Определение типа неспецифического адаптационного ответа у экспериментальных животных при пероральном применении пчелиного яда в составе наночастиц золота Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Биология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2009, № 3, с. 114-11 7

УДК 599: 539.1.047

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИПА НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО АДАПТАЦИОННОГО ОТВЕТА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ ПЧЕЛИНОГО ЯДА В СОСТАВЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА

© 2009 г. А.С. Корягин 1, М.Н. Таламанова 1, ЕА. Александрова 2, А.Л. Маленев 3

1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского

2 Нижегородская государственная медицинская академия

3 Институт экологии Волжского бассейна РАН

[email protected]

Поступиис вредскцию 03,02,2009

В экспериментах на крысах изучены адаптогенные эффекты пчелиного яда в составе нанокомпозитов при пероральном введении. Показано, что курсовое введение животным наночастиц на основе золота, хитозана и пчелиного яда приводит к развитию неспецифической адаптационной реакции активации, диагностируемой по показателям периферической крови.

Ключевые сиовс: наночастицы золота, пчелиный яд, адаптационный ответ.

Введение

В настоящее время активно проводятся исследования адаптогенных свойств малых доз пчелиного яда. Ранее было показано, что зоотоксины пчелы при предварительном парентеральном (внутрибрюшном) введении животным в нетоксичных дозах, приводящих к развитию реакции активации, оказывают пролонгированный адаптогенный эффект к повреждающему действию ионизирующей радиации [1]. Реакция активации - одна из трех известных в настоящее время неспецифических адаптационных реакций организма. Она развивается в ответ на относительно средние по силе воздействия. В отличие от стресса изменения, возникающие при данной реакции, по своему характеру близки к вариантам физиологической нормы.

Парентеральное введение (в форме инъекций) делает практически невозможным применение пчелиного яда в клинической практике, так как его составляющие обладают высокой антигенной активностью, что может привести к возникновению ряда иммунологических реакций. Химическая природа яда пчелы исключает его пероральное применение (через рот) в связи с тем, что его белковые компоненты подвергаются протеолитическому действию пищеварительных ферментов желудка и тонкого кишечника, распадаясь в конечном итоге до свободных аминокислот.

Современные достижения в области нанотехнологий позволяют создавать наночастицы, способные, при пероральном введении в орга-

низм, преодолевать эпителиальный барьер кишечника и попадать в кровь [2]. Это является важным аспектом при создании и использовании препаратов на основе пчелиного яда в практической медицине.

В литературе имеются единичные работы по применению комплекса пчелиного яда и меда перорально [3]. Исследований адаптогенного действия пчелиного яда в составе наночастиц при введении через рот экспериментальным животным не проводилось.

Целью работы явилось установление типа адаптационного ответа у экспериментальных животных при пероральном введении различных доз пчелиного яда в составе наночастиц золота в условиях относительной нормы.

Материалы и методы

Работа была проведена на белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г, которые содержались на стандартном рационе вивария.

Нанокомпозиты, содержащие наночастицы золота, хитозан и пчелиный яд, были получены в соответствии с методикой на кафедре высокомолекулярных соединений химического факультета ННГУ [4]. В качестве стабилизатора наночастиц золота использовали продукт деаце-тилирования природного полисахарида хитина - хитозан. Средний размер наночастиц золота в нанокомпозите составлял 10-15 нм.

Животные были разделены на 4 группы по 5 особей в каждой. Первая группа - интактные животные, которые не подвергались каким-либо

воздействиям, и их показатели принимались за относительную норму. Животным 2-й группы вводили раствор наночастиц, содержащий золото и хитозан. Эта группа служит контролем. Вводимая доза золота и хитозана составила соответственно 0.5 мг/кг и 100 мг/кг массы животного. Животным 3-й и 4-й групп вводили наночастицы, содержащие золото, хитозан и пчелиный яд, в дозах 0.5 и 1 мг/кг соответственно.

Исследуемые препараты вводили в объеме 1 мл перорально (через рот с помощью зонда) в течение 7 дней с периодичностью 1 раз в сутки. Забор крови осуществляли из подъязычной вены на 1-е, 7-е и 14-е сутки после окончания курса введения и определяли показатели периферической крови: содержание гемоглобина, эритроцитов и общего количества лейкоцитов [5]. Расчет лейкоцитарной формулы производили общепринятым методом с окраской мазков по Романовскому - Гимзе. Нами были учтены рекомендации Л.Х. Г аркави по подсчету лейкоцитарной формулы при использовании ее в качестве сигнального показателя системных неспецифических реакций. При развитии стресс-реакции количество лимфоцитов снижается, а при реакции активации - увеличивается [6].

