Влияние нанопрепаратов на целлюлолитическую активность микробных ферментных препаратов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

ТЕМА НОМЕРА

УДК 663.443

Влияние нанопрепаратов на целлюлолитическую активность микробных ферментных препаратов

Д. В. Карпенко,

д-р техн. наук, доцент;

И. Э. Позднякова,

магистрант

Московский государственный университет пищевых производств

Современная технология пива предусматривает широкий спектр приемов, интенсифицирующих протекание отдельных производственных стадий и(или) повышающих качество и безопасность конечного продукта. Один из таких приемов, широко применяемый на предприятиях различной мощности, — это использование ферментных препаратов, прежде всего, микробного происхождения. Наиболее частое применение находят ферментные препараты ами-лолитического, протеолитического типа действия и мультиэнзимные композиции на их основе. Однако, ужесточение требований к характеристикам пивного сусла, особенно на крупных предприятиях отрасли, стимулирует расширение перечня применяемых ферментных препаратов, в частности, обеспечивающих снижение вязкости жидких технологических сред, а также доступность крахмала зернового сырья для действия амилаз. Для этого предлагается использовать биокатализаторы цитолитическо-го, в частности, целлюлолитиче-ского типа действия микробного происхождения, так как аналогичные ферменты ячменного солода практически полностью инактиви-руются еще на стадии сушки зерна. Целлюлазы микробного происхождения находят применение и в других бродильных производствах, в частности, в спиртовом. Таким образом, важно, чтобы в процессе применения целевые ферменты цитолитических/целлюлолитиче-ских ферментных препаратов об-

ладали как можно более высокой активностью, обеспечивающей технологическую и экономическую эффективность их применения. Активность целлюлаз зависит как от параметров проведения стадии, на которой применяется соответствующий ферментный препарат, так и от состава технологической среды, в частности, присутствия в ней активаторов или ингибиторов. Если активаторы в ряде случаев могут быть внесены в среду целенаправленно, то содержание ингибиторов ферментов необходимо учитывать с целью подбора рациональной дозировки вносимого препарата и условий его применения.

На основании литературных данных [1], а также исследований, проведенных на кафедре «Технологии бродильных производств и виноделия» [2-6], к ингибиторам ферментов различного происхождения могут быть отнесены некоторые наночастицы. Вероятность их присутствия в технологических средах пищевых производств обусловлена широким применением нанопрепа-ратов и наноматериалов в различных отраслях промышленности в последнее десятилетие. Высочайшая проникающая способность наночастиц может приводить к их миграции в окружающую среду и последующей аккумуляции в растительном сырье и природных водах.

Таким образом, изучение влияния наночастиц на активность ферментных препаратов целлюло-литического типа действия — актуальное направление исследований. В качестве объекта такого влияния

22 ПИВО и НАПИТКИ 1•2019

600 -г

500 -

400 -

300 -

100 -

........- -.......

0,1 0,25 0,5 1 2 5

Содержание нанопрепарата ТО^ мг/см3 реакционной среды

Рис. 1. Влияние различных концентраций нанопрепарата диоксида титана на АФБ ферментного препарата «Целлолюкс-А»

§ 200

Технологические инновации в отрасли

0,1 0,25 0,5 1 2 5

Содержание препарата МУНТ, мг/см3 реакционной среды

Рис. 2. Влияние различных концентраций препарата многослойных углеродных нанотрубок на АФБ ферментного препарата «Целлолюкс-А»

использовали комплексный ферментный препарат грибного происхождения «Целлолюкс-А» производства ООО ПО «Сиббиофарм», РФ. Нанопрепаратами, воздействие которых на целлюлазы определяли в настоящей работе, стали оксиды никеля и меди, диоксид титана производства компании «Плазмотерм», РФ, а также многослойные углеродные нанотрубки (МУНТ) производства компании Dealtom, РФ. Цел-люлолитическую активность (С1) определяли, используя в качестве субстрата фильтровальную бумагу; концентрацию редуцирующих веществ (РВ) как продуктов ферментативного гидролиза определяли по методу с 3,5-динитросалициловой кислотой.

