вне зависимости от характера повреждающего фактора. Данные изменения проявляются в форме дестабилизации молекулярной структуры фосфолипидного бислоя, нарушении взаимодействий "белок-липид", модификациях цитоскелета эритроцита, изменении активности систем ионного транспорта, рецепторного комплекса, энергетического обмена клетки и интенсификации ПОЛ.
Физиологическое состояние эритроцитарной мембраны обеспечивается ее микровязкостью, которая определяется, главным образом, состоянием двойного слоя фосфолипидов и зависит от степени интенсивности процессов ПОЛ, концентрации насыщенных жирных кислот, холестерола, ионов Са2+ и М^2+, поскольку при повышении их концентрации внутри эритроцита уменьшается
электростатический заряд, АТФ и внутриклеточная вода [8].
Изменение резистентности эритроцитов ко внешним воздействиям играет важную роль в адаптации организма к экстремальным факторам внешней среды и при патологических процессах [4].
Осмотическая резистентность эритроцитов как универсальный показатель состояния их мембран.
Понятие резистентности эритроцита характеризует его способность выдерживать до некоторых пределов воздействие механических, химических, осмотических, температурных факторов, а также противостоять повреждающему действию ультрафиолетового, ионизирующего и рентгеновского излучений. Данная способность клеток крови зависит от возраста форменных элементов и уменьшается по мере их старения [7].
Методика оценки осмотической
резистентности эритроцитов является простым и распространенным, но при этом весьма информативным тестом, позволяющим определить состояние мембран, которое играет ключевую роль в обеспечении их резистентности к различным факторам [1].
Осмотическая резистентность эритроцитов (ОРЭ) - это универсальный показатель морфофункционального состояния мембран. По отклонению от нормы данного показателя можно определить степень поврежденности мембраны после воздействия какого-либо фактора (в т.ч. и неионизирующих ЭМИ). Полученные результаты можно
экстраполировать на другие клетки и на данной основе выдвигать предположения о том, какое влияние может оказывать данный фактор на мембраны [5].
Метод ОРЭ основан на явлении осмотического гемолиза эритроцитов. Данное явление наблюдается при помещении эритроцитов в гипотонические растворы хлорида натрия NaCl, которые предварительно готовятся из 1% раствора NaCl. Доказано, что в цитоплазме эритроцитов концентрация белков выше по сравнению с плазмой крови, но при этом содержание низкомолекулярных веществ ниже. Белки плазмы формируют онкотическое давление, которое не уравновешивается полностью осмотическим давлением, возникающим вследствие градиента
концентраций низкомолекулярных веществ. Благодаря специфической форме в виде двояковогнутого диска (дискоцит) и высокому отношению площади поверхности эритроцита к его объему, он способен претерпевать значительную деформацию.
При помещении суспензии эритроцитов в гипотонические растворы NaCl осмотическое давление цитоплазмы (содержащей большее количество малых молекул и ионов, чем внешний раствор) возрастает и вызывает поток молекул воды внутрь клетки по градиенту ее концентрации. В результате увеличивается объем клетки (до 146 % от объема дискоцита). Эритроцит при этом изменяет форму от двояковогнутой линзы (дискоцит) до шарообразной (сфероцит). Несмотря на изменение формы радиус клетки остается неизменным и высокое осмотическое давление разрывает плазматическую мембрану. Таким образом наступает стадия гемолиза и гемоглобин выходит в окружающую среду.
При осмотическом гемолизе эритроцитов диффундирует только свободная фракция внутриклеточного гемоглобина. Осмотический тип гемолиза не приводит к серьезным нарушениям структуры мембраны. Мелкие дефекты, образовавшиеся в ходе гемолиза, не приводят к нарушению целостности клеточной
мембраны, что указывает на ее способность к самовосстановлению.
Метод оценки устойчивости мембран эритроцитов, основанный на гемолизе в гипотонических растворах известен давно. К настоящему моменту созданы многочисленные модификации этого метода. Все они прежде заключались в определении таких концентраций раствора хлорида натрия, при которых начинался и прекращался гемолиз, видимый невооруженным глазом. Основным недостатком метода являлось то, что нельзя было установить динамику гемолиза, т.е. определить тот диапазон промежуточных концентраций раствора ШО, в пределах которого гемолизировалось большинство устойчивых эритроцитов. В 1946 г. описан метод, основанный на применении ступенчатого фотометра для определения гемолиза.
Одной из самых распространенных в настоящее время модификаций метода определения осмотической резистентности эритроцитов является методика с использованием усовершенствованных
фотоэлектроколориметров. Данная методика сравнительно простая и доступная, но при этом достаточно точная и объективная. Основным достоинством методики является то, что она позволяет определить не только минимальную и максимальную резистентность клеток, но и динамику гемолиза. Для выполнения данной методики из 1% раствора хлорида натрия предварительно готовятся гипотонические растворы концентрацией от 0,6 до 0,1% и с рН 7,4. Степень гемолиза рассчитывается на основе измерений оптической плотности надосадочной жидкости после центрифугирования, которую производят на ФЭК КФК-2 при зеленом светофильтре (длина волны около 540 нм).
