Влияние нейросенсибилизации на цито-, ангио- и синаптоархитектонику коры сенсомоторной области мозга крыс линии Крушинского - Молодкиной Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 612.825:612.821.8+615.076.9

ВВ. СЕМЧЕНКО1, СИ. ЕРЕНИЕВ2, С.С. СТЕПАНОВ 2

1 Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина, Омск 2Омский государственный медицинский университет Минздрава России, Омск

ВЛИЯНИЕ НЕЙРОСЕНСИБИЛИЗАЦИИ НА ЦИТО-, АНГИО-И СИНАПТОАРХИТЕКТОНИКУ КОРЫ СЕНСОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ МОЗГА КРЫС ЛИНИИ КРУШИНСКОГО - МОЛОДКИНОЙ

Установлено, что сенсибилизация антигенами супернатанта водно-солевого экстракта гомологичного мозга половозрелых крыс линии Крушинского - Молодкиной вызывает деструктивные изменения нейронов, глиальных клеток, кровеносных сосудов и межнейронных контактов. При этом в коре сенсо-моторной области в 5,2 раза по сравнению с контролем увеличивается количество гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней, в 3,9 раза - гипер- и гипохромных нейронов. В 1,2 раза уменьшается численная плотность глиоцитов, в 2,2 раза - синапсов. В то же время в 2,1 раза увеличивается диаметр активной зоны контакта (АЗК), что поддерживает на контрольном уровне суммарную длину АЗК на 100 мкм2 нейропиля. Наряду со значительной гипертрофией сохранившихся синапсов выявляется отсутствие мелких и средних контактов, увеличение относительного содержания синапсов с высокими плотными проекциями, значительная гипертрофия дендритных шипиков и аксо-шипиковых синапсов, уменьшение в 1,4 раза отношения свободной поверхности шипика к АЗК.

Ключевые слова: белые крысы, нейросенсибилизация, сенсомоторная кора, цито-, ангио-, синапто-архитектоника.

Введение

Известно, что при травмах головного мозга, инфекционных заболеваниях, эпилепсии, судорожном синдроме, нейроинтоксикациях, нарушениях мозгового кровообращения, нейродегенеративных заболеваниях, паразитарных, онкологических заболеваниях головного мозга, у переживших гипоксию и клиническую смерть повышается проницаемость ге-матоэнцефалического барьера. Становится возможным контакт мозговых антигенов с органами иммуногенеза и антител мозгоспецифической направленности с мозгом, фиксация антител к антигенам мозга на нейронах, глиальных клетках, миелиновых оболочках, клетках эпендимы, стенках сосудов, пре- и постсинаптических мембранах. В результате нарушается когнитивная, ассоциативная и регуляторная функция центральной нервной системы. В связи с этим представляет интерес комплексное влияние нейросенсибилизации на качественные характеристики и количественные показатели цито-, ангио- и синаптоархи-тектоники коры сенсомоторной области мозга в эксперименте.

Материалы и методы

Для экспериментов использовали половозрелых крыс линии Крушинского - Молодкиной (К-М) (п = 48), предоставленных виварием лаборатории физиологии и генетики поведения кафедры высшей нервной деятельности биолого-почвенного факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Экспериментальные группы: группа сравнения (интактные животные) (п = 24), основная группа (нейросенсибилизация) (п = 24). Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом путем декапитации. Материал для исследования забирали на 90-е сутки эксперимента. Опыты проводились в соответствии с приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. и № 701 от 27.07.78 г. об обеспечении принципов гуманного обращения с экспериментальными животными.

