CC BY
113
▲1
5щ
УДК: 612.017:616.001.57-006.6-07
ВЛИЯНИЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ СИСТЕМ «ХИТОЗАН-НАНОЧАСТИЦЫ ЗОЛОТА», «ХИТОЗАН-ПЧЕЛИНЫЙ ЯД-НАНОЧАСТИЦЫ ЗОЛОТА» НА СТРУКТУРУ И МАССУ ОПУХОЛИ, ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КРЫС С ОПУХОЛЬЮ РС-1
В.Н. Дыдыкина1, Ю.Д. Ерёмина1, А.С. Корягин1, В.П. Смирнов2, Л.А. Смирнова1,
1ФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», 2ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»
Дыдыкина Вера Николаевна - e-mail: [email protected]
Целью данного исследования явилось изучение противоопухолевой эффективности наноструктурированных систем «хитозан-наночастицы золота», «хитозан-пчелиный яд-наночастицы золота» по анализу морфологических изменений и роста опухолевой ткани, а также изучение адаптогенных и прооксидантных свойств наносистем на лабораторных животных с перевиваемой опухолью штамма РС-1. По результатам изучения гистологических срезов опухолевой ткани, определения массы опухоли, активности свободнорадикального окисления в плазме крови и опухолевой ткани, значениям лейкоцитарной формулы и лейкоцитарного коэффициента показаны противоопухолевая, прооксидантная и адаптогенная эффективность наноструктурированных систем.
Ключевые слова: наноструктурированная система, хитозан-пчелиный яд-наночастицы
золота, хитозан-наночастицы золота, штамм опухоли РС-1.
The purpose of this research is the study of anti-tumor efficacy of nanostructured systems, «chitosan-gold nanoparticles», «chitosan-bee venom-gold nanoparticles» аnalysis morphological changes and growth of tumor tissue, as well as the study of properties of adaptogenic and prooxidant properties of nanosystems in laboratory animals with transplanted tumors RS strain -1. As a result of studying of histological sections of tumor tissue, determining tumor mass, the activity of free radical oxidation in plasma and tumor tissue, the values of leukocyte formula and leukocyte coefficient shows antitumor, prooxidant and adaptogenic effectiveness of nanostructured systems.
Key words: nanostructured system, chitosan-bee venom-gold nanoparticles,
gold nanoparticles of chitosan, tumor PC-1.
Введение
Фармацевтические препараты, применяемые в онкологии для химиотерапии, не всегда имеют достаточную широту терапевтического действия. Дозы, необходимые для достижения противоопухолевого эффекта, находятся на грани концентраций, способных вызвать токсический эффект. В связи с этим чрезвычайно важным является поиск терапевтических средств нового поколения с полифункциональными свойствами, которые при малой токсичности проявляли бы противоопухолевый эффект. Несомненный интерес в этом направлении исследований представляет поиск комплексных препаратов с физиологически активными веществами, в частности пчелиным ядом.
Малые дозы пчелиного яда в десятки раз меньше DL50 (летальной дозы), которая составляет 8-10 мг/кг массы лабораторных животных, способны при внутрибрюшин-ном введении повышать неспецифическую резистентность к действиям неблагоприятных факторов среды - гипоксии, ионизирующей радиации и др., а также оказывать терапевтическое действие при целом ряде патологических состояний. Положительные эффекты яда в значительной степени связанны с адаптогенными и антиоксидантными свойствами этого зоотоксина [1, 2]. Важно отметить, что ранее учеными медицинской школы Вашингтонского уни-
верситета успешно был инкапсулирован основной токсин из пчелиного яда - мелиттин и продемонстрировано его применение в качестве противораковой терапии у мышей [3]. Однако исследований противоопухолевых эффектов пчелиного яда, как комплексной многокомпонентной системы, составляющими которой являются ферменты (фосфолипа-за А2, гиалуронидаза), полипептиды (мелиттиин, апамин, МСЭ - пептид), биогенные амины, не проводилось.