В 1-й серии экспериментов определяли влияние различных концентраций нанопрепарата ТЮ2, присутствующего в реакционной среде, диапазон варьирования концентраций указан на рис. 1. В каждом отдельном эксперименте серии формировали контрольный вариант, представлявший собой смесь буферного раствора, раствора ферментного препарата «Целлолюкс-А» с внесением полоски фильтровальной бумаги в качестве субстрата; опытный вариант, кроме того, содержал такое количество нанопре-парата, которое обеспечивало заданную для данного эксперимента концентрацию наночастиц диоксида титана в реакционной среде (от 0,1 до 5,0 мг/см3).

Полученные результаты противоречат исходному предположению о возможном негативном влиянии

наночастиц ТЮ2 на целлюлолити-ческую активность ферментного препарата. В рассмотренном диапазоне не выявлено ни одного значения концентрации нанопрепарата, оказывающего отрицательное воздействие на активность целлюлаз. Более того, наночастицы ТЮ2 оказывают выраженное положительное воздействие на активность по фильтровальной бумаге (АФБ) ферментного препарата, фактически выступая в качестве катализатора, а при содержании в реакционной среде равном 5,0 мг/см3, АФБ «Целлолюкс-А» в опытном варианте почти в 5,2 раза превосходила этот показатель в контрольном образце. Влияние более высоких концентраций нанопрепарата в реакционной среде решено было не определять, исходя из предположения, что в реальных производственных условиях такие содержания наночастиц в технологических средах маловероятны.

В следующей серии экспериментов, проведенных в условиях, аналогичных описанным выше, изучали влияние на АФБ ферментного препарата «Целлолюкс-А» препарата многослойных углеродных нанотрубок. Результаты представлены на рис. 2.

Установлено, что присутствие в реакционной среде нанотрубок оказывает сложное, нелинейное влияние на контролируемый показатель. Уже при содержании нанопрепарата в среде равном 0,1 мг/см3 в условиях экспериментов наблюдали примерно 20%-ное снижение активности целлюлаз микробного

происхождения, а при концентрации 0,5-1,0 мг/см3 такое снижение составило 50 % и более. Однако, при содержании нанопрепарата 2 мг/см3 зафиксировано возрастание АФБ на 50 % по сравнению с контролем. По мнению авторов, причиной этого может быть агломерация наноча-стиц, обусловленная их высоким содержанием в жидкой фазе, при этом образующиеся агломераты уже не представляют собой объекты наноразмера и, соответственно, утрачивают свойства, присущие наночастицам. Вследствие этого реальное содержание нанотрубок в реакционной среде существенно ниже предполагаемого, и в этой концентрации они проявляют активирующий эффект по отношению к целлюлазам ферментного препарата. Косвенным подтверждением такого предположения может быть снижение активирующего воздействия препарата МУНТ при увеличении его содержания до 5,0 мг/см3, вероятно, сопровождающееся возрастанием количества «свободных» нанотрубок, что приводит к проявлению их ингибирующего эффекта, наблюдавшегося в диапазоне концентраций 0,1-1,0 мг/см3.

На следующем этапе изучали зависимость активности микробных целлюлаз от присутствия в реакционной среде наночастиц оксида никеля (рис. 3). Условия проведения экспериментов были такими же, как в сериях, описанных ранее. Анализируя данные, можно заключить, что влияние нанопре-парата №0 на целлюлолитическую активность ферментного препара-

1•2019 ПИВО и НАПИТКИ 23

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ*

£ ш

I

0

1

<

I ш I-

0,1 0,25 0,5 1 2 5

Содержание нанопрепарата NiO, мг/см3 реакционной среды

Рис. 3. Влияние различных концентраций нанопрепарата оксида никеля на АФБ ферментного препарата «Целлолюкс-А»