Для получения антигенов супернатанта водно-солевого экстракта гомологичного мозга крыс предварительно перфузировали 0,85 %-ным раствором хлористого натрия в течение 20-30 мин. Для приготовления экстракта мозга использовали ткань больших полушарий. С помощью гомогенизации ткани готовили 20,0 %-ную мозговую суспензию на

© Семченко В.В., Ерениев С.И., Степанов С.С., 2017

забуференном физиологическом растворе. Полученную взвесь оставляли на 18-20 ч в холодильнике при 4 °С, после чего подвергали 5-кратному замораживанию при -70 °С и последующему оттаиванию на водяной бане при 37 °С. Гомогенат центрифугировали в течение 45 мин при 10 000 оборотов в мин на холоду, отсасывали надосадочную жидкость, разливали по флаконам по 0,5-1,0 мл. Хранили при температуре -20 °С (не более 3 мес). Приготовленный таким образом супернатант водно-солевого экстракта мозга содержал наряду с мозгоспецифическими белками нейронов, глиоцитов, клеток эпендимы также антигены элементов сосудистой стенки, белков плазмы и тканевой жидкости. Ввиду тесной структурно-функциональной связи нейронов, глиоцитов и кровеносных капилляров мозга [1], сочетанного вовлечения их в патологический процесс при различных поражениях ЦНС, выявлении при этом антител, фиксирующихся на нейронах, глиоцитах, миелиновых оболочках, клетках эпендимы, стенках кровеносных сосудов [2], а также по причине того, что ряд мозгоспецифических белков локализуется и в нейронах, и в глиоцитах [3], не известно, какой мозгоспецифический белок (белки) играет решающую роль в патогенезе неврологических нарушений [4], допустимо использование в качестве антигенсодержащего материала супернатанта водно-солевого экстракта мозга. Это позволяет охватить максимальное число антигенных детерминант, содержащихся в экстракте мозга.

Сенсибилизацию крыс линии К-М антигенами экстракта мозга проводили при помощи внутрибрюшинного введения супернатанта 20,0 %-ного водно-солевого экстракта гомологичного мозга в дозе 0,5 мг белка на 1 кг массы тела животного. Супернатант вводили один раз в день с интервалом в 2 дня 30-кратно.

Численную плотность функционально активных капилляров в слоях 1-Ш коры сен-сомоторной области мозга крыс определяли на криостатных срезах, окрашенных на щелочную фосфатазу свинцовым методом по Гомори. Численную плотность нейронов, глиоци-тов, гипо- и гиперхромных нейронов, гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней в коре больших полушарий определяли на окрашенных тионином по Нисслю срезах. Для определения численной плотности нервных и глиальных клеток в 1 мм3 коры больших полушарий использовали модифицированный метод Аbercrombie [5].

Для электронно-микроскопического исследования сенсомоторную кору головного мозга крыс (поля Fpa и Fpp) фиксировали погружением в смесь 1 %-ного раствора глютарового альдегида и 4 %-ного раствора параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5 %). Затем материал отмывали в фосфатном буфере в течение 1 ч, дофиксиро-вали в 1 %-ном растворе четырехокиси осмия в течение 2 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Тангенциальные ультратонкие срезы коры контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Осмированный материал использовали для качественной и количественной оценки состояния нейронов и их отростков, синапсов, глиоцитов и кровеносных сосудов.

Изучение парамембранных специализированных образований пре- и постсинаптиче-ской частей системы субсинаптических единиц (ССЕ) - плотных проекций (ПП), постсинап-тического уплотнения (ПУ) и синаптической щели проводили на контрастированном в 1 %-ном растворе фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК) на абсолютном спирте (100 %) материале [6; 7]. Ультратонкие срезы изучали и фотографировали на электронном микроскопе ЭМВ-100 АК. На полученных электронограммах определяли общую численную плотность синапсов на 100 мкм2 нейропиля, содержание симметричных, асимметричных и смешанных синапсов, плоских, искривленных синапсов. Кроме того, оценивали высоту ПП (типы А, В, С), длину активной зоны контакта (АЗК), площадь АЗК, площадь свободной от АЗК поверхности шипика (СПШ), отношение СПТТТ / АЗК, суммарную длину АЗК на 100 мкм2 нейропиля. Случайным образом выбранные участки среза фотографировали при стандартном увеличении х15000. Обработку материала осуществляли на цифровых изображениях с помощью программы ImageJ 1.46.

