Адаптогенные эффекты пчелиного яда к гипоксии при пероральном применении Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Физиология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2010, № 2 (2), с. 659-663

УДК 599: 539.1.047

АДАПТОГЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ПЧЕЛИНОГО ЯДА К ГИПОКСИИ ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ

© 2010 г. А.С. Корягин, А.Е. Мочалова, В.Н. Крылов, Л.А. Смирнова,

Е.В. Саломатина, А.А. Николаева

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского

smimova_la@mail. rn

Поступала в рсИакцаю 28.01.2010

В экспериментах на крысах изучены адаптогенные эффекты пчелиного яда в составе нанокомпозитов при пероральном введении. Показано, что курсовое введение экспериментальным животным пчелиного яда в дозе 0.5 мг/кг в составе нанокомпозитов (наночастицы золота-пчелиный яд-хитозан) вызывает возникновение адаптационной реакции устойчивой активации и снижение процессов свободнорадикального окисления в условиях нормы, а также повышение резистентности к гипоксии через неделю после окончания введения препаратов, о чем свидетельствуют индикаторные показатели системы крови.

Ключевые слова: пчелиный яд, хитозан, наночастицы, адаптогенные эффекты, гипоксия.

Введение

В подавляющем большинстве случаев при патологиях сердечно-сосудистой системы, лёгких, анемии, отравлениях изменяется либо доставка, либо утилизация кислорода. Классические химически синтезированные антигипок-санты зачастую обладают симптоматическим действием и имеют серьезные побочные эффекты. В решении указанной проблемы существенная роль отводится поиску натуральных адапто-генных средств.

Перспективным представляется использование зоо- и фитопрепаратов, в том числе и зоотоксинов. Среди последних наиболее распространенным и доступным является пчелиный яд. Пчелиный яд может одновременно воздействовать на многие регуляторные и исполнительные системы организма. Выявлено, что малые дозы пчелиного яда вызывают развитие неспецифической адаптационной реакции активации и оказывают радиозащитное действие при курсовом внутрибрюшинном введении [1]. Необходимо отметить, что исследований по изучению адаптогенных эффектов пчелиного яда к условиям действия других экологических неблагоприятных факторов, в частности вызывающих развитие гипоксии, практически не проводилось.

Однако высокая аллергенная и антигенная активность пчелиного яда ограничивает его инъекционное применение в практической медицине. В свете этого предпочтительным методом применения препаратов зоотоксинов явля-

ется пероральный. Поскольку яд пчелы имеет белково-пептидную природу и способен разрушаться протеазами пищеварительного тракта, его введение per' os в организм малоэффективно. Для решения проблемы защиты зоотоксина от разрушения протеазами и транспорта его через слизистую кишечника авторами были разработаны наносистемы (далее будем называть их нанопрепаратами), содержащие наночастицы золота и пчелиный яд, стабилизированные хи-тозаном.

Цель настоящей работы - исследование адаптогенной активности пчелиного яда в составе нанопрепарата в условиях нормы и гипоксии при пероральном применении.

Материалы и методы

В работе использовали хитозан со среднечисловой молекулярной массой 1.3x105 и степенью деацетилирования 80%, пчелиный яд -DL50 = 8-10 мг/кг. Средний размер наночастиц золота в нанопрепарате составлял 8-10 нм.

Работа выполнена на беспородных крысах-самцах массой 250-300 г, выращенных в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде и естественном чередовании суточной освещенности.

В первой серии экспериментов определяли тип адаптационной реакции при курсовом пе-роральном введении пчелиного яда в составе наночастиц золота, стабилизированных хитоза-ном в условиях нормы. Животные были разделены на 4 группы по 7 особей в каждой. В пер-

Таблица 1

Содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула в крови крыс через 7 суток после окончания перорального введения препаратов пчелиного яда в условиях нормы

Показатель Интактные Контроль (хитозан + Аи) Опыт (хитозан + Аи + + пчел. яд 0.5 мг/кг) Опыт (хитозан + Аи + + пчел.яд 1.0 мг/кг)

Лейкоциты, х 109 кл/л 13.48±1.69 14.16±1.29 10.96±0.44 13.32±2.01

Сегментоядерные нейтрофилы, % 18.34±0.80 22.20±1.51* 13.60±0.38*# 17.34±1.65#+

Лимфоциты, % 74.66±0.31 74.08±1.65 82.64±0.74*# 79.78±2.01*#

Лейкоцитарный коэффициент 4.09±0.17 3.42±0.33 6.11±0.23*# 4.85±0.61#+

Примечание: статистически значимые отличия: * - р < 0.05 по отношению к интактным; # - р < 0.05 по отношению к контролю, + -р < 0.05 по отношению к 1-ой опытной группе.