Дополнительно был рассчитан лейкоцитарный коэффициент, который показывает отношение процентного содержания лимфоцитов к процентному содержанию сегментоядерных нейтрофилов в лейкограмме. При развитии неспецифической реакции активации наблюдается увеличение данного показателя по отношению к интактным животным, показатели которых принимаются за относительную норму [6].

Результаты исследований обрабатывали статистически с использованием ^критерия Стью-дента с помощью программы Biostat [7].

Результаты и их обсуждение

Как показано в табл. 1, курсовое перораль-ное введение наночастиц на основе золота, хи-

тозана и пчелиного яда в дозах 0.5 и 1 мг/кг не приводило к изменениям в системе красной крови. Уровень эритроцитов в опытных группах существенно не отличался от интактной и контрольной групп. Изменения содержания гемоглобина в группах, которым вводился яд пчелы, практически не происходило.

Изменения, наблюдаемые в лейкоцитарной формуле на 1-е сутки в группе животных, которым вводили яд пчелы в дозе 0.5 мг/кг в составе наночастиц, сопровождались статистически значимым (р < 0.05) увеличением количества лимфоцитов по отношению к интактным животным. Количество сегментоядерных нейтро-филов было статистически значимо (р < 0.05) ниже уровня интактных и контрольных животных. Изменения общего количества лейкоцитов не происходило.

В группе животных, которым вводили яд пчелы в дозе 1.0 мг/кг, количество сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов не отличалось статистически от уровня интактных и контрольных животных.

При подсчете лейкоцитарного коэффициента было показано, что в контрольной группе и в группе животных, которой вводили яд пчелы в дозе 1.0 мг/кг в составе наночастиц, данный коэффициент варьировал на протяжении 14 суток и статистически не отличался от значений интактных животных (табл. 2).

В группе животных, которым вводили яд пчелы в дозе 0.5 мг/кг в составе наночастиц, наблюдалось статистически значимое (р < 0.05) увеличение лейкоцитарного коэффициента на 1-е сутки по отношению к интактным и контрольным животным. В течение двух недель значения данного коэффициента были статистически значимо (р < 0.05) выше по отношению к интактным животным.

В результате эксперимента показано, что многократное введение пчелиного яда в дозе 0.5 мг/кг в составе наночастиц золота приводило к

Тсблицс 1

Влияние курсового перорального введения зоотоксинов пчелы (7 дн.) на некоторые показатели периферической крови крыс в условиях относительной нормы на 1-е сутки

Показатели Г руппы животных

Интактные Контроль (хитозан + золото) Яд пчелы 0.5 мг/кг + золото + хитозан Яд пчелы 1.0 мг/кг + золото + хитозан

Гемоглобин, г/л 147.8 ± 14.8 147.4 ± 4.6 163.2 ± 6.95 165.6 ± 6.25

Эритроциты, 1012/л 4.79 ± 0.14 4.54 ± 0.18 5.3 ± 0.45 5.3 ± 0.31

Лейкоциты, 109/л 15.6 ±1.89 12.8 ± 0.49 12.9 ±0.46 14.9 ± 0.59

Сегментоядерные ней-трофилы, % 13.4 ±1.6 14.0 ± 0.9 10.7 ± 1.07 * + 15.6 ± 1.18

Лимфоциты, % 62.8 ± 2.8 73.9 ±2.4 79.4 ±0.9 * 67.1 ± 4.73

Примечание: * - р < 0.05 по отношению к интактным; + - р < 0.05 по отношению к контролю.

Теблuце 2

Влияние курсового введения яда пчелы, в составе наночастиц золота на лейкоцитарный коэффициент (у.е.)

Г руппы 1-е сутки 14-е сутки

Интактные 4.1 ± G.26 3.8 ± G.15

Контроль (хитозан + золото) 5.3 ± G.5G 4.8 ± G.6

Яд пчелы 0,5 мг/кг 7.6 ± G.56 * # 5.7 ± G.3 *

Яд пчелы 1,0 мг/кг 4.4 ± G.52 4.1 ± G.15

Прuмeченue: * - р < G.G5 по отношению к интактным животным, # - р < G.G5 по отношению к контрольным животным.

фор мированию у экспериментальных животных адаптационной реакции устойчивой активации, при которой организм, аналогично стадии резистентности стресса, приобретает устойчивость к самым разнообразным неблагоприятным воздействиям. Однако резистентность, в отличие от стресса, достигается не путём жертвы и повреждения, усиления процессов распада, а более физиологическими механизмами, не приводящими к наступлению фазы истощения, как продолжительный стресс [6, 8, 9]. Следует указать, что такая реакция является типичной при парентеральном (внутрибрюшинном) введении пчелиного яда в дозе 0.1 мг/кг [1]. Более высокая доза пчелиного яда при пероральном введении, вызывающая развитие реакции устойчивой активации, по всей видимости, связана с частичным действием на белковую структуру яда протеаз пищеварительного тракта.