Статистический анализ полученного материала проводили с использованием стандартного пакета прикладных статистических программ STATISTICA-6 [8]. Проверку статистических гипотез проводили с помощью ^критерия Стьюдента для независимых выборок. Нулевая гипотеза отвергалась при p < 0,05.

Результаты исследований

Через 90 дней после начала нейросенсибилизации в коре сенсомоторной области выявлялись значительных размеров очаги выпадения нейронов, увеличивалось количество гиперхромных и в большей степени - гипохромных нейронов и клеток-теней (табл. 1). Отмечалось выраженное набухание нейронов с увеличением ядра, вакуолизацией и лизисом периферического слоя цитоплазмы, узурация краев клеток. Изменения и выпадение нейронов носили диффузный характер.

На ультраструктурном уровне большинство нейронов имели вид электрон-ноплотных клеток с часто расположенными канальцами эндоплазматического ретикулума и увеличенным числом рибосом и полисом. Перинуклеарно выявлялись небольшие митохондрии с элек-тронноплотным матриксом. Аппарат Гольджи представлялся в виде комплексов из расширенных канальцев и цистерн с большим количеством вокруг них мелких и крупных светлых пузырьков. В цитоплазме отмечалось увеличение числа электронноплотных первичных и вторичных лизосом, отек периваскулярных отростков астроцитов. Оболочка ядра нервных клеток выглядела извилистой, ядро - многолопастным. Эти изменения преобладали в нейронах слоя V коры сенсомоторной области.

Таблица 1

Клеточный состав и численная плотность нейронов в 1 мм3 слоев Ш-1У коры сенсомоторной области мозга крыс линии К-М при сенсибилизации антигенами

гомологичного мозга, X ± т

Показатель Группа животных

Интактные (п = 8) Сенсибилизация антигенами мозга (п = 8)

Общее число нейронов 74300±6100 73593 ± 5493

Сморщенные нейроны и клетки-тени 2155±177 112331922*

Гипер- и гипохромные нейроны 89161732 3441512826*

Глиальные клетки 9729812477 8095313847*

Глионейронный индекс 1,31 1,10

Примечание: В табл. 1-6 символ «*») означает, что в сравнении с контролем различия статистически значимы при р < 0,05 (1 - критерий Стьюдента для независимых выборок). АЗК - активная зона контакта; ПП - плотные проекции; СПШ - свободная поверхность шипика. Материал представлен как среднее (М) ± стандартная ошибка средней (т).

Появились участки цитоплазмы нейронов, почти полностью лишенные рибосом и полисом. Гранулярный эндоплазматический ретикулум при этом был представлен отдельными беспорядочно ориентированными и расширенными цистернами, на мембранах которых неравномерно распределялись рибосомальные гранулы. Кариоплазма большинства нейронов была разрежена, осмиофобна с отдельными глобулярными скоплениями хроматина по периферии ядра.

На фоне уменьшения численной плотности глиальных клеток отмечался выраженный сателлитоз с явлениями нейронофагии, мелкоочаговые скопления глиальных клеток (табл. 2). Вокруг измененных нейронов и сосудов располагались активированные микро-глиальные клетки с электронноплотными лизосомами в цитоплазме. В цитоплазме тел и отростков глиальных клеток в большом количестве выявлялись гранулы гликогена. Количество органелл в цитоплазме астроцитов уменьшалось, чаще выявлялись лизосомы и ли-пофусциновые гранулы. Микроглиальные клетки содержали гипертрофированный аппарат Гольджи с выраженным расширением цистерн и значительным количеством фагосом.