вую вошли интактные животные (условная норма), во вторую - крысы, которым вводили наночастицы золота, стабилизированные хито-заном (в дозе золото - 0.5 мг/кг, хитозан - 100 мг/кг), животные третьей и четвертой групп получали нанопрепараты, содержащие пчелиный яд в дозе 0.5 и 1.0 мг/кг соответственно. Препараты вводили при помощи зонда в объеме 1 мл на животное в течение 7 дней с периодичностью 1 раз в сутки. Кровь для анализа забирали из подъязычной вены на 1-е и 7-е сутки после введения препаратов. Определяли количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу [2], лейкоцитарный коэффициент (отношение процентного содержания лимфоцитов к процентному содержанию сегментоядерных нейтрофи-лов) [3]. Методом индуцированной биохеми-люминесценции в плазме крови определяли интенсивность свободнорадикального окисления [4] по показателю светосуммы S.

Во второй серии экспериментов исследовали возникновение резистентности животных к ги-побарической гипоксии при предварительном курсовом введении нанопрепаратов. Животные были разделены на 4 группы: первая группа -интактные животные, вторая - контроль на гипоксию (препаратов не получали), третья - получали препарат наночастиц золота с хитозаном, четвертая - наночастицы золота с хитозаном и пчелиным ядом в дозе 0.5 мг/кг. Условия введения нанопрепаратов аналогичны описанным для предыдущей серии. На 7-е сутки после введения препаратов животных 2-4 групп подвергали воздействию гипобарической гипоксии (условная высота 8 тыс. метров над уровнем моря) в течение 30 мин. Анализ крови проводили на следующий день после экспозиции в барокамере. В крови, кроме показателей предыдущей серии, определяли концентрацию гемоглобина [2] и активность лактатдегидрогеназы [5].

Результаты исследований статистически обрабатывали с помощью программы BIOSTAT. Независимые выборки сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Ньюмена-Кейлса.

Результаты и их обсуждение

Было исследовано действие двух доз пчелиного яда в составе нанопрепаратов: 0.5 и 1.0 мг/кг массы животного в условиях нормы. Анализ параметров крови (количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула, лейкоцитарный коэффициент) и интенсивности свободнорадикального окисления (значение светосуммы S) через сутки после окончания перорального введения нанопрепаратов не выявил формирования существенной реакции адаптации. Поэтому был увеличен временной интервал и проведено исследование тех же показателей через неделю после окончания введения нанопрепаратов, содержащих пчелиный яд.

Изучение показателей крови через 7 суток после окончания введения препарата в условиях нормы показало, что содержание лейкоцитов в данном эксперименте в исследуемых группах сохранялось на уровне интактных животных (табл. 1).

В контрольной группе наблюдалось статистически значимое увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов на 21%, а количество лейкоцитов при этом и значение лейкоцитарного коэффициента не отличались от уровня интактных крыс. Это свидетельствует об отсутствии явно выраженной ответной реакции на препарат, не содержащий пчелиный яд. Вероятно, у крыс контрольной группы формируется неспецифическая реакция тренировки. В обеих опытных группах количество лимфоцитов ста-

Таблица 2

Содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула в крови крыс при моделировании гипобарической гипоксии через неделю после окончания перорального введения нанопрепаратов,

содержащих пчелиный яд

Показатель Интактные Контроль (гипоксия) Контроль (гипоксия + + хитозан + Аи) Опыт (гипоксия + хитозан + Аи + пчел. яд 0.5 мг/кг)

Лейкоциты, х 109 кл/л 16.65±1.14 27.60±2.41 * 28.44±3.95* 28.44±1.71*

Сегментоядерные нейтрофилы, % 12.75±0.92 22.50±2.07* 16.17±1. 17 12.50±1.17#+

Лимфоциты, % 73.50±2.13 57.50±4.15* 64.70±2.97 69.30±3.11#

Лейкоцитарный коэффициент 6.01±0.68 2.56±0.21* 4.00±0.24* 5.80±0.69#+

Примечание: статистически значимые отличия: * -р < 0.05 по отношению к интактным; # - р < 0.05 по отношению к контролю (гипоксия); + -р < 0.05 по отношению к контролю (гипоксия + хитозан + Аи).

тистически значимо увеличивалось соответственно на 11% и 7%, а относительное содержание сегментоядерных нейтрофилов уменьшалось только в опытной группе при дозе пчелиного яда 0.5 мг/кг на 26% относительно ин-тактных животных (р < 0.05). Лейкоцитарный коэффициент статистически значимо повышался в данной опытной группе на 49% относительно исходного показателя (р < 0.05). Во второй опытной группе (1.0 мг/кг) количество сегментоядерных нейтрофилов оставалось на уровне интактных крыс, а также наблюдалась тенденция к увеличению лейкоцитарного коэффициента. Относительное содержание других форм лейкоцитов варьировалось незначительно.

Анализ активности процессов свободнорадикального окисления выявил, что через 7 суток после окончания введения препаратов не наблюдалось статистически значимого изменения показателей светосуммы S (имп/30сек) относительно интактных, в то время как в опытных группах наблюдалось статистически значимое снижение активности процессов (106.8 - ин-тактные, 102.1 - контроль, 91.6 и 91.4 - опыт при дозе пчелиного яда 0.5 и 1.0 мг/кг соответственно).

Таким образом, состояние устойчивой активации организма формируется через неделю после окончания перорального введения нанопрепаратов при дозе пчелиного яда 0.5 мг/кг. Доза 1.0 мг/кг вызывает менее физиологичную реакцию активации с признаками напряженности.