Метод мочевинного гемолиза эритроцитов основан на явлении мочевинного гемолиза, сходного с осмотическим. По градиенту своей концентрации молекулы мочевины
устремляются в клетку, увлекая за собой меньшие по размеру молекулы воды и приводят к повышению осмотического давления внутри клетки, что вызывает её лизис. Для более крупных молекул мочевины мембрана эритроцита менее проницаема, чем для молекул воды, потому метод осмотической резистентности принято считать более чувствительным [5].
Выводы. Для установления закономерностей, лежащих в основе развития биологических
эффектов ЭМИ необходимы исследования их действия на клеточном уровне.
На уровне клетки одной из наиболее чувствительных структур к данному фактору является мембрана, которая выполняет важнейшие функции, лежащие в основе поддержания клеточного гомеостаза. В то же время изменения мембран под воздействием ЭМИ изучены недостаточно.
Одной из самых удобных моделей для исследований состояния мембран являются эритроциты крови. Полученные данные можно интерполировать на клетки других органов и
тканей, т.к. мембраны эритроцитов и других клеток имеют сходную структурно-функциональную организацию.
Информативным и простым лабораторным методом, позволяющим определить состояние мембран эритроцитов, является оценка осмотической резистентности. Данный метод позволяет обнаружить изменения различных показателей мембраны под влиянием ЭМИ, таких как проницаемость, вязкость и т.д. Эти изменения в свою очередь могут лежать в основе развития биологических эффектов
неионизирующих излучений.
Список литературы
1. Задорожная Г.А. Вихревое влияние импульсного магнитного поля на осмотическую резистентность эритроцитов крыс / Г.А. Задорожная [и др.]// Вестник Днепропетровского университета. Биология. Медицина. - 2010. - №1, т. 2. - С. 25-30
2. Закономерности влияния низкоинтенсивного электромагнитного излучения на биологические системы / О.М. Гаркуша [и др.] //Поверхность. - 2010. - №2 (17). - С. 340-354
3. Кадукова Е.М. Влияние ионизирующего и неионизирующего излучений на поведение крыс-самок в тесте "открытое поле" /Е.М. Кадукова, Д.Г. Сташкевич, А.Д. Наумов //Проблемы здоровья и экологии. - 2015. - №2 (44). - С. 55-59
4. Осмотическая резистентность эритроцитов в условиях различной напряженности геомагнитного поля и при действии дигоксина в условиях in vitro /В.Ю. Куликов [и др.] //Медицина и образование в Сибири. - 2010. - №3. - С. 10
5. Показатель проницаемости эритроцитарных мембран в оценке функционального состояния организма / В.А. Мойсеенко [и др.] //Крымский терапевтический журнал. - 2007. - №2, т. 2. - С. 103-106
6. Сарапульцева Е.И. Изучение зависимости биологической опасности слабого радиочастотного воздействия от значения плотности потока энергии. Эксперименты на инфузориях Spirostomum ambiguum, облученных на частоте мобильной связи (1 ГГц) /Е.И. Сарапульцева, Ю.В. Иголкина //Бюлл. экспер. биол. и мед.. - 2011. - №4. - С. 459-462
7. Смирнов И.Ю. Роль ионных каналов в обеспечении осмотической стойкости эритроцитов / И.Ю. Смирнов, В.Н. Левин, О.А. Чирикова //Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова. - 2006. - №8. - С. 18-22
8. Трошкина Н.А. Эритроцит: строение и функции его мембраны / Н.А. Трошкина, В.И. Циркин, С.А. Дворянский // Вятский медицинский вестник. - 2007. - №2-3. - С. 32-40
9. Шашурин М.М. Эффекты действия техногенных электромагнитных излучений и полей на живые организмы (обзор) /М.М. Шашурин //Наука и образование. - 2015. - №3. - С. 83-89
ERYTHROCYTES AS A MODEL FOR STUDYING THE INFLUENCE OF NON-IONIZING ELECTROMAGNETIC RADIATION ON THE RESISTANCE OF CELL MEMBRANES
DUDUKIN S.G. FSBEI HE ChelSU, Chelyabinsk, Russia e-mail: srg_d_74@mail.ru
Abstract
On the basis of published materials, erythrocytes were considered as a model for research of the influence of electromagnetic radiation and fields on cell membranes. We substantiated the suitability of erythrocytes for such researches is grounded and the importance and relevance of studying the effects of electromagnetic radiation on the membranes.
Keywords: electromagnetic radiation, electromagnetic fields, resistance of erythrocytes, cell membranes.
Сведения об авторах:
Дудукин Сергей Геннадьевич, srg_d_74@mail.ru, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Челябинский государственный университет", биологический факультет, кафедра радиационной биологии, Российская Федерация, г. Челябинск, ул. Воровского, 68а, корпус 2
Author Information:
Dudukin Sergey Gennadyevich, srg_d_74@mail.ru, Federal State Budgetary Institution of Higher Education "Chelyabinsk State University", Faculty of Biology, Department of Radiation Biology, Russian Federation, Chelyabinsk, Vorovskogo str. 68a, building 2