Таблица 2

Численная плотность функционально активных капилляров в слоях I—Ш коры сенсомоторной области мозга крыс линии Крушинского — Молодкиной при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга, X ± т

Показатель Группа животных

Интактные (п = 8) Сенсибилизация антигенами мозга (п = 8)

Число капилляров на 1 мм2 228,7 ± 8,7 194,6 + 9,0*

Длина капилляров в мм/мм3 457,4 + 13,4 389,3 ± 18,0*

В капиллярах неокортекса отмечались фасетчатой формы ядра эндотелиальных клеток, участки лизиса мембранных и гранулярных образований, микропиноцитозные пузырьки в цитоплазме. В базальной мембране определялись участки просветления и разрыхления, отек периваскулярных отростков астроцитов. В расширенных перикапиллярных отростках астроцитов выявлялись множественные гранулы гликогена. Численная плотность функционально активных капилляров в слоях 1-Ш коры и синапсов в молекулярном слое сенсомоторной области по сравнению с интактными животными уменьшалась (табл. 3).

Таблица 3

Численная плотность контактов с различной организацией ССЕ в молекулярном слое коры сенсомоторной области мозга крыс линии К—М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга (ФВК-метод), X ± т

Группа животных

Показатель Интактные (п = 8) Сенсибилизация антигенами мозга (п = 8)

Число синапсов на 100 мкм2 нейропиля:

всего 17,69 ± 0,41 8,15 + 0,55*

асимметричных 14,54 ± 0,28 7,63 ± 0,44*

симметричных 3,15 ± 0,20 0,52 ± 0,17*

плоских 5,88 ± 0,42 4,47 ± 0,27*

искривленных 8,66 ± 0,17 3,67 ± 0,29*

Диаметр АЗК, нм 372,8 ± 34,3 797,7 ± 39,9*

Суммарная длина АЗК, нм 6595,2 ± 607,5 6501,3 ± 324,8

Значительно уменьшалось количество симметричных контактов. Соотношение плоских и искривленных синапсов не отличалось от контроля. Диаметр АЗК в 2 раза превышал контрольный уровень, что на фоне значительной редукции части синапсов не приводило к уменьшению суммарной длины контактов на 100 мкм2 нейропиля. Преобладали очень крупные контакты и множественные перфорированные синапсы, отсутствовали очень мелкие, мелкие и средние контакты (табл. 4), уменьшалось относительное содержание синапсов типа А с 1111 более 60 нм (табл. 5).

Таблица 4

Численная плотность синапсов с различной длиной АЗК в молекулярном слое коры сенсомоторной области мозга крыс линии К—М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга (ФВК-метод), Х ± т

Длина активной зоны контакта, нм Группа животных

Интактные (п = 8) Сенсибилизация антигенами мозга (п = 8)

< 200 1,01 ± 0,02 0

201-400 7,92 ± 0,52 0

401-600 4,50 ± 0,23 0

601-800 3,24 ± 0,39 0,27 + 0,10*

> 800 1,02 ± 0,04 7,88 + 0,18*

Площадь АЗК выявляющихся синапсов и свободной от АЗК поверхности шипиков увеличивалась в 4,6 и 3,4 раза соответственно, а отношение СПШ/АЗК было в 1,35 раза меньше, чем в контроле (табл. 6). При этом уменьшалась четкость контуров ССЕ части

синапсов, нарушалась структурная связь ССЕ с окружающей синаптоплазмой. В большей степени деструкции подвергались 1111, в меньшей - ПУ. Деструктивные изменения варьировали от незначительного снижения четкости контуров ССЕ и высоты ПП до их фрагментации, отрыва ПП от пресинаптической мембраны и полного исчезновения ПП.