Развитие реакции активации сопровождается появлением перекрестной резистентности к действию различных факторов (ионизирующей радиации, гипоксии и т.д.) [10]. Возникновение резистентности можно представить в виде цепи следующих физиологических реакций.

Возбудимость центральной нервной системы в устойчивую активацию остается умеренно повышенной [9]. При этом быстро возрастает активность ключевого фермента синтеза катехоламинов - тирозингидроксилазы - в мозговом слое надпочечников и в нервных центрах. Содержание глюкокортикоидов претерпевает колебания от нормы до величин, превышающих норму в 1.5 раза, что свидетельствует об увеличении активности стресс-реализующих систем организма — симпато-адреналовой и гипофизарно-надпочечниковой. Параллельно осуществляется активация центральных стресс-лими-тирующих систем (ГАМК-ергической, опиои-дергической, холинергической, серотонинерги-ческой и др.) и стресс-лимитирующих систем клеточного уровня — антиоксидантной, адено-зиновой, простагландиновой. Возрастает экспрессия генов, кодирующих структуру «белков

теплового шока», с которыми связывают развитие феномена адаптационной стабилизации структур (ФАСС) — повышения устойчивости клеточных и субклеточных структур (митохондрий, эндоплазматической сети, лизосом, макромолекул) самих по себе к действию повреждающих факторов, что обеспечивает в конечном итоге резистентность организма.

Полученные данные исследований указывают на возможность создания с помощью нанобиотехнологий адаптогенных препаратов, содержащих зоотоксины пчелы, с целью их применения в практической медицине.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (08-02-97031_р_поволжье_а).

Список литературы

1. Корягин А.С., Ерофеева Е.А. Исследование адаптогенных свойств животных ядов к действию повреждающих факторов (на примере ионизирующей радиации) // Поволжский экологический журнал. 2004. № 2. С. 52-58.

2. Хитозан per os // Под ред. Р.Н.А. Муццерелли. Н. Новгород: Изд-во «Вектор-ГиС», 2001. 372 с.

3. Ошевенский Л.В., Крылова Е.В., Фисен-ко Н.С. Исследование возможности всасывания ин-тактных пептидов пчелиного яда при скармливании крысам // Вестник ННГУ. Серия Биология. 2005. № 2 (10). С. 168-173.

4. Смирнова Л.А., Александров А.П., Якимо-вич Н.О. и др. УФ-индуцированное формирование наноразмерных частиц золота в полиметилметакри-латной матрице // Доклады Академии наук. 2005. Т. 400. № 6. С. 779-781.

5. Камышников В.С. Справочник по клиникобиохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т. 1. Мн.: Беларусь, 2000. 495 с.

6. Гаркави Л.Х. Об общей неспецифической адаптационной «реакции активации», способствующей борьбе организма с опухолью // Вопросы клинической онкологии и нейроэндокринных нарушений при злокачественных новообразованиях. Ростов н/Д, 1968. С. 341-348.

7. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.

8. Шихлярова А.И., Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С. Антистрессорные реакции и активационная терапия. Екатеринбург: Филантроп, 2002. 196 с.

9. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б. О критериях оценки неспецифической резистентности организма при

действии различных биологически активных факторов с позиции теории адаптационных реакций // Миллиметровые волны в биологии и медицине. 1995. № 6. С. 11- 21.

10. Корягин А.С., Ерофеева Е.А., Александрова Е.А. Адаптогенные свойства пчелиного яда при действии экстремальных факторов различной природы // Вестник ННГУ. 2007. № 3. С. 113-115.

TYPE IDENTIFICATION OF NONSPECIFIC ADAPTATION RESPONSE OF EXPERIMENTAL ANIMALS TO PER OS INTRODUCTION OF BEE VENOM IN THE COMPOSITION OF GOLD NANOPARTICLES

A. S. Koryagin, M.N. Talamanova, E.A. Aleksandrova, A.L. Malenev

Adaptogenic effects of bee venom introduced per os in the composition of nano-composites have been studied in experiments on rats. It has been shown that the course introduction into animals of nanoparticles on the basis of gold, chitosan and bee-venom leads to the development of nonspecific adaptation response that can be diagnosed by the indicators of peripheral blood.

Keywords: composition of gold nanoparticles, bee venom, adaptation response.