0,05 0,1 0,125 0,25

Содержание нанопрепарата CuO, мг/см3 реакционной среды

Рис. 4. Влияние различных концентраций нанопрепарата оксида меди на АФБ ферментного препарата «Целлолюкс-А»

та аналогично влиянию наночастиц ТЮ2 — увеличение содержания нанопрепарата в реакционной среде приводит к возрастанию АФБ, хотя активирующий эффект наночастиц оксида никеля менее выражен. Так, при максимальной из рассмотренных концентраций (5,0 мг/см3) целлюлолитическая активность в присутствии наночастиц №0 превосходит аналогичный показатель контроля на 55 %, а нанопрепарат ТЮ2 обеспечивает несколько больший прирост АФБ (66 %) уже при содержании 0,5 мг/см3, при концентрации 5 мг/см3 наблюдается более чем 5-кратная активация цел-люлаз.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что влияние нанопре-паратов на активность целлюлаз существенным образом зависит как от природы наночастиц, так и от их содержания в реакционной среде. В этой связи было решено расширить спектр изучаемых нанопрепаратов и на следующем этапе определить влияние на целлюлолитическую активность нанопрепарата диоксида меди. Уже в ходе проведения экспериментов было установлено, что при превышении содержания нано-препарата СиО, равного 0,25 мг/см3, опытные образцы, предназначенные для фотометрирования, были мутными, что не позволило получить достоверных результатов определения АФБ. Фильтрование образцов через фильтровальную бумагу не решило проблемы, поэтому в серии экспериментов с наноча-стицами СиО диапазон концентра-

ций нанопрепарата в реакционных средах опытных вариантов был изменен и составил 0,05-0,25 мг/см3. Остальные условия экспериментов остались без изменений. Результаты всей серии экспериментов приведены на рис. 4.

В присутствии наночастиц СиО в условиях эксперимента наблюдали снижение активности микробных целлюлаз по мере увеличения содержания нанопрепарата: лишь при концентрации наночастиц СиО, равной 0,05 мг/см3 реакционной среды, АФБ ферментного препарата не изменилась по сравнению с контролем, тогда как при наибольшей из рассмотренных концентраций на-нопрепарата (0,25 мг/см3) значение контролируемого показателя снизилось по сравнению с контрольным почти на 40 %.

Сопоставляя результаты всех серий экспериментов, можно заключить, что присутствие наночастиц в среде гидролиза субстрата цел-люлазами ферментного препарата «Целлолюкс-А» существенно влияет на активность этих биокатализаторов. Интенсивность и направление такого влияния существенным образом зависят как от типа наночастиц, так и от их концентрации в реакционной среде. При этом в целом ряде случаев наночастицы выступали в качестве катализаторов ферментативного гидролиза, что обеспечивало значительное возрастание АФБ ферментного препарата по сравнению с контрольным вариантом. Наибольший положительный эффект наблюдали в присутствии

наночастиц ТЮ2 в концентрации 5 мг/см3 реакционной среды. Однако, были выявлены типы наноча-стиц, присутствие которых в некоторых концентрациях приводило к ингибированию целлюлолитической активности. Наиболее значимое снижение АФБ было зафиксировано в присутствии многослойных нано-трубок (1,0 мг/см3) и наночастиц оксида меди (0,25 мг/см3), которое составило 58 и 40 % соответственно.

В целом, можно сделать вывод, что потенциальное присутствие на-ночастиц в технологических средах пивоварения необходимо учитывать, так как оно способно повлиять на результаты протекания, как минимум, процессов ферментативного гидролиза полимеров зернового сырья, замедляя или ускоряя их. Кроме того, исследования в обсуждаемой области следует продолжить, оценив роль ряда других факторов, определяющих влияние нанопрепаратов на активность ферментов микробного происхождения, использовать в качестве объекта воздействия наночастиц другие ферментные препараты аналогичного типа действия, а также определить зависимость от присутствия нанопрепаратов действия целлюлаз в условиях, приближенных к производственным, в частности, в процессе приготовления затора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Wijnhoven, S. W. P. Nano-silver — a review of available data and knowledge gaps in human and environmental risk assess-

24 ПИВО и НАПИТКИ 1•2019

ТГЕХНОЛОГ

1ИИв ОТРАСЛИ

ment / S. W. P. Wijnhoven [et al.]// Nano-toxicology. - 2009. - Vol. 3 - № 2. -P. 109-138.