Следует указать, что из-за высокой антигенной и аллергенной активности пчелиного яда его парентеральное применение ограничено в практической медицине. Данная проблема может быть решена получением комбинированных препаратов на основе пчелиного яда и хитозана (ХТЗ). Хитозан, как продукт деацетилирования полисахарида хитина, экранирует белковые компоненты яда, увеличивая при этом время жизни и действия комплексного препарата. Хитозан способен выполнять функции иммуномодуля-тора, носителя лекарственных средств, проникать в межклеточное вещество [4, 5]. Также ранее были показаны антиоксидантные свойства хитозана (снижение активности свободнорадикального окисления), в частности при повреждающем действии у-облучении [6].
Наночастицы золота, в интервале размеров от 3 до 20 нм, стабилизированные хитозаном, не повреждают
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
структуру компонентов клетки и оказывают антиоксидант-ное действие [7, 8, 9]. В наноструктурированных системах наночастицы золота выполняют транспортную функцию, хитозан служит стабилизатором системы, а пчелиный яд -биологически активным компонентом.
Цель работы: изучить на лабораторных животных с перевиваемой опухолью штамма РС-1 влияние наноструктурированных систем «хитозан-наночастицы золота», «хитозан-пчелиный яд-наночастицы золота» на морфологическую структуру опухолевой ткани и массу новообразования, активность свободнорадикальных процессов в опухоли и плазме крови, а также на функциональное состояние организма.
Материал и методы
В работе использовались водные растворы дисперсии хитозан-наночастицы золота, хитозан-пчелиный яд-наночастицы золота. Хитозан с молекулярной массой 1,3 х 105 и степенью деацетилирования 0,80-0,82 поставлен ЗАО «БИОПРОГРЕСС» ВНИТИБП (Московская область, Щелковский район). Наночастицы золота получали в растворе хитозана при УФ-индуцированном восстановлении золотохлористоводородной кислоты (HAuCl4). Средний размер наночастиц золота в биопрепарате составлял от 5 до 10 нм [10]. Пчелиный яд получен на пасеках Нижегородской области методом электростимуляции. DL50 яда составила 8-10 мг/кг.
Работа проведена на белых нелинейных крысах-самках 3-месячного возраста массой 150-200 г. Все процедуры на лабораторных животных осуществлялись в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986); Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1993); Правила лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от19.06.2003) и Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (МЗ № 755 от 12.03.1977).
Перевивание опухоли (0,5 мл 30% взвеси опухолевых клеток в растворе Хенкса) осуществляли подкожно в паховую область справа. Штамм альвеолярного рака печени РС-1 был получен из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Животные были разделены на 4 группы по 5 особей в каждой:1) интактные (относительная норма); 2) контроль (животные-опухоленосители без лечения); 3) животные-опухоленосители, которым вводили нанокомплекс «хитозан-наночастицы золота» («ХТЗ-Au») (доза ХТЗ 100 мг/кг; золото - 0,5 мг/кг); 4) живот-ные-опухоленосители, которым вводили нанокомплекс «хитозан-пчелиный яд-наночастицы золота» («ХТЗ-апитоксин-Au») (доза ХТЗ 100 мг/кг; пчелиный яд - 0,5 мг/кг; золото - 0,25 мг/кг). Препарат вводили спустя две недели после перевивки путем подкожных инъекций в нескольких миллиметрах от периферии опухоли, пятикратно, через день, в объеме 0,25 мл на животное.