В следующей серии опытов исследовались адаптационные эффекты пчелиного яда в составе нанопрепаратов в условиях гипоксии спустя 7 суток после окончания введения препаратов. Во всех группах животных в крови одинаково повышалось количество лейкоцитов по сравнению с интактными животными (табл. 2), что

свидетельствует о реакции организма на гипок-сическое повреждение. Лейкоцитарная формула выявила лимфопению и сегментоядерный ней-трофилез, а также снижение значения лейкоцитарного коэффициента (р < 0.05) в обеих контрольных группах на гипоксию относительно интактных, что свидетельствует о стресс-реакции. В опытной группе количество лимфоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, лейкоцитарный коэффициент оставались на уровне ин-тактных животных. Это свидетельствует об отсутствии стресс-реакции в опытной группе животных и о формировании резистентности к гипоксии.

Обращает на себя внимание статистически значимое повышение гемоглобина в контрольных группах по сравнению с интактными животными, в то время как в опытной группе содержание гемоглобина было ниже (р < 0.05). Это дополнительно подтверждает резистентность к гипоксии животных, получавших пчелиный яд (рис. 1).

Существенному изменению при гипоксии подвергается активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в плазме крови. Активность ЛДГ в контрольной группе («гипоксия») увеличивалась на 48% (р < 0.05) (рис. 2). Нарушение метаболизма углеводов, а именно резкое его усиление по пути анаэробного гликолиза, помимо снижения количества синтезируемой АТФ, приводит к накоплению молочной кислоты. Снижение активности фермента ЛДГ при гипобарической гипоксии в контрольной «хитозан + золото» и опытной «хитозан + золото + пчелиный яд» группах свидетельствует о переключении метаболизма по пути аэробного окисления пирувата в условиях дефицита кислорода и подтверждает ранее выявленные адаптогенные эффекты хито-зана [6].

Рис. 1. Содержание гемоглобина (г/л) в периферической крови крыс при моделировании гипобарической гипоксии через 7 дней после окончания перорального введения нанопрепаратов, содержащих пчелиный яд. Статистически значимые отличия: * - р < 0.05 по отношению к интактным; # -р < 0.05 по отношению к группе «гипоксия»; + -р < 0.05 по отношению к контролю

Рис. 2. Активность ЛДГ (ммоль пирувата/мин • мкг белка) в плазме крыс через неделю после курсового перорального введения нанопрепаратов в условиях барометрической гипоксии.

Статистически значимые отличия: * - р < 0.05 по отношению к интактным; # -р < 0.05 по отношению к группе «гипоксия»

Таким образом, проведенные исследования показывают, что пчелиный яд в составе нанопрепарата (наночастицы золота-пчелинный яд-хитозан) не подвергается протеолитическому расщеплению ферментами желудочно-кишечного тракта, транспортируется через слизистую кишечника в кровь и приводит к формированию адаптационной реакции стойкой активации в условиях нормы и резистентности к гипоксии. Состояние резистентности наблюдается спустя неделю после окончания курсового введения препарата с оптимальной дозой зоотоксина 0.5 мг/кг. Это служит свидетельством перспективности создания препаратов биологически активных веществ белковой природы с использованием нанотехнологий для применения per ’os.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 08-02-97031-р_поволжье_а).

Список литературы

1. Корягин А.С., Крылов В.Н., Ерофеева Е.А. // Журн. эволюционной биохимии и физиолог. 2008. Т. 44. № 4. С. 424-428.

2. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золот-ницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с.

3. Шихлярова А.И., Гаркави Л.Х., Квакина Е.В., Кузьменко Т.С. Антистрессорные реакции и активационная терапия. Реакции активации как путь к оздоровлению через процессы самоорганизации. Екатеринбург: Филантроп, 2002. 196 с.

4. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободнорадикальных реакций в биологических субстратах // Межвуз. сб.: Биохимия и биофизика микроорганизмов. Горький, 1983. С. 179-183.

5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1971. С. 114-115.

6. Корягин А.С., Ерофеева Е.А., Якимович Н.О., Александрова Е.А. и др. // Бюлл. экспер. биологии и медицины. 2006. Т. 142. № 10. С. 444-446.

APITOXIN ADAPTOGENIC EFFECTS TO HYPOXIA AFTER PERORAL ADMINISTRATION

A.S. Koryagin, A.E. Mochalova, V.N. Krylov, L.A. Smirnova, E. V. Salomatina, A.A. Nikolaeva

Adaptogenic effects of apitoxin in nanocomposite formulation after peroral administration have been studied on rats. The peroral administration of apitoxin in nanocomposites (gold nanoparticles-apitoxin-chitosan) to experimental animals in a dose of 0.5 mg/kg brings about the adaptation reaction of sustained activation and the reduction of free-radical oxidation processes under normal conditions, as well as an increased resistance to hypoxia in a week after the end of preparation administration that has been confirmed by the blood system indices.

Keywords: bee venom, apitoxin, chitosan, nanoparticles, adaptogenic effects, hypoxia.