2. Карпенко, Д.В. Влияние наноцинка на активность протеолитических ферментов / Д. В. Карпенко [и др.] // Пиво и напитки. - 2015. - № 5. - С. 16-19.

3. Карпенко, Д.В. Влияние нанопрепаратов на активность амилаз / Д. В. Карпенко, С. М. Дроздов, А. А. Евсеева // Пиво и напитки. - 2016. - № 5. - С. 28-31.

4. Карпенко, Д.В. Влияние нанопрепаратов на активность протеаз / Д. В. Карпенко, В. В. Житков, С. А. Карязин // Пиво и напитки. - 2016. - № 4. - С. 46-49.

5. Карпенко, Д. В. Влияние нанопрепара-тов на активность протеаз светлого

ячменного солода / Д. В. Карпенко [и др.] // Пиво и напитки. — 2017. — № 4. — С. 14-17.

6. Карпенко, Д. В. Влияние нанопрепаратов на активность амилаз светлого ячменного солода / Д. В. Карпенко, В. О. Кашанков, М. В. Савина // Пиво и напитки. — 2017. — № 6. — С. 18-21.

REFERENCES

1. Wijnhoven SWP, [et al.]. Nano-silver — a review of available data and knowledge gaps in human and environmental risk assessment. Nanotoxicology. 2009; 3 (2): 109-138.

2. Karpenko DV, Vartanova UV, Borisova NO, [et al.]. Vlijanie nanocinka na aktivnost'

proteoliticheskih fermentov. Pivo i napit-ki. 2015; 5: 16-19. (In Russ.)

3. Karpenko DV, Drozdov SM, Evseeva AA. Vlijanie nanopreparatov na aktivnost' amilaz. Pivo i napitki. 2016; 5: 28-31. (In Russ.)

4. Karpenko DV, Zhitkov VV, Karjazin SA. Vlijanie nanopreparatov na aktivnost' proteaz. Pivo i napitki. 2016; 4: 46-49. (In Russ.)

5. Karpenko DV, Zhitkov VV, Kanaev SA, [et al.]. Vlijanie nanopreparatov na aktivnost' proteaz svetlogo jachmennogo soloda. Pivo i napitki. 2017; 4: 14-17. (In Russ.)

6. Karpenko DV, Kashankov VO, Savina MV. Vlijanie nanopreparatov na aktivnost' amilaz svetlogo jachmennogo soloda. Pivo i napitki. 2017; 6: 18-21. (In Russ.) &

Î Ш

2 0

1

<

2 ш b

Влияние нанопрепаратов на целлюлолитическую активность микробных ферментных препаратов

Ключевые слова

влияние нанопрепаратов на активность целлюлаз;

нанопрепарат диоксида титана; нанопрепараты оксидов меди и никеля;

препарат многослойных углеродных нанотрубок.