На 28-е сутки после окончания курсового введения препаратов определяли массу опухоли путем ее взвешивания. Для изучения спонтанного (в контрольной группе животных) и терапевтического патоморфоза опухоли применялись морфологические методы с использованием стан-
дартных гистологических способов окраски гематоксилином и эозином. С помощью морфометрических методик замеряли площади (S%), занимаемые в плоскости гистологического среза паренхимой опухоли, ее стромы и кровеносных сосудов. Для оценки результатов исследования были выбраны показатели, отражающие наличие в опухолевой ткани вторичных спонтанных регрессивных изменений: некрозов, дистрофии, а также сохраненных клеточных элементов [11]. В крови определяли: количество лейкоцитов при помощи гематологического анализатора Abacus Junior 30 (Diatron, Австрия); индикаторные показатели -процентное содержание лимфоцитов, сегментоядерных нейтрофилов на мазках крови общепринятым методом с окраской мазков по Романовскому-Гимзе [12]. Дополнительно рассчитывали значение лейкоцитарного коэффициента (отношение процента лимфоцитов к относительному содержанию сегментоядерных нейтрофилов), значение которого снижается при стрессе и увеличивается при адаптационной реакции активации [13]. В плазме крови и в опухолевой ткани определяли: содержание одного из конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - оснований Шиффа (ОШ) методом И.А. Волчегорского [14].
Результаты исследований статистически обрабатывали с помощью программы BIOSTAT. Независимые выборки сравнивали с помощью однофакторного анализа, t-критерия Стьюдента и непараметрического критерия Крускала-Уоллиса. При расчете t-критерия Стьюдента применяли поправку Бонферрони, позволяющую установить ошибку первого рода, возникающую при сравнении более чем двух выборок данным методом [15].
Результаты и их обсуждение
По завершению эксперимента была определена масса опухоли. Было установлено, что в контрольной группе животных масса опухолевой ткани составила 66,04±7,56 г. В опытных группах, которым проведено введение препаратов «ХТЗ-Au» и «ХТЗ-апитоксин-Au», масса опухолей была статистически значимо ниже, чем в контроле (таблица 2).
Поверхность опухоли контрольных животных содержала небольшое количество сосудов, на разрезе опухоль была преимущественно бело-розового цвета, без явных очагов некроза. Микроскопическая картина ткани опухоли контрольных животных представлена на рис. 1. В отдельных зонах опухолевой паренхимы определялись трабеку-лоподобные структуры в виде неправильных тяжей и балок раковых клеток, что создавало картину альвеолярного гепатоцеллюлярного рака. В других участках неоплазмы опухолевые клетки формировали железистоподобные структуры, что говорит о тубулярном или ацинозном варианте злокачественной опухоли печени.
Паренхима состояла из округлых или неправильной формы различных по размерам и морфологии опухолевых клеток, ядра которых были круглыми, гиперхромны-ми, с крупными ядрышками, обладали заметным полиморфизмом, неодинаковой величиной и единичными митозами, наряду с присутствием круглых одно - или многоядерных «гигантских» клеток с гиперхромными ядрами, что свидетельствовало о выраженной дедиффе-ренцировке и катаплазии.
▲1
5щ
ТАБЛИЦА 1
Морфологические изменения в опухолях лабораторных животных на 28-е сутки после окончания введения нанокомплексов
Группы животных Сохраненные опухолевые клетки,% Дистрофии,% Некрозы,%
Контроль 62,15±3,35 5,27±0,37 31,64±3,55
«ХТЗ-Аи» 53,99±3,02 9,82±0,72* 35,13±3,23
«ХТЗ-апитоксин-Аи» 40,18±3,64*,** 16,38±1,60*,** 44,23±4,23*
Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0,05 по отношению к контрольным животным; ** - р<0,05 по отношению к животным-опухоленосителям, получавшим препарат «ХТЗ-Аи».
ТАБЛИЦА 2
Масса и морфологические изменения в опухолях штамма РС-1 лабораторных животных на 28-е сутки после окончания введения нанокомплексов
Группы животных Масса, г Клетки,% Сосуды, % Соединительная ткань, %
Контроль 66,04±7,56 84,62±1,71 1,10±0,21 14,42±1,59
«ХТЗ-Аи» 20,89±5,16* 88,20±1,25 0,95±0,26 10,73±1,15
«ХТЗ-апитоксин-Аи» 13,85±2,44* 88,30±1,44 0,75±0,25 10,03±1,12
Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0,05 по отношению к контрольным животным.