Таблица 5

Численная плотность асимметричных контактов с различной высотой плотных проекций в молекулярном слое коры сенсомоторной области мозга крыс линии К-М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга (ФВК-метод), X ± m

Группы животных Число синапсов с различной высотой ПП

> 60 нм 60-51 нм 50 нм и <

Интактные (n = 8) 7,26 ± 0,37 6,19 ± 0,29 4,24 ± 0,16

Сенсибилизация антигенами мозга (n = 8) 2,37 ± 0,26* 3,40 ± 0,25* 1,83 ± 0,27*

Таблица 6

Дендритные шипики молекулярного слоя коры сенсомоторной области мозга крыс линии К-М при сенсибилизации антигенами гомологичного мозга, X ± m

Показатель Группа животных

Интактные (n=8) Сенсибилизация антигенами мозга (n=8)

Площадь АЗК, нм2 109111+926 499453 ± 1247*

Свободная от АЗК поверхность шипика (СПШ), нм2 278233 +2361 943966±2356*

СПШ/АЗК 2,55 1,89

Заключение

Таким образом, сенсибилизация антигенами супернатанта водно-солевого экстракта гомологичного мозга половозрелых крыс линии Крушинского - Молодкиной вызывает деструктивные изменения нейронов, глиальных клеток, кровеносных сосудов и межнейронных контактов. При этом в коре сенсомоторной области в 5,2 раза по сравнению с контролем увеличивается количество гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней, в 3,9 раза - гипер- и гипохромных нейронов. В 1,2 раза уменьшается численная плотность глиоцитов, 2,2 раза - синапсов. В то же время в 2,1 раза увеличивается диаметр активной зоны контакта (АЗК), что поддерживает на контрольном уровне суммарную длину АЗК на 100 мкм2 нейропиля. Наряду со значительной гипертрофией сохранившихся синапсов выявляется отсутствие мелких и средних контактов, увеличение относительного содержания синапсов с высокими плотными проекциями, значительная гипертрофия дендритных ши-пиков и аксо-шипиковых синапсов, уменьшение в 1,4 раза отношения свободной поверхности шипика к АЗК. Выявленные при нейросенсибилизации качественные и количественные изменения цито-, ангио- и синаптоархитектоники сенсомоторной коры, очевидно, являются структурной основой функциональных нарушений центральной нервной системы.

V.V. Semchenko1, S.I. Ereniev2, S.S. Stepanov2 1The Omsk P.A. Stolypin State Agrarian University 2Omsk State Medical University

The impact of neurosensibilization on cyto-, angio- and synaptoarchitectonics of the cortex of the sensorimotor region of the brain of white rats

It was found that sensitization by antigens of the supernatant of the water-salt extract of the homologous brain of mature rats of the Krushinsky - Molodkina line causes destructive changes in neurons, glial cells, blood vessels and interneuronal contacts. In the cortex of the sensorimotor region, the number of hyperchromic wrinkled neurons and tissue cells increases by a factor of 5.2 compared with the control, and hyper- and hypochromic neurons by 3.9 times. The number density of gliocytes decreases by 1.2 times, and synapses by 54.5 %. At the same time, the diameter of the active contact zone (ACS) increases 2.1 times, which maintains the total length of

the AZS at 100 mm2 of the neuropil at the control level. Along with considerable hypertrophy of the surviving synapses, there is a lack of small and medium contacts, an increase in the relative content of synapses with high dense projections, significant hypertrophy of dendritic spines and axopsychic synapses, a 1,4-fold decrease in the ratio of the free spinic surface in the ACS.

Keywords: white rats, neurosensitization, sensorimotor cortex, cyto-, angio-, synaptoarchitectonics.

Список литературы

1. Куффлер С., Николс Дж. От нейрона к мозгу : пер. с англ. М. : Мир, 1979. 440 с.

2. Ганнушкина И.В. Фиксация противомозговых сывороточных антител человека в различных отделах головного мозга кролика // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1976. № 9. С. 1138-1141.

3. Fa1coner M.A. Reversibility by temporal lobe resection of the behavioral abnormalities of temporal lobe epilepsy // New England J. Med. 1973. V. 289, № 9. P. 451-455.

4. Штарк М.Б. Нейроиммунофизиология. Л. : Медицина, 1978. 179 с.

5. Mayhew T.M. Stereological approach to the study of synapse morphometry with particular regerg to estimating number in volum and a surface // J. Neurocytol. 1979. V. 8, № 2. P. 121-138.