Реферат

В статье приведены результаты исследований влияния нескольких типов наночастиц (оксидов никеля и меди, диоксида титана, многослойных углеродных нанотрубок), присутствующих в реакционной среде, на активность целлюлаз ферментного препарата микробного происхождения «Целлолюкс-А». Эффект присутствия наночастиц оценивали по изменению целлюлолитической активности (С^ по сравнению с контролем, используя в качестве субстрата фильтровальную бумагу. Диапазон варьирования концентраций наночастиц в реакционной среде зависел от типа нанопрепарата. Установлено, что активность целлюлаз микробного происхождения существенно зависит как от типа наночастиц, так и от их концентрации в реакционной среде. Определено, что во всем рассмотренном диапазоне концентраций (0,1-5,0 мг/см3) диоксид титана оказывает положительное воздействие на активность целлюлаз по фильтровальной бумаге, вплоть до более чем 5-кратной активации при максимальном из использованных содержании. В присутствии многослойных углеродных нанотрубок целлюлолитическая активность менялась разнонаправленно, снижаясь при содержании наночастиц 0,1-1,0 мг/см3 и повышаясь при 2,0 и 5,0 мг/см3. Нанопрепарат N10 проявил в условиях эксперимента только положительное влияние на целлюлазы микробного ферментного препарата, наибольший эффект обеспечило присутствие в реакционной среде наночастиц в концентрации 5,0 мг/см3 - более 50 % по сравнению с контролем. Нанопрепарат оксида меди, напротив, оказывал ингибирующее воздействие, усиливавшееся по мере возрастания содержания наночастиц. На основании экспериментальных данных был сделан вывод о целесообразности продолжения исследований, в частности, определения зависимости целлюлолитической активности от присутствия наночастиц в условиях, приближенных к производственным.

Авторы

Карпенко Дмитрий Валерьевич, д-р техн. наук, доцент; Позднякова Ирина Эдуардовна, магистрант Московский государственный университет пищевых производств, 125080, Россия, г. Москва, Волоколамское ш., 11, DoKa.65@mail.ru, maderama@rambler.ru

Effect of Nanopreparations on the Cellulolytic Activity of Microbial Enzyme Preparations

Key words

influence of nanopreparations on the activity of ceLLuLases; nanopreparation of titanium dioxide; nanopreparations of copper and nickel oxides; preparation of muLtiLayered carbon nanotubes.

Abstract

The articLe presents the resuLts of studies of the influence of severaL types of nanoparticLes (nickeL and copper oxides, titanium dioxide, muLtiLayered carbon nanotubes) present in the reaction medium on the activity of ceLLuLases of the enzyme preparation of microbiaL origin «CeLLoLux-A». The effect of the presence of nanoparticLes was evaLuated by the change in ceLLuLoLytic activity (CJ compared to the controL, using fiLter paper as the substrate. The range of variation of the nanoparticLes concentrations in the reaction medium depended on the type of nanopreparation. It was found that the activity of ceLLuLases of microbiaL origin essentiaLLy depends on the type of nanoparticLes and their concentration in the reaction medium, both. It was determined that at aLL considered concentrations (0.1-5.0 mg/cm3) titanium dioxide has a positive effect on the activity of ceLLuLases on fiLter paper, up to more than fivefoLd activation at the maximum of the used contents. In the presence of muLtiLayered carbon nanotubes, ceLLuLoLytic activity varied in different directions, decreasing at the content of nanoparticLes 0.1-1.0 mg/cm3 and increasing at 2.0 and 5.0 mg/cm3. Nanopreparation of NiO under the experimentaL conditions showed onLy positive effect on the ceLLuLase of the microbiaL enzyme preparation, the greatest effect was achieved by the presence in the reaction medium of nanoparticLes at a concentration of 5.0 mg/cm3 - more than 50 % in comparison with the controL. Nanopreparation of copper oxide, on the contrary, had an inhibitory effect, which increased with increasing of nanoparticLes content. On the basis of experimentaL data, a concLusion was made about the advisabiLity of continuing research, in particuLar, determination of the dependence of ceLLuLoLytic activity on the presence of nanoparticLes under conditions, cLose to the industriaL ones.

Authors

Karpenko Dmitrij Valer'evich, Doctor of Technical Science, Associate Professor; Pozdnjakova Irina Jeduardovna, Graduate Student Moscow State University of Food Productions, 11 Volokolamskoe highway, Moscow, 125080, Russia, DoKa.65@mail.ru, maderama@rambler.ru

1•2019 ПИВО и НАПИТКИ 25