ТАБЛИЦА 3
Содержание оснований Шиффа в плазме крови и опухолевой ткани животных-опухоленосителей на 28-е сутки после окончания введения нанокомплексов
Группы животных ОШ (плазма), отн. ед. ОШ (опухолевая ткань) отн. ед.
Интактные 2,06±0,02 -
Контроль 4,38±0,67* 6,53±1,04
«ХТЗ-Аи» 2,17±0,03** 6,04±0,83
«ХТЗ-апитоксин-Аи» 7,46±0,27*,**,# 7,63±1,18
Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0,05 по отношению к интактным животным; ** - р<0,05 по отношению к контрольным животным; # - р<0,05 по отношению к животным-опухоленосителям, получавшим препарат «ХТЗ-Аи».
ТАБЛИЦА 4
Количество лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов крови животных-опухоленосителей и значения лейкоцитарного коэффициента на 28-е сутки после окончания введения нанокомплексов
ы н% й
28-е сутки Кол-во лейкоцитов х109/л Лимфоциты, % р, еы дл 2 ^ но ер 2 £ ее Сн Лейкоцитарн коэффициент
Интактные 12,45±1,87 67,20±1,03 9,17±0,57 7,4±1,03
Контроль 12,69±1,13 48,14±2,5 * 22,93±1,03* 2,18±0,41*
«ХТЗ-Аи» 11,21±1,92 55,04±5,89 11,14±3,26 ** 5,16±0,90 **
«ХТЗ- апитоксин-Аи» 11,11±1,45 61,78±4,4 ** 10,08±1,48 ** 6,36±0,87 **
Примечание: статистически значимые отличия: * - р<0,05 по отношению к интактным животным; ** - р<0,05 по отношению к контрольным животным.
Цитоплазма некоторых клеток, составляющих опухолевую паренхиму, содержала ацидофильную или базо-фильную зернистость, в других клетках она была гомогенна или вакуолизирована. В цитоплазме имело место накопление липоидов или гликогена, что характерно для светлоклеточного рака печени [16]. Границы и контуры отдельных опухолевых клеток не всегда были различимы, что могло свидетельствовать о формировании синцити-альных структур.
Строма опухоли была представлена соединительнотканными прослойками, отдельными волокнами, разво-локненными структурами с явлениями мукоидного набухания, фибриноидных превращений, миксоматоза, фокусов кровоизлияний. В отдельных участках опухоли фиксировалось огрубение стромы до зрелой волокнистой соединительной ткани, чаще в виде периваскуляр-ного фиброза. В этих зонах обнаруживались очаговые скопления круглых клеток. Кровоснабжение опухолевой ткани осуществлялось кровеносными сосудами, на уровне капилляров, имеющих строение синусоидов, т. е. эндотелий их прилежал непосредственно к раковым комплексам и отдельным клеткам (рис. 1).
В серии опытов с использованием наноструктуриро-ванного препарата «ХТЗ-Аи» на поверхности среза опухоли определялись фокусы некрозов и гнойного расплавления. В других зонах была видна плотная масса с прожилками соединительной ткани и кровеносными сосудами.
Микроскопическая картина ткани опухоли опытных животных, получавших препарат «ХТЗ-Аи», представлена на рис. 2а. Паренхима была в состоянии дезинтеграции раковых комплексов, а отдельные клетки характеризовались альтеративными изменениями по типу гиалиново-капельной дистрофии, а ядра - пикнотичны и иногда в состоянии кариорексиса. Сосудистый компонент изменялся: доминирующее число сосудов дилати-рованы, в просветах красные (эритроцитарные) тромбы, в ряде капилляров - явления плазматизации. Среди жизнеспособной опухолевой паренхимы встречались экстравазаты и зоны геморрагической инфильтрации.