6. Семченко В.В., Степанов С.С., Боголепов Н.Н. Синаптическая пластичность головного мозга (фундаментальные и прикладные аспекты) ; 2-е изд. М., 2014. 408 с.

7. Семченко В.В. Структурно-функцио-нальное восстановление нервной ткани головного мозга в постишемическом периоде с позиций представления о провизорности в репаративном гистогенезе / В.В. Семченко, С.С. Степанов, С.И. Ерениев // Тихоокеанский медицинский журнал. 2016. № 2. С. 98-102.

8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М. : МедиаСфера, 2002. 312 с.

Семченко Валерий Васильевич, д-р мед. наук, проф., Омский ГАУ, ivm_omgau_gistology; Ерениев Степан Иванович, д-р мед. наук, проф., stepan_ereniev@mail.ru; Степанов Сергей Степанович, д-р мед. наук, научный сотрудник, Омский государственный медицинский университет Минздрава России, serg_stepanov@mail.ru.

References

1. Kuffler S., Nikols Dzh. Ot nejrona k mozgu : per. s angl. M. : Mir, 1979. 440 s.

2. Gannushkina I.V. Fiksacija protivomozgovyh syvorotochnyh antitel cheloveka v razlichnyh otdelah golovnogo mozga krolika // Bjul. jekspe- rim. biologii i mediciny. 1976. № 9. S. 1138-1141.

3. Fa1coner M.A. Reversibility by temporal lobe resection of the behavioral abnormalities of temporal lobe epilepsy // New England J. Med. 1973. V. 289, № 9. P. 451-455.

4. Shtark M.B. Nejroimmunofiziologija. L. : Medicina, 1978. 179 s.

5. Mayhew T.M. Stereological approach to the study of synapse morphometry with particular regerg to estimating number in volum and a surface // J. Neurocytol. 1979. V. 8, № 2. P. 121-138.

6. Semchenko V.V., Stepanov S.S., Bogolepov N.N. Sinapticheskaja plastichnost' golovnogo mozga (funda-mental'nye i prikladnye aspekty) ; 2-e izd. M., 2014. 408 s.

7. Semchenko V.V., Stepanov S.S., Ereniev S.I. Strukturno-funkcional'noe vosstanovlenie nervnoj tkani golovnogo mozga v postishemicheskom periode s pozicij predstavleniya o provizornosti v reparativnom gistogeneze // Tihookeanskij medicinskij zhumal. 2016. № 2. P. 98-102.

8. Rebrova O.Ju. Statisticheskij analiz medicinskih dannyh. Primenenie paketa prikladnyh programm STATISTICA. M. : MediaSfera, 2002. 312 s.

Semchenko Valeriy Vasilyevich, Dr of Med. Sci., Prof., Omsk SAU, ivm_omgau_gistology; Ereniev Step an Ivanovich, Dr. of Med. Sci., Prof., stepan_ereniev@mail.ru; Stepanov Sergey Stepanovich, Dr of Med. Sci., Research Scientist Omsk State Medical University, serg_stepanov@mail.ru.

УДК 619:611.83.617-089.578.16:636.8

О.Р. СКУБКО, ГА. ХОНИН, ОН. ШУШАКОВА

Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина, Омск

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПАРАЦЕРВИКАЛЬНОЙ БЛОКАДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВЫПАДЕНИЯ ВЛАГАЛИЩА ПРИ ГИПЕРПЛАЗИИ ЕГО СЛИЗИСТОЙ У СОБАК

В практике ветеринарной медицины случаи выпадения или выворота стенки влагалища у собак, связанные с таким осложнением, как гиперплазия стенки влагалища, регистрируются у азиатских и кавказских овчарок, мопсов, французских бульдогов и у беспородных собак, имеющих признаки внешнего сходства с собаками малосской группы. В статье приводится анатомотопографическое, гистологическое и клиническое обоснование применения парацервикальной блокады нервов влагалища при гиперплазии

©. Скубко О.Р, Хонин Г.А., Шушакова О.Н., 2017