В наружной оболочке опухоли встречались раковые комплексы и отдельные опухолевые клетки. Вся капсула была инфильтрирована сегментоядерными нейтрофи-лами, обнаруживались зоны мелкофокусных кровоизлияний. Внутренний соединительно-тканный остов опухоли был представлен отдельными пучками коллагено-вых волокон, расфрагментированных или истонченных с явлениями мукоидного и фибриноидного набухания. Морфометрические показатели гистологических срезов опухолей представлены в таблицах 1, 2.
В серии экспериментов с использованием препарата «ХТЗ-апитоксин-Аи» поверхность опухоли была с очагами некроза, гнойного воспаления. Ее гистологическая картина представлена на рис. 2б. Клетки опухоли в большинстве полей зрения были дискомплексированы. Тем не менее, половина раковых клеток была жизнеспособна, хотя в их цитоплазме обнаруживались вакуолизация или пылевидная зернистость. Оставшаяся часть опухолевых клеток находилась в состоянии некроза (видны ядерные изменения по типу кариопикноза, кариорексиса
▲1
вм
и кариолизиса) или грубых необратимых дистрофических изменений (баллонная дистрофия или крупная базофильная гранулярность в цитоплазме). Изменения стромального компонента опухоли отличались от описанных в контрольной серии опытов. Следовало отметить доминирование площадей, занимаемых лим-фогистиоцитарными инфильтратами, которые состояли из диффузно лежащих единичных круглых клеток.
В опухолях животных, которые получали препарат «ХТЗ-Аи», часть сохраненных опухолевых клеток находилась в состоянии дистрофии, частота встречаемости таких очагов статистически достоверно выше, чем в опухолях контрольных животных (таблица 1).
У животных-опухоленосителей, которым вводили «ХТЗ-апитоксин-Аи», были выявлены участки некроза, общая площадь которых была достоверно больше соответствующего показателя у животных контрольной группы. Также было показано, что процент дистрофичных клеток в данной группе был статистически значимо выше, а сохраненных опухолевых клеток меньше, чем во всех остальных группах (таблица 1).
Следует отметить, что гистологические исследования выявили тенденцию к снижению васкуляризации опухолевой ткани у животных опытных групп, причем эта тенденция была более выражена при применении препарата «ХТЗ-апитоксин- Аи» (таблица 2).
Проведенный анализ состояния процессов перекисно-го окисления липидов в опухолевой ткани и плазме крови позволил установить, что содержание конечных продуктов липопероксидации (ОШ) в плазме крови у животных, которым вводили нанокомплекс «ХТЗ-Аи», было статистически значимо ниже, чем у контроля. Это связано с активизацией антиоксидантной системы у этих групп благодаря антирадикальной активности наноча-стиц золота. В группе животных, получавших нанокомплекс «ХТЗ-апитоксин-Аи», содержание ОШ было достоверно выше (р<0,05), чем в остальных группах (таблица 3). Известно, что продуцентами активных форм кислорода как в плазме крови, так и ткани являются фагоциты (нейтрофилы, моноциты, макрофаги). Можно полагать, что наличие в наночастицах пчелиного яда, полипептидные компоненты которого проявляют антигенные свойства, индуцируют иммунный ответ организма, активируя фагоциты и, как следствие, продукцию свободных радикалов, которые необходимы для борьбы с опухолевыми клетками. Это допущение подтверждается меньшей массой опухолей в данной группе животных (таблица 1).
Значения индикаторных показателей (количество сег-ментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и лейкоцитарного коэффициента) у животных, получавших нано-комплексы, не имели статистически значимых отличий от животных интактной группы. У контрольных живот-ных-опухоленосителей эти показатели достоверно отличались от значений как интактных, так и животных, получавших препараты (таблица 4). Индикаторные показатели свидетельствуют, что животные контрольной группы находились в состоянии стресса, а животные, получавшие нанокомплексы, близки к состоянию относительной нормы. Представленные материалы еще
РИС. 1.
Гистологическая картина альвеолярного рака печени штамма РС-1. Контрольная группа. Окраска гематоксилином и эозином (ув.: об. х20, ок. х10).
РИС. 2.
Патогистологическая картина альвеолярного рака печени штамма РС-1. Окраска гематоксилином и эозином: а) группы животных, получавших «ХТЗ-Au» (ув.: об. х20, ок. х10); б) группы животных, получавших «ХТЗ-апитоксин-Au» (ув.: об. х40, ок. х10).
Al
SSM
раз подтверждают адаптогенные и антирадикальные эффекты наноструктурированных систем, которые были показаны для них при действии других экстремальных факторов, в частности ионизирующей радиации и гипоксии [1, 17].
Заключение
При применении наноструктурированных систем «ХТЗ-Au», «ХТЗ-апитоксин-Au» на животных с перевиваемой опухолью штамма РС-1 в опытных группах зафиксированы статистически значимые уменьшения массы опухолей относительно контрольных животных.
Гистологические исследования выявили, что применение системы «ХТЗ-апитоксин-Au» приводило к снижению васкуляризации опухолевой ткани, более высокому проценту дистрофичных клеток в данной группе и меньшему проценту сохраненных опухолевых клеток, чем в контрольной.
Повышенное содержание конечных продуктов липопе-роксидации (оснований Шиффа) в плазме крови и опухолевой ткани животных, прошедших курс терапии «ХТЗ-апитоксин-Au», свидетельствует о повышенной продукции фагоцитами активных форм кислорода и успешном разрушении ими опухолевых клеток.
Повышенное количество лимфоцитов и более низкое сегментоядерных нейтрофилов в крови опытных животных относительно контрольных, но не отличающихся от аналогичных значений интактных животных, указывает на адаптогенное действие исследуемых наноструктурированных систем, их способность переводить животных-опухо-леносителей из состояния стресса в состояние относительной нормы.
Финансирование исследования: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (госзадание № 4.1537.2014K).
ЛИТЕРАТУРА
1. ^ряшн Д.С., Ерофеева Е.Д., Длександрова О.И. Ддаптогенные свойства пчелиного яда при действии экстремальных факторов различной природы. Вестник HHry. 2007. № 3. С. 113-115.
Koryagin A.S., Erofeeva E.A., Aleksandrova O.I. Adaptogennye svoystva pchelinogo yada pri deystvii eksperimental'nykh faktorov razlichnoy prirody. Vestnik NNGU. 2007. № 3. S. 113-115.
2. ^ылов В.К Пчелиный яд. Свойства, получение, применение: научно-справочное издание. H. Hовгород: Изд-во HHry, 1995. 224 с.
Krylov V.N. Pcheliniy yad. Svoystva, poluchenie, primenenie: nauchno-spravochnoe izdanie. N. Novgorod: Izd-vo NNGU, 1995. 224 s.
3. Soman N.R., Baldwin S.L., Hu G. еt al. Schlesinger Molecularly targeted nanocarriers deliver the cytolytic peptide melittin specifically to tumor cells in mice, reducing tumor growth. Journal of Chinical Investigation. 2009. № 119 (9). Р. 2830-2842.
4. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение /под ред. K.r. Скрябина, Г.Д. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Hаука, 2002. 141 с.
Khitin i khitozan. Poluchenie, svoystva i primenenie /pod red. K.G. Skryabina, G.A. Vikhorevoy, V.P. Varlamova. M.: Nauka, 2002. 141 s.
5. Ravi Kumar M.N.V., Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C. et al. Chitosan Chemistry and Pharmaceutical Perspectives. Chem. Rev. 2004. № 104. Р. 6017-6084.
6. Корягин А.С., Ерофеева Е.А., Якимович Н.О. и др. Анализ антиоксидант-ных свойств хитозана и его олигомеров. Бюлл. экспер. биологии и медицины. 2006. Т. 142. № 10. С. 444-446.
Koryagin AS., Erofeeva E.A., Yakimovich N.O. i dr. Analiz antioksidantnykh svoystv khitozana i ego oligopolimerov. Byull. eksper. biologii i biomediciny. 2006. Т. 142. № 10. S. 444-446.
7. Хлебцов Б.Н. Плазменно-резонансные наночастицы для биомедицинских приложений: Автореф. дисс. ... док. физ.-мат. наук. Саратов, 2010. 48 с.
Khlebcov B.N. Plazmenno-rezonansnye nanochasticy dlya biomedicinskikh prilozheniy:Avtoref. diss.... dok. fiz.-mat. nauk. Saratov, 2010.48s.
8. Якимович Н.О., Ерофеева Е.А., Александрова Е.А. и др. Антиоксидантные свойства наночастиц золота в условиях нормы и действия ионизирующей радиации. Вестник ННГУ. 2006. № 1 (5). С. 60-68.
Yakimovich N.O., Erofeeva E.A., Aleksandrova E.A. i dr. antioksidantnye svoystva nanochastic zolota v usloviyakh normy i deystviya ioniziruyuschey radiacii. Vestnik NNGU. 2006. № 1 (5). S. 60-68.
9. Якимович Н.О. Синтез и свойства полимерных нанокомпозитов на основе метакрилатов и хитозана, содержащих наночастицы золота, и органо-неорганических композитов на основе поли (титаноксида): Автореф. дисс. ... канд. хим. наук. Н. Новгород, 2008. 28 с.
Yakimovich N.O. Sintez isvoystva polimernykh nanokompozitov na osnove metakrilatov i khitozana, soderzhaschikh nanochasticy zolota, i organo-neoganicheskikh kompozitov na osnove poli (titanoksida): Avtoref. diss. . kand. khim. nauk. N. Novgorod, 2008. 28 s.
10. Дымкан Л.А., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастицы в биологии и медицине: достижения последних лет и перспективы. Acta naturae. 2011. Т. 3. № 2 (9). С. 36-58.
Dymkan L.A., Khlebcov N.G. Zolotye nanochasticy v biologii i medicine: dostizheniya poslednikh let i perspektivy. Acta naturae. 2011. T. 3. № 2 (9). S. 3-58.
11. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.
Avtandilov G.G. Medicinskaya morfometriya. Rukovodstvo. M.: Medicina, 1990.384 s.
12. Козинец Г.И., Макаров В.И. Исследование системы крови в клинической практике. М.: Триада, 1998. 480 с.
Kozinec G.I., Makarov V.I. Issledovanie sistemy krovi v klinicheskoy praktike. M.: Triada, 1998.480 s.
13. Гаркави Л.Х. Активационная терапия. Р. н/Д.: Изд-во Ростовского университета, 2006. 256 с.
Garkavi L.Kh. Aktivacionnaya terapiya. R. n/D.: Izd-vo Rostovskogo universiteta, 2006. 256 s.
14.Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Сопоставление различных подходов к определению продуктов ПОЛ в гептан-изопропанольных экстрактах крови. Вопросы мед. химии. 1989. № 1. С. 127-131.
Volchegorskiy I.A., Nalimov A.G., Yarovinskiy B.G., Lifshic R.I. Sopostavlenie razlichnykh podkhodov k opredeleniyu produktov POL v geptan-izopropanol'nykh ekstraktakh krovi. Voprosy med. khimii. 1989. № 1. S. 127-131.
15. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
Glanc S. Mediko-biologicheskaya statistika. M.: Praktika, 1999.459 s.
16. Руководство по патологоанатомической диагностике опухолей человека / под ред. Н.А. Краевского, А.В. Смольянинова, Д.С. Саркисова; 3-е изд. М.: Медицина, 1982, С. 170-171.
Rukovodstvo po patologoanatomicheskoy diagnostike opukholey cheloveka / pod red. N.A. Kraevskogo, A.V. Smol'yaninova, D.S. Sarkisova. 3-e izd. M.: Medicina, 1982, S. 170-171.
17. Koryagin A.S., Mochalova A.E., Salomatina E. V. et al. Adaptogenic effects of chitosan-gold nanocomposites under simulated hypoxic conditions. Inorganic Materials Applied Research. 2013. № 4 (2). Р. 127-130. nri|
